Aplicação de formononetina na colonização e esporulação de fungos micorrízicos em braquiária

Formononetin application on colonization and sporulation of arbuscular mycorrhizal fungi in Brachiaria

MICROBIOLOGIA

Aplicação de formononetina na colonização e esporulação de fungos micorrízicos em braquiária

Formononetin application on colonization and sporulation of arbuscular mycorrhizal fungi in Brachiaria

Cândido Barreto de Novais; José Oswaldo Siqueira

Universidade Federal de Lavras, Departamento de Ciências do Solo, Caixa Postal 37, CEP 37200-000 Lavras, MG. E-mail: [e-mail], [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de aplicações de Mycoform na colonização micorrízica e esporulação de 13 isolados de fungos micorrízicos arbusculares em Brachiaria decumbens. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, em solo esterilizado, com delineamento experimental inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 3x13, com cinco repetições. O produto foi aplicado no plantio e foi ou não aplicado uma segunda vez 60 dias depois, na quantidade de 2 mg kg^-1 de solo. Aos 150 dias de crescimento das plantas, foram coletadas amostras de raízes e de solo rizosférico, para a avaliação de colonização radicular e densidade de esporos. Houve estímulo do Mycoform nos parâmetros avaliados, efeito que variou com os isolados estudados. Foi observado efeito significativo da aplicação do Mycoform na colonização das raízes pelos isolados Glomus clarum DCS 09 e DCS 10, Paraglomus occultum DCS 06 e Acaulospora delicata DCS 02 e na esporulação dos isolados G. clarum DCS 09 e DCS 10, P. occultum DCS 06 e DCS 31, Glomus etunicatum DCS 12, A. delicata DCS 30 e Kuklospora colombiana DCS 03. O incremento na esporulação atingiu 89% e, na colonização, 60%, o que confirma os benefícios da formononetina na colonização e na esporulação dos fungos micorrízicos arbusculares.

Termos para indexação:Brachiaria decumbens, estimulante de micorriza, multiplicação de FMAs, Mycoform, simbiose radicular.

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the effects of Mycoform on both sporulation and colonization of 13 arbuscular mycorrhiza fungi (AMF) isolates in Brachiaria decumbens. The experiment was carried out in greenhouse conditions with sterile soil, in a completely randomized design with 3x13 factorial treatments and five repetitions. The product was applied once at planting and was or was not applied a second time 60 days afterwards, at an amount of 2 mg kg^-1 of soil. Plants were allowed to grow for 150 days, when root and rhizospheric soil samples were collected to evaluate the percentage of colonized root segments and the spore density. Mycoform effects were different among the fungal isolates. It had significant effect on colonization for the isolates Glomus clarum DCS 09 and DCS 10, Paraglomus occultum DCS 06 and Acaulospora delicata DCS 02, and on spore density for the isolates G. clarum DCS 09 and DCS 10, P. occultum DCS 06 and DCS 31, Glomus etunicatum DCS 12, A. delicata DCS 30 and Kuklospora colombiana DCS 03. Maximum increases due to Mycoform were 60% for colonization and 89% for spore density. These results confirm formononetin effects on AMF colonization and on AMF sporulation.

Index terms:Brachiaria decumbens, mycorrhizal stimulate, AMF multiplication, Mycoform, root symbiosis.

Introdução

A produção agrícola sustentável está associada ao desenvolvimento de tecnologias que minimizem os impactos ambientais e que poupem insumos não renováveis, como os fertilizantes a base de fósforo. Nesse sentido, há grande interesse em estudos sobre a microbiota do solo, que apresenta papel fundamental na manutenção da fertilidade dos solos agrícolas e contribui para a sua sustentabilidade. Entre os componentes da microbiota do solo, merecem destaque aqueles que formam associações mutualistas com as raízes, como os glomeromicetos, que desempenham funções significativas para o crescimento e desenvolvimento das plantas (Parniske, 2008). Esses fungos formam simbiose denominada micorriza arbuscular com mais de 80% das espécies vegetais, o que os torna componentes essenciais para a funcionalidade e manutenção dos ecossistemas naturais e manejados (Fitter, 2005; Moreira & Siqueira, 2006).

Apesar do grande volume de estudos sobre os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e sua simbiose, o desenvolvimento tecnológico para uso comercial desses simbiontes tem sido bastante limitado, por serem eles biotróficos obrigatórios. O atual nível de conhecimento técnico possibilita três estratégias principais para explorar esses fungos: inoculação com espécies fúngicas selecionadas; manejo das populações nativas (Souza et al., 1999); aplicação de produtos capazes de estimular e acelerar a colonização das raízes por fungos indígenas (Siqueira et al., 2002). Esta última estratégia apresenta grande potencial de aplicação na agricultura extensiva e pode ser eficaz também para a produção massal de esporos por indústrias de inoculantes. Flavonoides em geral podem estimular a germinação de esporos (Baptista & Siqueira, 1994), a colonização (Nair et al., 1991; Siqueira et al., 1991a) e o crescimento e produção vegetal (Silva-Júnior & Siqueira, 1997, 1998; Davies Junior et al., 2005a, 2005b), mas nada se conhece sobre o efeito dessas substâncias na esporulação.

Como os FMAs são organismos benéficos para os vegetais e, portanto, de grande interesse agronômico, devem ser produzidos em larga escala, a fim de possibilitar a sua aplicação e a consequente redução dos insumos agrícolas (Bagyaraj & Reddy, 2005). No Brasil, não existe nenhum registro de inoculante para FMAs, o que torna o campo de pesquisa para produção e comercialização de inóculos bastante promissor. O inóculo de FMAs é produzido apenas em pequena escala, por universidades e institutos de pesquisa. A produção de inoculantes micorrízicos normalmente utiliza a multiplicação de FMAs em vasos com os mais variados tipos de plantas hospedeiras. As gramíneas são as mais utilizadas, e são cultivadas em substratos ou misturas de substratos - areia, solo, vermiculita, turfa, entre outros - (Gianinazzi & Vosátka, 2004). Outros sistemas de produção de inoculante utilizados são o aeropônico (Mohammad et al., 2000) e o hidropônico, que permitem a produção de raízes colonizadas e de esporos. Técnicas mais recentes têm possibilitado a produção de inóculo a partir de raízes transformadas para a obtenção de cultura monospórica de FMA in vitro (Schubert & Lubraco, 2000; Declerck et al., 2005). No entanto, mesmo com várias pesquisas no campo de produção de inóculo de FMAs, não se consegue propagar o fungo axenicamente (Douds Junior et al., 2006). Mesmo as espécies de fácil multiplicação muitas vezes apresentam esporulação reduzida, o que dificulta a obtenção de inoculante para estudos ou aplicação (Powell & Bagyaraj, 1984). Por isso, procedimentos capazes de estimular a esporulação são de grande interesse.

Embora os mecanismos que regulam a esporulação dos FMAs não sejam conhecidos, existem evidências da ocorrência de resposta positiva ou negativa da espécie de planta hospedeira com diferentes FMAs, o que faz com que alguns produzam grande número de esporos e outros mal se multipliquem (Bever, 2002). Além disso, é necessário que ocorra uma colonização mínima para que o fungo possa completar seu ciclo de vida e esporular. Assim, espera-se que substâncias capazes de estimular a colonização micorrízica, como o isoflavonoide formononetina (Nair et al., 1991; Siqueira et al., 1991a), possam também estimular a produção de esporos e, desse modo, facilitar a aplicação dos FMAs na agricultura. Apesar de vários trabalhos já terem avaliado os efeitos da formononetina na colonização e crescimento vegetal (Silva-Júnior & Siqueira, 1997, 1998; Davies Junior etal., 2005a, 2005b), o efeito dessas substâncias na esporulação de diferentes espécies de FMAs ainda não foi devidamente avaliado.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de aplicações de Mycoform, um produto comercial a base do isoflavonoide formononetina (7-hidroxi, 4'-metoxi isoflavona), na colonização micorrízica e na esporulação de 13 isolados de FMA em Brachiaria decumbens.

Material e Métodos

O experimento foi realizado em casa de vegetação no Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras, durante 150 dias. O substrato empregado foi uma mistura preparada com um Latossolo Vermelho distrófico - coletado em área sob fragmento de mata nativa no campus da Ufla, na camada superficial (0-20 cm) - e areia lavada, na proporção de 2:1 (v/v). Antes da mistura, o solo foi incubado com calcário dolomítico (PRNT 100%), para elevar a saturação por bases para 60%. Em seguida, foram aplicados 50 mg de fosfato de rocha por quilograma de solo. O substrato foi tratado com brometo de metila (98% de brometo de metila e 2% de cloropicrina) na dosagem de 393 cm³ m^-3, para eliminar os propágulos de FMAs nativos. Análises realizadas em amostras do substrato após a correção e adubação apresentaram as seguintes características químicas: pH (água) 5,7; Ca²⁺, 3,4 cmol_c dm^-3; Mg²⁺, 1,0 cmol_c dm^-3; Al³⁺, 0,0 cmol_c dm^-3; H⁺+Al³⁺, 5,6 cmol_c dm^-3; P, 7,8 mg dm^-3 (Mehlich 1); K, 12 mg dm^-3 (Mehlich 1); V, 44,2% e MO, 4,8 dag kg^-1.

Após o preparo, o substrato foi distribuído em vasos de 0,5 dm³. Cada vaso recebeu 40 mL de uma solução de Mycoform - formulação mais solúvel da formononetina, desenvolvida pela PHC, Inc., que contém 83% de fomononetina ativa (PHC, Inc., Pittsburgh, EUA) - previamente preparada pela diluição de 200 mg de Mycoform em 8 L de água ligeiramente aquecida (máximo de 40ºC), o que resultou no fornecimento de 2 mg de Mycoform por quilograma de solo. A planta hospedeira utilizada foi Brachiaria decumbens Stapf. As sementes de B. decumbens foram escarificadas por meio de imersão em ácido sulfúrico concentrado comercial por 3 min e lavagem em água corrente para eliminar todo o ácido. Em seguida, foram germinadas em vermiculita estéril.As plântulas foram transplantadas para os vasos de cultivo no momento da implantação do experimento. Foram plantadas quatro plântulas por vaso. A inoculação foi realizada nas raízes no ato da transferência das plântulas, pela aplicação de uma suspensão de esporos, calibrada de modo a fornecer aproximadamente 200 esporos por vaso.

Os tratamentos consistiram da aplicação de 2 mg kg^-1 de solo de Mycoform no ato do transplantio (Myc 1) e 60 dias depois (Myc 2) e um controle (Myc 0), e de 13 isolados de FMAs disponíveis na coleção da Universidade Federal de Lavras (Tabela 1). O experimento foi disposto em delineamento experimental inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 3x13, com cinco repetições. Após 150 dias de crescimento, as plantas foram retiradas dos vasos, e as raízes foram separadas. Após lavagem, foi retirado aproximadamente 1 g de raízes frescas de cada planta para coloração (Phillips & Hayman, 1970) e posterior avaliação da percentagem de colonização (Giovannetti & Mosse, 1980). Em seguida, o substrato foi seco à sombra e homogeneizado, embalado em saco de plástico e armazenado em câmara fria a 4ºC, para posterior extração (25 mL de solo) e contagem dos esporos em microscópio estereoscópico. Os dados foram submetidos a análise de correlação de Pearson, análise de variância e teste de média (Scott-Knott) pelo SISVAR (Ferreira, 2006).

Resultados e Discussão

Foram observados efeitos significativos (p<0,05) da aplicação do Mycoform na colonização e na esporulação dos FMAs (Tabela 2), e esses efeitos variaram de acordo com os isolados testados. Na ausência do Mycoform, as plantas com os isolados P. occultum DCS 24 e K. colombiana DCS 03 foram as que atingiram as maiores percentagens de colonização e não responderam à aplicação do produto. Acombinação desses isolados com a planta apresentou elevada compatibilidade, e não houve potencial para o estímulo adicional à colonização provocado pelo princípio ativo do Mycoform. De acordo com Siqueira et al. (1991a), o efeito do isoflavonoide formononetina é desprezível em condições que maximizam a colonização. Por outro lado, o isolado P. occultum DCS 06, que apresentou baixa colonização na ausência do produto, respondeu positivamente à sua aplicação com um incremento de 60% na colonização. O Mycoform também teve efeito significativo na colonização das plantas pelos fungos A. delicata DCS 02, G. clarum DCS 09 e G. clarum DCS 10, porém com incremento menor, de 25 a 36%, em relação ao controle. O efeito significativo do Mycoform na colonização foi, portanto, restrito a apenas quatro dos isolados fúngicos estudados. Silva-Júnior & Siqueira (1998) verificaram que a aplicação de formononetina aumenta a micorrização da soja com Acaulospora morrowiae, G. clarum DCS 10, G. etunicatum e Fuscutata heterogama. Destes, apenas o isolado G. clarum DCS 10 respondeu positivamente à aplicação desse isoflavonoide, com um incremento médio de 36% na colonização de B. decumbens.

O número de esporos extraídos do solo também diferiu entre os isolados e tratamentos. Os isolados G. clarum DCS 09 e DCS 10 apresentaram as maiores esporulações, enquanto os isolados F. heterogama DCS 19, G. etunicatum DCS 12 e A. morrowiae DCS 23 foram os que menos esporularam, independentemente da presença de Mycoform. Foi observado efeito positivo do Mycoform em sete isolados: K. colombiana DCS 03, P. occultum DCS 06, G. clarum DCS 09, G. clarum DCS 10, G. etunicatum DCS 12, A. delicata DCS 30 e P. occultum DCS 31 (Tabela 3). O isolado P. occultum DCS 31 respondeu somente com a segunda aplicação, com densidade de esporos 38% superior ao controle. Glomus clarum DCS 10, G. etunicatum DCS 12 e P. occultum DCS 06 responderam à primeira aplicação de Mycoform e não se beneficiaram da aplicação adicional do produto. O isolado K. colombiana DCS 03, embora não tenha apresentado resposta à aplicação do produto em termos de colonização, mostrou elevada resposta na densidade de esporos (incremento de 89%), o que sugere a existência de mecanismo distinto da formononetina na colonização e esporulação.

Os graus de colonização e esporulação variaram entre os isolados geográficos de mesma espécie, conforme pode ser observado para P. occultum, em que apenas os isolados DCS 06 e DCS 31 responderam ao Mycoform para colonização e esporulação. Fato semelhante foi observado entre os isolados de G. etunicatum, nos quais a primeira aplicação foi suficiente para promover um aumento de 86% no número de esporos do isolado DCS 12, enquanto no DCS 13 nem mesmo duas aplicações foram suficientes para estimular a esporulação em B. decumbens. Deve-se ressaltar que G. etunicatum DCS 13 apresentou elevada esporulação mesmo na ausência do Mycoform, e essa é uma possível explicação para a ausência de resposta à aplicação do produto nessa espécie. O efeito estimulante da formononetina parece se limitar a condições de baixo potencial de inóculo inicial (Siqueira et al., 1991a). De maneira geral, o comportamento diferenciado de isolados específicos de FMAs tem sido encontrado onde a formononetina estimula algumas espécies de FMAs (Nair et al., 1991; Siqueira et al., 1991a, 1991b; Silva-Júnior & Siqueira, 1998), porém é necessário entender a relação do número de propágulos infectivos inicial com a resposta à aplicação de formononetina. Além disso, em alguns casos, a aplicação da formononetina pode apresentar-se como inibidora de G. etunicatum, G. macrocarpum (Tsai & Phillips, 1991) e G. rosea (Bécard et al., 1992; Chabot et al., 1992).

Não foi encontrada, no presente trabalho, relação entre nível de colonização e esporulação nos isolados na ausência de Mycoform. Porém, quando o produto foi aplicado, mesmo com o efeito diferenciado dos isolados houve boa relação entre colonização e a densidade de esporos no solo (Figura 1). Portanto, a aplicação de formononetina altera o padrão de esporulação e a interdependência desta com o grau de colonização dos respectivos isolados. Dos 13 isolados testados, destacaram-se como os de maior potencial responsivo ao Mycoform os isolados A. delicata DCS 30, G. etunicatum DCS 12, K. colombiana DCS 03, P. occultum DCS 06 e P. occultum DCS 31, cujos aumentos na esporulação foram elevados, tendo atingido quase 90%. Ao se considerar o efeito médio significativo da aplicação de Mycoform nos isolados com resposta positiva, observa-se que a produção de esporos por estes isolados passou de uma média de 1.685 para 2.666 esporos por 50 mL de solo, o que corresponde a um aumento de 39 esporos por mL de solo avaliado.

O presente trabalho confirma o efeito estimulante do isoflavonoide formononetina na colonização, como já foi observado em vários estudos (Nair et al., 1991; Siqueira et al., 1991a, 1991b), e, pela primeira vez, constata o efeito benéfico da aplicação desse isoflavonoide na esporulação de FMAs. Davies Junior et al. (2005b) também encontraram aumento no número de esporos de FMAs indígenas pertencentes aos gêneros Gigaspora e Glomus, quando aplicado o isoflavonoide formononetina formulado como Myconate, o que resultou em aumento na atividade micorrízica e na produtividade de batata. Não encontraram efeito para Scutellospora sp., que também não respondeu ao Mycoform no presente trabalho.

Embora o efeito do Mycoform sobre os FMAs não seja generalizado, esse produto tem potencial para promover uniformização e aumento da produção de esporos. Como a densidade de esporos é geralmente baixa em solos agrícolas, a aplicação de produtos à base de formononetina pode contribuir para aumentar os benefícios dos FMAs para a produção agrícola.

Conclusões

1. A aplicação do Mycoform aumenta a colonização e a esporulação dos fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) em Brachiaria decumbens, e o efeito varia de acordo com o isolado fúngico.

2. A aplicação do Mycoform altera a relação entre a colonização e a esporulação dos FMAs, e torna essas variáveis mais inter-relacionadas.

3. O efeito do Mycoform na colonização e esporulação é maior nos isolados de atividade mais baixa.

Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pelo financiamento da pesquisa; à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão de bolsa.

Recebido em 11 de fevereiro de 2009 e aprovado em 30 de abril de 2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jul 2009
• Data do Fascículo
  Maio 2009

Histórico

• Aceito
  30 Abr 2009
• Recebido
  11 Fev 2009