Ocorrência de fungos endofíticos "dark septate" em raízes de Oryza glumaepatula na Amazônia

Occurrence of dark septate endophyte fungi in Oryza glumaepatula roots in Amazonia

NOTAS CIENTÍFICAS

Ocorrência de fungos endofíticos "dark septate" em raízes de Oryza glumaepatula na Amazônia

Occurrence of dark septate endophyte fungi in Oryza glumaepatula roots in Amazonia

Gilmara Maria Duarte Pereira^I; Karen Gonçalves Ribeiro^I; Paulo Ivan Fernandes Júnior^II; Marcos José Salgado Vital^I; Maria Catarina Megumi Kasuya^III; Jerri Édson Zilli^IV

^IUniversidade Federal de Roraima, Campus Paricarana, Avenida Capitão Enê Garcez, s/nº, Bairro Aeroporto, CEP 69304-000 Boa Vista, RR. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Semiárido, BR 428, Km 152 Zona Rural, CEP 56302-970 Petrolina, PE. E-mail: [e-mail]

^IIIUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Microbiologia, Avenida P. H. Rolfs, s/nº, CEP 36570-000 Viçosa, MG. E-mail: [e-mail]

^IVEmbrapa Roraima, BR 174, Km 08, Distrito Industrial, Caixa Postal 133, CEP 69307-970 Boa Vista, RR. E-mail: [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de fungos endofíticos "dark septate" (DSEF) em Oryza glumaepatula, na Amazônia, e sua capacidade de colonização in vitro. Foram coletadas plantas de O. glumaepatula em área de cerrado e de mata em Roraima. As raízes foram tratadas para a observação de hifas melanizadas septadas e de microescleródios. Os fungos foram isolados em meio ágar malte. Os DSEF foram observados em plantas coletadas em ambos os ambientes, com maior colonização nas coletadas da mata. Um isolado foi capaz de colonizar o hospedeiro original e também plantas de Oryza sativa, exibindo as estruturas características de DSEF em plantas de arroz saudáveis.

Termos para indexação:Oryza sativa, arroz silvestre, micossimbionte.

ABSTRACT

The objective of this work was to assess the occurrence of dark septate endophyte fungi (DSEF) in Oryza glumaepatula in Amazonia, and its in vitro colonization capacity. Oryza glumaepatula plants were collected in forest and cerrado areas of the Roraima state, Brazil. The roots were prepared to observe septate melanized hyphas and microesclerotia. The isolation of fungi was done in agar malte medium. Dark septate endophyte fungi were observed in plants from both environments, with higher colonization on those collected in the forest. One isolate was able to colonize the original host and also Oryza sativa plants, exhibiting typical DSEF structures in rice healthy plants.

Index terms:Oryza sativa, wild rice, mycossimbiont.

Oryza glumaepatula Steud. é uma espécie de arroz silvestre que ocorre no Pantanal Mato-grossense, no Planalto Central e em áreas de várzea da Amazônia (Rangel et al., 2006). A abundante produção de biomassa de plantas sadias em ambientes oligotróficos, em várzeas da Amazônia, indica que essa espécie é capaz de estabelecer associações mutualistas com microrganismos que auxiliam o seu estabelecimento e desenvolvimento.

Recentemente, a associação entre espécies de arroz silvestre com bactérias diazotróficas (Zhang et al., 2008) e fungos endofíticos "dark septate" (DSEF) (Yuan et al., 2010) foi relatada. Alguns autores têm sugerido que os DSEF são capazes de estabelecer associações mutualistas com seus hospedeiros, pois atuam como promotores do crescimento vegetal e, principalmente, facilitam a absorção de fósforo e nitrogênio (Chen et al., 2010). Também tem sido observado que os DSEF podem coexistir com fungos micorrízicos e produzir metabólitos capazes de aumentar a germinação, o crescimento e a ramificação de hifas desses fungos, beneficiando a planta hospedeira de forma indireta (Scervino et al., 2009). Porém, diferentemente de fungos micorrízicos arbusculares, os DSEF não são biotróficos obrigatórios, o que facilita seu cultivo em meio de cultura e o desenvolvimento de inoculantes que visem à promoção do crescimento vegetal.

No Brasil, estudos recentes mostram que diversas espécies arbóreas e herbáceas, em área de cerrado em Minas Gerais (Detmann et al., 2008), e espécies aquáticas, coletadas em diferentes pontos da Bacia do Rio Paraná (Marins et al., 2009), são colonizadas por DSEF. Na Amazônia, não se tem conhecimento de estudos que avaliam a ocorrência de DSEF em associação com espécies vegetais.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de DSEF em O. glumaepatula, coletadas em áreas de mata e cerrado do Estado de Roraima, bem como avaliar a colonização de O. sativa por isolados de DSEF em condições gnotobióticas.

Foram realizadas duas coletas de plantas de O. glumaepatula, entre os meses de setembro de 2009 e março de 2010: a primeira em uma área de cerrado, no Município de Bonfim, RR (02º58'N, 60º21'W); e a segunda, nas proximidades de uma área de mata proxima ao Parque Nacional do Viruá, Caracaraí, RR (01º24'N, W 60º59'W). No cerrado, foram coletadas plantas em estágio reprodutivo, em locais alagados e secos. Em cada um dos locais, foram coletadas três touceiras, em três pontos distintos, resultando num total de seis amostras compostas. Em área de mata, foram coletadas plantas de arroz jovens e em fase reprodutiva, em três pontos distintos, também com três touceiras, resultando num total de seis amostras compostas. As plantas foram acondicionadas em sacos de plástico e encaminhadas ao laboratório de Microbiologia do Solo, da Embrapa Roraima, Boa Vista, RR.

Para a observação das estruturas típicas de DSEF, o sistema radicular das plantas foi seccionado em fragmentos de aproximadamente 1 cm, que foram fixados em formol, ácido acético e álcool etílico (FAA), na proporção 1:1:5, v v^-1. Posteriormente, as raízes foram diafanizadas, neutralizadas e coradas com azul de tripano em lactoglicerol, conforme Brundrett et al. (1996), com adaptações de exposição das raízes ao KOH à temperatura ambiente. A presença de microescleródios e hifas melanizadas septadas foi observada sob microscópio óptico, Leica 2500DM, e registradas utilizando-se câmera Leica DFC 295 (Leica, Oberkochen, Alemanha).

A determinação da percentagem de colonização de raízes por DSEF, nas áreas de mata e de cerrado, foi realizada pelo método da contagem em lâmina quadriculada (Giovannetti & Mosse, 1980), em que 40 segmentos de raízes por planta, de aproximadamente 1 cm, foram selecionados ao acaso e montados paralelamente em uma lâmina de microscópio, com três repetições. Os dados de percentagem de colonização foram transformados para ln(y) e as médias comparadas pelo teste t de Bonferroni a 10% de probabilidade.

Para o isolamento dos DSEF, as raízes não fixadas foram desinfestados superficialmente com hipoclorito de sódio a 2% e peróxido de hidrogênio a 33%, por 2 e 1 min, respectivamente (Ahlich & Sieber, 1996). Em seguida, as raízes foram seccionadas em fragmentos de 1 cm e colocadas em placas com meio de cultura ágar malte (extrato de malte 20 g L^-1 e ágar 15 g L^-1), adicionado de cloranfenicol (100 mg L^-1). As placas foram incubadas em estufa a 28ºC, no escuro, e o aparecimento das colônias fúngicas melanizadas foi monitorado diariamente, durante duas semanas. Os isolados obtidos foram depositados na Coleção de Microrganismos Multifuncionais da Embrapa Roraima.

Posteriormente, realizou-se um experimento em vasos, para avaliar a capacidade dos isolados fúngicos, obtidos de O. glumaepatula, colonizarem raízes do hospedeiro original, e a produção das estruturas características de DSEF. As sementes de arroz foram desinfestadas superficialmente com hipoclorito de sódio, pré-germinaram em ágar-água e, posteriormente, foram transferidas para vasos com meio Hoagland ½ força (Hoagland & Arnon, 1950), com 6 g L^-1 de ágar. Seis plântulas de arroz foram transplantadas para cada vaso e submetidas à infestação por meio de discos de ágar malte com 3 mm de diâmetro, que continham o isolado fúngico. Os vasos receberam 1 mL de água por semana e foram mantidos por seis semanas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 12 horas.

Conduziu-se, também, um ensaio para avaliar a capacidade de colonização por um dos isolados fúngicos em plantas de arroz comercial O. sativa, nas condições experimentais descritas para O. glumaepatula.

Houve diferença significativa na percentagem de colonização por DSEF entre as plantas de O. glumaepatula coletadas em área de mata e as de cerrado. A média de colonização por DSEF foi de 16 e 7,7%, em plantas das áreas de mata e de cerrado, respectivamente. Esta diferença na colonização de plantas por DSEF, entre os dois ambientes estudados, era esperada, uma vez que o solo da área de mata apresenta maior teor de matéria orgânica e de nutrientes em comparação ao do cerrado. Na área de cerrado, a percentagem de colonização de plantas por DSEF foi igual nas áreas alagadas e seca, o que indica que esses fungos são capazes de colonizar as plantas de O. glumaepatula em condições de alagamento (Figura 1). Na área de mata, a colonização das plantas de arroz em estádio reprodutivo foi maior do que nas plantas em estádio juvenil, o que indica que a colonização de raízes de arroz silvestre por DSEF pode ser influenciada pelo estádio fisiológico das plantas (Lingfei et al., 2005). Há indícios de que a associação entre arroz silvestre e DSEF seja semelhante à associação micorrízica (Mandyam & Jumpponen, 2005), cuja percentagem de colonização é maior em plantas em estádio reprodutivo, em comparação a plantas mais jovens (Saif, 1977). É importante destacar que as áreas amostradas na mata compõem uma região de solo permanentemente úmido, encharcado ou até mesmo alagado e, consequentemente, o arroz apresenta constante rebrota ou até mesmo hábito perene (Rosa et al., 2006). Na área de cerrado, as plantas apresentam, predominantemente, hábito anual, com propagação por sementes. Elas se desenvolvem à medida que aumenta o nível das águas na estação chuvosa, e desaparecem na estiagem (Rangel et al., 2006). Provavelmente, a permanencia de plantas de arroz em solo do ambiente de mata, propicie a manutenção de elevado número de propágulos de DSEF no solo, o que favoreceria a maior colonização das plantas.

Foram obtidos 105 isolados das raízes de O. glumaepatula, dos quais 50 apresentaram micélios melanizados e septados, portanto, foram considerados DSEF. Destes 50, cinco foram inoculados in vitro em plantas de O. glumaepatula, tendo-se constatado que quatro deles, apesar de produzirem estruturas características de DSEF, apresentaram comportamento de fitopatógeno e influenciaram negativamente o desenvolvimento das plantas. Apenas um isolado (ERR004F) foi capaz de colonizar o córtex das raízes e produzir estruturas características de DSEF, como microescleródios e hifas septadas, em plantas saudáveis (Figura 2). Esse isolado também foi submetido à inoculação em plantas de arroz comercial, tendo-se observado a presença de estruturas características de DSEF, sem ocorrência de sintoma de patogenicidade na planta.

A obtenção de isolados com características culturais similares às dos DSEF que, após a reinoculação no hospedeiro original, desencadeiam reações de patogenicidade, tem se mostrado comum em trabalhos de prospecção destes fungos (Yuan et al., 2010). Porém, também é possível encontrar isolados fúngicos pertencentes a gêneros patogênicos em arroz silvestre que, quando submetidos à inoculação em O. sativa,não desencadeiam os sintomas de patogenicidade e promovem o crescimento vegetal (Yuan et al., 2010). A obtenção de um isolado capaz de colonizar as raízes de O. glumaepatula e, especialmente, de O. sativa constitui uma importante perspectiva para a avaliação e seleção de isolados de fungos promotores de crescimento de arroz comercial, que sejam de fácil manuseio em laboratório.

O comportamento diferenciado desses fungos, em laboratório, indica que há uma grande diversidade de DSEF associados, especialmente porque esses fungos apresentam elevado polimorfismo. Estudos de taxonomia e experimentos de inoculação podem revelar a diversidade destes fungos, bem como demonstrar seu potencial biotecnológico para o arroz comercial. A taxonomia polifásica tem sido utilizada na descrição de diversas espécies, como Harpophora oryzae, isolada de raízes de O. granulata na China (Yuan et al., 2010).

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais, da Universidade de Federal de Roraima, e à Embrapa Roraima, pelo suporte financeiro e estrutural.

Recebido em 31 de outubro de 2010 e aprovado em 28 de fevereiro de 2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Jun 2011
• Data do Fascículo
  Mar 2011

Histórico

• Aceito
  28 Fev 2011
• Recebido
  31 Out 2010