Marcadores moleculares derivados de sequências expressas do genoma café potencialmente envolvidas na resistência à ferrugem

Molecular markers from coffee genome expressed sequences potentially involved in resistance to rust

GENÉTICA

Samuel Mazzinghy Alvarenga^I; Eveline Teixeira Caixeta^II; Bárbara Hufnagel^I; Flávia Thiebaut^I; Eunize Maciel-Zambolim^III; Laércio Zambolim^III; Ney Sussumu Sakiyama^IV

^IUniversidade Federal de Viçosa (UFV), Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária, Avenida P.H. Rolfs, s/nº, CEP 36570-000 Viçosa, MG. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Café, Parque Estação Biológica, s/nº, Avenida W3 Norte, Edifício Sede, CEP 70770-901 Brasília, DF. E-mail: [e-mail]

^IIIUFV, Departamento de Fitopatologia. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IVUFV, Departamento de Fitotecnia. E-mail: [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi identificar marcadores moleculares relacionados à resistência do cafeeiro (Coffea arabica) à ferrugem (Hemileia vastatrix). Foram identificadas sequências de DNA potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças, por meio de análise "in silico", a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café. A partir das sequências mineradas, foram desenhados 59 pares de iniciadores para amplificá-las. Os 59 iniciadores foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. Vinte e sete iniciadores resultaram em bandas únicas e bem definidas, enquanto um deles amplificou fragmento de DNA em todos os cafeeiros resistentes, mas não nos suscetíveis. Esse marcador molecular polimórfico amplificou uma região do DNA que corresponde a uma janela aberta de leitura parcial do genoma de C. arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças. O marcador CARF 005 é capaz de diferenciar os cafeeiros analisados em resistentes e susceptíveis a H. vastatrix.

Termos para indexação:Coffea arabica, Hemileia vastatrix, bioinformática, EST-PCR, genes de resistência, mineração de dados.

ABSTRACT

The objective of this work was to identify molecular markers related to the resistance of coffee (Coffea arabica) to rust (Hemileia vastatrix). DNA sequences potentially involved in coffee disease resistance were identified, using "in silico" analysis, from data obtained by the Brazilian coffee genome project. After data mining, 59 primer pairs were designed to amplify the sequences identified. The 59 primers were tested on 12 resistant and 12 susceptible coffee plants to H. vastatrix. Twenty-seven primers resulted in unique and well-defined bands, while one of these amplified a DNA fragment in all resistant plants, but not in the susceptible ones. This polymorphic molecular marker amplified a region of DNA that corresponds to a partial open reading frame of C. arabica genome that encodes a disease resistance protein. The marker CARF 005 can be used to differentiate between resistant and susceptible coffee plants to H. vastatrix.

Index terms:Coffea arabica, Hemileia vastatrix, bioinformatics, EST-PCR, resistance genes, data mining.

Introdução

A principal doença do cafeeiro, a ferrugem alaranjada, é causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk & Br e ocorre em todas as regiões produtoras de café do mundo (Van der Vossen, 2005). Para minimizar os prejuízos causados, é necessário desenvolver estratégias de controle da ferrugem, o que inclui o melhoramento genético para obtenção de variedades resistentes. Neste contexto, o estudo e a caracterização de fatores genéticos de resistência ao fungo são importantes para ampliar os conhecimentos da interação planta-patógeno. Quanto maior o conhecimento dos fatores que determinam a resistência, mais eficaz será o controle da doença (Silva et al., 2006).

O sequenciamento do genoma de plantas tem facilitado e acelerado a identificação de genes de interesse agronômico, o que possibilita sua manipulação subsequente por meio de técnicas de genética molecular. O grande volume de informações de sequências de DNA disponibilizado tem permitido, também, o desenvolvimento de novos e eficientes marcadores moleculares. Entre eles, estão os marcadores funcionais EST-PCR ("expressed sequence tag-polymerase chain reaction"), gerados por meio de desenhos de iniciadores baseados em sequências de ESTs. Esses marcadores são convenientes para a triagem de materiais vegetais desejáveis em programas de melhoramento e particularmente úteis para o mapeamento de QTLs ("quantitative trait loci") (Hagras et al., 2005; Ayala-Navarrete et al., 2007, 2009; Shen Ohm, 2007; Lu et al., 2006). Por serem originados de regiões codificadoras, que são mais conservadas entre populações e espécies do que as não codificadoras, os marcadores EST-PCR podem ser utilizados entre espécies relacionadas e para o estudo de mapeamento comparativo (Rowland et al., 2003b; Sargent et al., 2007). Essa transportabilidade é especialmente útil para espécies que ainda não apresentam sequências de DNA disponíveis para análise. Além disso, os EST-PCR podem ser herdados codominantemente, o que permite a identificação dos dois alelos em locos heterozigotos de organismos diploides (Rowland et al., 2003a).

O sequenciamento do genoma funcional de Coffea arabica L., C. canephora Pierre ex A. Froehner e C. racemosa Lour. foi realizado por meio do Projeto Brasileiro do Genoma Café (Vieira et al., 2006). As 214.964 ESTs resultantes do sequenciamento foram armazenadas na base de dados de ESTs do Projeto (CafEST), e os clones sequenciados foram provenientes de 37 bibliotecas de cDNA. Assim, essas ESTs representam milhares de genes expressos em diferentes órgãos do cafeeiro, obtidos em vários estágios de desenvolvimento da planta e submetidos a condições de estresse biótico e abiótico.

Para identificar genes relacionados ao mecanismo de defesa do cafeeiro a doenças, Alvarenga et al. (2010) realizaram mineração de dados no CafEST. Análises "in silico" revelaram que os produtos de 11.300 ESTs identificadas apresentaram alto nível de similaridade com as proteínas envolvidas no processo de defesa de plantas a doenças.

O objetivo deste trabalho foi identificar, entre sequências previamente identificadas por Alvarenga et al. (2010), as envolvidas na resistência do cafeeiro à ferrugem, bem como, a partir delas, obter marcadores EST-PCR.

Material e Métodos

O conjunto de sequências utilizadas para o desenvolvimento de marcadores foi constituído pelas sequências previamente obtidas por Alvarenga et al. (2010) e por nova mineração de dados, realizada no presente trabalho.

A mineração das sequências foi realizada pela análise das ESTs do CafEST, por meio de ferramentas de bioinformática disponíveis na plataforma de bioinformática do CafEST (Laboratório de Genômica e Expressão, 2011). Foram utilizadas duas estratégias de mineração: "electronic northern" e sequências publicadas.

Com a ferramenta "electronic northern" (Carazzolle et al., 2007), foram agrupadas as 214.964 ESTs provenientes das 37 bibliotecas de cDNA do CafEST (Vieira et al., 2006). A percentagem normalizada de ESTs das bibliotecas que constituem cada um dos "contigs" foi descrita. Em seguida, foram minerados os agrupamentos constituídos por pelo menos uma EST da biblioteca RM1. Esta biblioteca foi construída a partir de folhas de C. arabica S288/23 (CIFC 33/1) inoculadas com H. vastatrix raça II e infectadas com bicho-mineiro (Leucoptera coffeella). O sequenciamento da biblioteca foi realizado com o pool de material genético extraído a um, dois e quatro dias após a inoculação. Portanto, essa biblioteca é uma fonte potencial de sequências envolvidas no processo de resistência da planta contra doenças.

Sequências publicadas, já disponíveis em bancos de dados públicos, que codificam genes de cafeeiros relacionados à resistência a patógenos (Chen et al., 2003; Fernandez et al., 2004; Lin et al., 2005; Ganesh et al., 2006), também foram usadas na mineração. Foi utilizada a ferramenta "search Blast local" do CafEST, para realizar uma busca por similaridade entre as sequências publicadas e as do CafEST.

Para verificar a sua anotação, as ESTs mineradas foram, posteriormente, comparadas ao banco de dados NR ("non-redundant protein sequences") do National Center for Biotechnology Information (NCBI), por meio do programa BlastX (Altschul et al., 1990).

As sequências mineradas no presente trabalho, bem como as obtidas por Alvarenga et al. (2010), foram submetidas à análise para identificar aquelas que apresentam maior possibilidade de estarem envolvidas no processo de resistência do cafeeiro a patógenos. A análise foi baseada na anotação de cada sequência, tendo-se observado o organismo homólogo, a função potencial da sequência, o "e-value" menor ou igual a 10^-20, o score igual ou maior que 100 e, para os "contigs", a presença de ESTs provenientes da biblioteca RM1.

A partir das sequências selecionadas, foram desenhados pares de iniciadores com o programa Primer3 (Rozen & Skaletsky, 2000). As condições utilizadas foram: produto de PCR com tamanho de 200 a 600 pb; tamanho do iniciador de 18 a 24 pb; "melting temperature" (TM) de 55 a 60ºC; e percentagem de CG de 45 a 55. Para os demais parâmetros, foram utilizados os valores pré-definidos pelo programa. A estabilidade dos iniciadores foi verificada com uso do programa PrimerSelect 6.1 (DNAStar, Madison, WI, EUA). A especificidade dos iniciadores foi determinada pela comparação da sequência de cada iniciador com o banco de dados NR/NT de nucleotídeos do NCBI, por meio do programa Blastn (Altschul et al., 1990).

Para a avaliação dos marcadores moleculares, foram utilizados 24 genótipos de cafeeiro do Banco de Germoplasma da Universidade Federal de Viçosa e da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais. Desses, foram selecionados 12 genótipos utilizados como fontes de resistência a H. vastatrix, nos programas de melhoramento, e 12 genótipos suscetíveis a esse fungo (Tabela 1).

Folhas jovens de cada um desses cafeeiros foram coletadas, armazenadas em ultrafreezer a -80ºC e liofilizadas. O DNA foi extraído conforme Diniz et al. (2005). Após a extração, o DNA foi quantificado em espectrofotômetro e armazenado a 4ºC. Para a amplificação, o DNA foi diluído em TE (Tris HCl 10 mmol L^-1, EDTA 1 mmol L^-1, pH 8,0) para atingir a concentração final de 10 ng µL^-1.

A reação de PCR foi realizada em 20 µL de solução contendo 30 ng de DNA, 0,8 unidade de Taq DNA polimerase, tampão 1x, 1 mmol L^-1 de MgCl₂, 60 µmol L^-1 de cada dNTP e 0,7 µmol L^-1 de cada iniciador. Para a amplificação, utilizou-se o procedimento "touchdown PCR", que consistiu em: etapa de desnaturação inicial de 94ºC por 3 min, seguida de cinco ciclos com etapa de desnaturação a 94ºC por 30 s, etapa de anelamento por 20 s e extensão a 72ºC por 40 s. A temperatura de anelamento foi de 65 a 60ºC, tendo-se reduzido 1ºC a cada ciclo. Após os cinco ciclos, procederam-se mais 30 ciclos com desnaturação a 94ºC por 60 s, anelamento de 60ºC por 20 s e extensão de 72ºC por 40 s. Após os ciclos, foi realizada extensão final de 72ºC por 7 min.

Os produtos das reações de amplificação foram submetidos à eletroforese em géis de agarose a 1,2%, os quais foram corados com brometo de etídio, visualizados em transiluminador sob luz UV e fotodocumentados. Os iniciadores que apresentaram perfil de bandas monomórficas em agarose foram posteriormente submetidos à eletroforese em géis desnaturantes de poliacrilamida a 6%, os quais foram corados com nitrato de prata a 4% e visualizados em transiluminador sob luz branca. As imagens obtidas foram digitalizadas de acordo com Brito et al. (2010).

Resultados e Discussão

Foram obtidos 2.206 grupamentos que continham pelo menos uma EST da biblioteca RM1, por meio da ferramenta "electronic northern", disponível na plataforma de bioinformática do CafEST. Desse total, 602 correspondem a "singlets" ou a "contigs" formados exclusivamente por ESTs da biblioteca RM1, 21 formados por 99 a 75% de ESTs da biblioteca RM1 e 213 por 74 a 50%. Como essas sequências são de genes expressos no momento da infecção da planta por bicho-mineiro ou ferrugem, é provável que elas tenham função no processo de infecção e no mecanismo de defesa da planta contra esses estresses bióticos. De fato, vários grupamentos minerados apresentaram similaridade com proteínas reconhecidamente relacionadas a esse processo como, por exemplo, proteína de resistência com domínio NBS, proteína quinase, proteína de resposta de defesa, proteínas de defesa contra fungos, proteínas envolvidas com apoptose, proteínas de resposta a estímulo de ácido jasmônico e a estresse oxidativo, proteína de ligação ao DNA, entre outras.

A partir das sequências publicadas (Chen et al., 2003; Fernandez et al., 2004; Lin et al., 2005; Ganesh et al., 2006), foram identificadas 66 sequências do CafEST relacionadas à resistência do cafeeiro a doenças.

No presente trabalho, foram identificadas 2.272 sequências relacionadas à defesa do cafeeiro a doenças. A partir dessas sequências e das 11.300 obtidas por Alvarenga et al. (2010), foram selecionadas 62, com maior possibilidade de estarem envolvidas no processo de resistência do cafeeiro a patógenos. Em seguida, foram desenhados os iniciadores que amplificam essas sequências. Após a análise de estabilidade dos iniciadores desenhados, foram sintetizados 59 pares, que foram denominados de CARF 001 a CARF 059 (Tabela 2).

Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR e condições de amplificação foram testados, e os 59 pares de iniciadores foram analisados em cafeeiros resistentes e susceptíveis à ferrugem. Desses, 20 não amplificaram nenhum fragmento de DNA. Como os iniciadores foram desenhados a partir de sequências de ESTs, é possível que, quando testados em DNA genômico, a presença de "introns" muito longos tenha sido o motivo da não amplificação. Os 39 pares de iniciadores restantes amplificaram bandas bem definidas, e 38 iniciadores foram monomórficos tanto em gel de agarose (Figura 1) quanto em poliacrilamida.

Apenas o marcador CARF 005 resultou em fragmentos polimórficos detectáveis diretamente em gel de agarose, tendo sido capaz de diferenciar indivíduos resistentes e susceptíveis à ferrugem do cafeeiro (Figura 2). Todos os cafeeiros resistentes apresentaram o fragmento de 400 pb, enquanto nenhum susceptível apresentou a banda, com a exceção de C. excelsa.

O fragmento amplificado pelo iniciador CARF 005 foi sequenciado para confirmar a sua anotação [gi|24459841|emb|CAC82597.1| "disease resistance like protein" (Coffea arabica)]. A sequência do fragmento amplificado pelo iniciador CARF 005 foi comparada ao banco de dados de nucleotídeos do NCBI, por meio do programa Blast (Megablast). O resultado do alinhamento é indicativo de que o fragmento corresponde a um janela aberta de leitura (ORF, "open reading frame") parcial de C. arabica (código de acesso emb|AJ298884.1|) que codifica uma proteína de resistência a doenças, com 97% de identidade, score igual a 287 e "e-value" de 2,4e^-74.

A sequência nucleotídica foi convertida em sequência de aminoácidos para análise em bancos de dados de proteínas. A pesquisa nos bancos InterPro, UniProtKB/TrEMBL, Pfam e Prints revelou similaridade da sequência com a proteína de resistência a doenças (códigos de acesso IPR000767, Q8GSU7, PF00931 e PR00364, respectivamente), com domínios conservados NB-ARC (IPR002182) e LRR (IPR011713).

Vários tipos de proteínas contendo o domínio NB-ARC estão envolvidos no processo de apoptose. O domínio NB-ARC é formado por três subdomínios: uma ligação a nucleotídeo (NB, "nucleotide binding"), uma extensão C-terminal que forma uma estrutura de quatro hélices (ARC1) e uma hélice enovelada (ARC2) (Tameling et al., 2006). Mutações no domínio NB-ARC podem comprometer ou até mesmo eliminar a função de resistência das proteínas, como mostrado em estudos realizados com as proteínas N (tabaco), RPS2 e RPM1 (Arabidopsis) (Dinesh-Kumar et al., 2000; Tao et al., 2000; Tornero et al., 2002).

De acordo com Parniske et al. (1997), o domínio LRR pode facilitar a interação da proteína R com o seu fator Avr (elicitor) relacionado e pode fornecer diferentes especificidades de reconhecimento para fatores Avr alterados. De fato, em vários sistemas planta-patógeno, a variação da sequência na região LRR tem mostrado ser responsável por diferentes especificidades de reconhecimento ou de resistência (Parniske et al., 1997; Thomas et al., 1997; Botella et al., 1998; Wang et al., 1998; Ellis et al., 1999).

Segundo os termos do Gene Ontology Consortium (Ashburner et al., 2000), a sequência amplificada pelo CARF 005 participa de processos biológicos, como defesa (defense response, GO:0006952) e apoptose (apoptosis, GO:0006915), e apresenta função molecular de ligação a ATP (ATP binding, GO:0005524).

Vários estudos relatam a identificação de genes de cafeeiros relacionados à resistência a patógenos com uso de técnicas moleculares (Chen et al., 2003; Fernandez et al., 2004; Lin et al., 2005; Ganesh et al., 2006; Guzzo et al., 2009). No presente trabalho, o CARF 005, um marcador derivado de EST, foi capaz de diferenciar indivíduos resistentes e susceptíveis à ferrugem do cafeeiro e, portanto, pode ser testado em populações segregantes contendo diferentes genes de resistência. Essa análise permitirá verificar a ligação desse marcador, obtido a partir das sequências mineradas, com os diferentes genes relacionados à resistência do cafeeiro à ferrugem.

Em relação aos 26 pares de iniciadores que não apresentaram polimorfismo, como o CARF 028 (Figura 1), os fragmentos podem ter apresentado polimorfismos de um único nucleotídeo ao longo da sequência e, por isso, não puderam ser observados por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida. Essa diferença, provavelmente é resultado do padrão de expressão diferente desses genes entre indivíduos resistentes e susceptíveis, pode ser verificada por meio de análises de enzima de restrição e por meio de sequenciamento para detecção de SNPs ("single nucleotide polymorphisms"). Para a verificação da expressão diferencial, podem ser realizadas análises de RT-PCR e ensaios de macroarranjo.

Conclusões

1. Das sequências do CafEST, 2.272 mineradas estão relacionadas à defesa do cafeeiro a doenças.

2. O marcador CARF 005, desenvolvido a partir das ESTs mineradas, é capaz de diferenciar os cafeeiros analisados em resistentes e susceptíveis a Hemileia vastatrix.

Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, ao Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café e à Financiadora de Estudos e Projetos, pelo apoio financeiro; aos Drs. Antônio Alves Pereira e Antonio Carlos Baião de Oliveira, por informações e disponibilização dos genótipos utilizados no trabalho.

Recebido em 9 de maio de 2011 e aprovado em 12 de agosto de 2011

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Marcadores moleculares derivados de sequências expressas do genoma café potencialmente envolvidas na resistência à ferrugem

Molecular markers from coffee genome expressed sequences potentially involved in resistance to rust

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Ago 2011

Histórico

• Aceito
  12 Ago 2011
• Recebido
  09 Maio 2011