EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE Passiflora spp. PARA ANÁLISES PCR-RAPD

GENOMIC DNA EXTRACTION FROM Passiflora spp. FOR PCR-RAPD ANALYSES

COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA

EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE Passiflora spp. PARA ANÁLISES PCR-RAPD¹

HUGO BRUNO MOLINARI²& MARIA LÚCIA CROCHEMORE³

RESUMO - A identificação e caracterização da diversidade genética de plantas por meio de técnicas moleculares envolvem a avaliação de vários indivíduos, necessitando-se, portanto, de métodos rápidos e precisos de extração do DNA. O co-isolamento de polissacarídeos, fenóis e compostos secundários é o principal problema encontrado no isolamento e purificação de DNA vegetal. Folhas das diversas espécies de Passiflora possuem níveis variados desses compostos que podem comprometer este procedimento. O presente estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a qualidade e quantidade de DNA de folhas de variedades de Passiflora spp., utilizando-se de três métodos de extração. Os três métodos forneceram DNA em qualidade e quantidade suficientes para a realização da técnica PCR-RAPD.

Termos para indexação: Passiflora spp., DNA, extração

GENOMIC DNA EXTRACTION FROM Passiflora spp. FOR PCR-RAPD ANALYSES

ABSTRACT - The identification and characterization of the genetic diversity of plants by molecular techniques involve the evaluation of several individuals, therefore requiring fast and precise extraction methods of DNA. Co-isolation of polysaccharides, phenols and secondary products is the main problem during isolation and purification of plant DNA. The leaves of several species of Passiflora have different levels of those compounds that can compromise this procedure. The objective of this study was to evaluate the quality and amount of DNA extracted from Passiflora spp. varieties using three extraction methods. The three methods supplied DNA in quality and quantity sufficient amount for PCR-RAPD analyses.

Index terms:Passiflora spp., DNA, extraction.

Normalmente, estudos de identificação e de caracterização da diversidade genética das plantas, por meio de técnicas moleculares, envolvem a avaliação de um grande número de indivíduos, necessitando-se de métodos rápidos e precisos de extração de DNA. O co-isolamento de polissacarídeos, fenóis e compostos secundários é o principal problema encontrado no isolamento e purificação de DNA vegetal, podendo danificar o DNA e inibir a ação da enzima Taq polimerase. As folhas das diversas espécies de Passiflora possuem níveis variados de alcalóides, estereóides, flavonóides, glicosídeos cianogênicos, gomas, taninos, resinas e alguns ácidos (Duke, 1989) que podem comprometer a extração de DNA.

De modo geral, o protocolo de extração de DNA mais utilizado para as diferentes espécies é o CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) padrão, ou CTAB com algumas modificações e variações daquele descrito por Dellaporta et al. (1983). Para extração de DNA de folhas do maracujazeiro, estes métodos são reportados, respectivamente, por Otoni et al. (1995) e Fajardo et al. (1998). A diferença básica entre esses protocolos está na composição do tampão de extração que, normalmente, integra um agente tamponante para estabilizar o pH em torno de 8.0; um sal para dissociar as proteínas do DNA; um detergente para solubilizar as membranas e auxiliar na inativação de algumas enzimas; e um inibidor de DNAses para proteger o DNA (Bered, 1998).

Os detergentes devem romper as membranas celulares para que ocorra a liberação do DNA. Dellaporta et al. (1983) usam SDS (dodecil sulfato de sódio) como detergente, enquanto Doyle & Doyle (1991) usam o CTAB e Cheung et al. (1993), o sarcosyl.

Protocolos extremamente simplificados como de Cheung et al. (1993) podem fornecer DNAs parcialmente degradados ou contaminados que, apesar de possibilitar amplificações PCR, podem comprometer a reprodutibilidade das reações, resultando muitas vezes em falsos negativos (Romano, 1998).

Assim, este estudo foi realizado com o objetivo de avaliar 3 métodos de extração de DNA de folhas de plantas de várias espécies de Passiflora spp., de forma a obter quantidade e qualidade de DNA suficiente para a realização da técnica PCR-RAPD.

Foram avaliados 8 lotes de matrizes e 7 acessos integrantes da coleção de Passiflora spp. do IAPAR (Tabela 1). As análises foram realizadas sobre 3 plantas por genótipo, instaladas em casa de vegetação, através de estaquia ou enxertia, sob condições controladas de luminosidade, temperatura e umidade relativa do ar.

A amostragem das folhas dos diferentes genótipos foi realizada invariavelmente no mesmo estádio de desenvolvimento de plântula (primórdios foliares). As folhas foram coletadas e acondicionadas em gelo para serem transportadas até o laboratório. Foram avaliados três protocolos: Cheung et al., 1993, Tai & Tanksley (1991) - Dellaporta modificado e Doyle & Doyle (1991). Todos os protocolos foram testados partindo-se de amostras de tecido de folhas frescas pesando 40 mg.

Método de Cheung et al. (1993) - modificado: 20 a 40 mg de peso frescos foram colocados em tubos de microcentrífuga esterilizados e pulverizados no homogeneizador elétrico com 160 ml de tampão de extração [200 mM Tris HCl (pH 8.0), 70 mM EDTA (pH 8.0), 2 M NaCl e 20 mM de Metabissulfito de Sódio]. Foram adicionados 40 ml de solução de sarcosyl 5% e, após incubação a 60 ºC por uma hora, centrifugou-se por 15 minutos a 18407 g. Foram adicionados 90 ml de acetato de amônia (10 M) e 200 ml de isopropanol gelado, deixando-se em repouso em temperatura ambiente por 15min. Centrifugou-se novamente por 15 min a 18407 g e lavou-se com etanol 70% gelado. Em seguida, descartou-se o etanol e secou-se em estufa a 37 ºC por 15 min. O DNA foi ressuspendido em 50 ml de TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] com RNAse (10 mg/ml).

Método de Tai & Tanksley (1991) - modificado: 20 - 40 mg de peso frescos foram colocados dentro de tubos de microcentrífuga esterilizados, contendo 400 ml/tubo do tampão de extração (Tris-HCl 1M + EDTA 0,5M + NaCl 5M + SDS 10% + Na bissulfite) e incubou-se a 65 ºC em banho-maria por 15 min. Adicionaram-se 125 ml/tubo de acetato de potássio (5M), homogeneizando-se e deixando-se por 20min no gelo. Centrifugou-se a 18407 g durante 5 min, e o sobrenadante foi transferido para novos tubos de microcentrífuga. Foram adicionados 350 ml de isopropanol gelado e, em seguida, homogeneizou-se delicadamente, deixando-se repousar por 30min a TA. Centrifugou-se a 18407 g durante 5 min, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 50 ml de etanol 75% gelado. Centrifugou-se a 18407 g por 1 min e eliminou-se o etanol. Os tubos foram levados para secar na estufa a 37 ºC durante 20 min. Ressuspendeu-se o DNA em 50 ml/tubo de TE buffer (TRIS 10 mM EDTA 50 mM pH 8,). Após centrifugação a 18407 g durante 1min, transferiu-se o sobrenadante para novos tubos aos quais foram adicionados 2 ml de RNAse a 2,5 mg/ml. Centrifugou-se rapidamente, deixou-se repousar por 15min a TA, e o DNA foi precipitado com 3,5 ml de acetato de sódio (10% do volume). Foram adicionados 165 ml/tubo de etanol 95% gelado, e o DNA foi precipitado durante uma noite a ¾20 ºC. Centrifugou-se a 18407 g durante 5min, descartou-se o sobrenadante e lavou-se com 50 ml/tubo de etanol 75% gelado. Centrifugou-se novamente por 3min a 18407 g, os tubos foram levados para secar no exaustor por 15min ou em estufa a 37 ºC. Posteriormente, o DNA foi ressuspendido em 50 ml de água esterilizada (ultrapura).

Método de Doyle & Doyle (1991): 20 ¾ 40 mg de folhas frescas foram homogeneizadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo 300 ml de tampão de extração (2% CTAB, 1,4M NaCl, 0,2%, 2-mercaptoetanol, 20mM EDTA, 100 mM Tris-HCl- pH 8,0). Após 30 min de incubação a 65 ºC, o material foi centrifugado por 10 min a 11000 g, e o sobrenadante transferido para um novo tubo, adicionando-se volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), após suave homogeneização e centrifugação por 2 min a 11000 g, para separação das fases. A fase superior foi transferida para um novo tubo, adicionando-se 2/3 do volume de isopropanol gelado, permanecendo por 30 min em gelo. Em seguida, centrifugou-se novamente por 15 min a 11000 g. Descartou-se o sobrenadante, e o precipitado foi lavado com 1 ml de etanol 70% gelado e deixado secar a TA. O DNA foi ressuspendido em 50 ml de TE buffer (TRIS 10 mM EDTA 50 mM pH 8) e estocado a ¾20ºC.

Para os três protocolos de extração, o DNA obtido foi quantificado em fluorímetro (Dyna Quant^TM200 ¾ Hoefer). Os resultados obtidos em ng/ml foram transformados em ng/mg de tecido (peso fresco). Para a determinação da qualidade do DNA, 1000 ng de cada amostra foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose a 0,8% (80 V) já corado com brometo de etídio, visualizado em Ultravioleta (UV) e fotografado com equipamento EDAS 120 Kodak Digital Science 1D^TM.

Análises preliminares da técnica RAPD, conforme aquela descrita para alfafa por Crochemore et al. (1996), utilizando-se do primer A04-Operon (AATCGGGCTG) (Fajardo et al., 1998), foram realizadas apenas com o objetivo de ser mais um parâmetro para a avaliação da qualidade do DNA extraído pelos 3 métodos.

A concentração média de DNA extraído das folhas de Passiflora spp. pelos três métodos é apresentada na Figura 1. Observa-se que concentrações maiores foram obtidas quando se utilizou o protocolo Tai & Tansley (1991), seguido por Cheung et al. (1991) e Doyle & Doyle (1991). Os três métodos produziram concentrações adequadas para análises PCR-RAPD. Estas concentrações encontram-se entre 379 e 4205 ng/mg de tecido (peso fresco).

A qualidade do DNA pode ser observada em gel sob UV, tanto em concentrações de 1000 ng (Figura 2), como em fragmentos amplificados por RAPD, cuja concentração de DNA utilizada para a reação foi de 25 ng/ml (Figuras 3). De modo geral, os três métodos produziram DNA de boa qualidade para PCR-RAPD; no entanto, melhor resolução foi observada no perfil RAPD quando o DNA foi extraído pelo método Dellaporta (Figura 3).

O protocolo de Cheung et al. (1993) é o mais rápido de ser executado, enquanto o protocolo de Doyle & Doyle (1991) é mais trabalhoso, necessitando de maiores cuidados devido à volatilidade e toxicidade do 2-mercaptoetanol. Enquanto no protocolo de Cheung et al. (1991) há apenas uma etapa para a eliminação de impurezas, no protocolo Dellaporta modificado são sete as etapas de purificação, o que nos leva a obter quantidades maiores de DNA.

Assim, com base nos resultados obtidos e nas condições em que se realizou o presente estudo, conclui-se que os 3 métodos foram eficientes para a obtenção de DNA de qualidade e em concentrações suficientes para a realização da técnica PCR-RAPD. Sugere-se, no entanto, a preferência pela técnica de Dellaporta para a extração de DNA de folhas do maracujazeiro, considerando-se a melhor resolução apresentada no perfil RAPD produzido.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• BERED, F. Extração de DNA ž considerações e prática. In: MILACH, S. (Ed.) Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre, 1998, 141 p.
• CHEUNG, W.Y.; HUBERT, N.; LANDRY, B.S. A simple and rapid DNA microextration method for plant, animal, and insect suitable for RAPD and other PCR analyses. Technical Tips, v. 3, p.69-70, 1993.
• CROCHEMORE, M.L.; HUYGHE, C.; KERLAN, M.C.; DURAND, F.; JULIER, B. Partitioning and distribution of RAPD variation in a set of populations of the Medicago sativa complex. Agronomie, Paris, v.16, p. 421-432, 1996
• DELLAPORTA, S.L.; WOOD, J.; HICKS. J. B. A plant minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Report v.1, p. 19-20, 1983.
• DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 1, 13-15, 1991.
• DUKE, J. A . Handbook of Medicinal Herbs. Florida: CRC Press, 1989. 667p.
• FAJARDO, D.; ANGEL, F.; GRUM, M.; TOHME, J.; LOBO, M.; ROCA, W.M.; SANCHEZ, I. Genetic variation analysis of the genus Passiflora l. using rapd markers. Euphytica. v. 101, p. 341-347, 1998.
• FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3. ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. pp.220. (Documento, 20).
• OTONI , W. C.; BLACKHALL, N.W.; D´UTRA VAZ, F.B.; CASALI, V.W.; POWER, J.B. DAVEY, M.R. Somatic hybridization of the Passiflora species, P. edulis f. flavicarpa degener and P. incarnata. L. Journal Experimental Botany, Oxford, v. 46, n. 288, p. 777-785, 1995.
• ROMANO, E. Extração de DNA de tecidos vegetais. In: BRASILEIRO, A.C.M.; CARNEIRO, V.T.C. (Ed.). Manual de transformação genética de plantas. Brasília. EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEN. 1998. p.163-177.
• TAI, T.H., TANSLEY, S.D. A rapid and inexpensive method for isolation of total DNA from dehydrated plant tissue. Plant tissue. Plant Molecular Biology Report, v. 8, p.297-303, 1991.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2001

Histórico

• Recebido
  24 Jul 2000
• Aceito
  13 Jun 2001