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Revista Brasileira de Fruticultura

Print version ISSN 0100-2945On-line version ISSN 1806-9967

Rev. Bras. Frutic. vol.23 no.3 Jaboticabal Dec. 2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-29452001000300041 

ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES NA OBTENÇÃO DE PLANTAS EM CRUZAMENTOS ENTRE GENITORES APIRENOS DE VIDEIRA1

 

ADRIANE LEITE DO AMARAL2; PAULO RICARDO DIAS DE OLIVEIRA3; ANA BEATRIZ COSTA CZERMAINSKI4; UMBERTO ALMEIDA CAMARGO4

 

 

RESUMO - Pesquisou-se o efeito do estádio de desenvolvimento de embriões resgatados na obtenção de plantas em cruzamentos entre genitores apirenos de videira, utilizando dois métodos de cultivo in vitro de sementes-traço. No método 1 (M1), as sementes-traço foram cultivadas 60 dias em meio-de-cultura ER e no método 2 (M2) 60 dias em ER, mais 30 dias em meio-de-cultura MS. O estádio de desenvolvimento do embrião foi identificado no final destes períodos, quando do resgate e transferência para meio-de-cultura WP. Quatro tipos de embriões foram identificados: globular, cordiforme, torpedo e indefinido. O estádio globular foi encontrado com maior freqüência, levando à obtenção de maior número de plantas, mesmo tendo apresentado menor capacidade de gerar plantas. A maior eficiência em gerar plantas foi obtida com o estádio torpedo. No M2, ocorreu maior número de embriões germinados e de plantas desenvolvidas. Como o estádio de desenvolvimento do embrião influencia na obtenção de plantas, o resgate de embriões em estádio mais avançado do seu desenvolvimento leva a tem maior capacidade de gerar plantas. Portanto, uso de técnicas que favoreçam o resgate de embriões mais desenvolvidos pode aumentar o número de plantas obtidas.

Termos para indexação: estenoespermocarpia, meios-de-cultura, resgate de embriões, Vitis sp.

 

EMBRYO GROWTH STAGES ON PLANT OBTENTION FROM CROSSES BETWEEN SEEDLESS GRAPE PARENTS

ABSTRACT - It was investigated the effect of the growth stage of rescued embryos on plant obtention from crosses between seedless grape parents. Two methods for in vitro culture were compared. Method 1 (M1): seed traces were cultured 60 days in ER culture medium. Method 2 (M2): procedure of M1 followed by additional 30 days in MS culture medium. The stage of embryo growth was established at the end of this period, when the embryos were rescued and transfered to WP culture medium. Four classes of embryo stages were indentified: globular, heart, torpedo and undefined. The globular stage, the most frequently found, produced the largest quantity of recovered plants, though it had the lowest capacity of originating plants. The torpedo stage was the most efficient in producing plants. M2 promoted the largest amount of germinated embryos and recovered plants. As the embryo growth stage affects the plant obtention, the rescue of embryos in an advanced growth stage promotes a higher capacity of producing plants. Therefore the use of techniques that favour the rescuing of embryos in an advanced growth stage can increase the obtention of plants.

Index terms: stenospermocarpy, culture media, embryo rescue, Vitis sp.

 

 

INTRODUÇÃO

Grande parte dos programas de melhoramento genético, direcionados ao lançamento de cultivares de uva de mesa apirenas, ou sem sementes, realizam cruzamentos diretos entre genitores apirenos estenoespermocárpicos, resultando em 40 a 80% de descendência apirena (Ramming, 1990). A estenoespermocarpia em uva tem determinação genética e é caracterizada pela formação de sementes-traço no fruto, geralmente imperceptíveis na degustação. Neste sistema, o desenvolvimento do fruto depende da fertilização e formação do embrião, mas o desenvolvimento da semente não se completa devido ao aborto do embrião e degeneração do endosperma (Stout, 1936). O aborto do embrião pode ocorrer em períodos variáveis pós-fertilização. Na maioria das cultivares avaliadas por Emershad et al. (1989), foi observado o início deste processo na oitava semana após a polinização.

A utilização da estenoespermocarpia no melhoramento genético da videira implica o uso de técnicas de cultura de tecidos, capazes de previnir o aborto do embrião e de promover seu desenvolvimento até a obtenção da planta. A cultura de tecidos tem uma história recente em Vitis sp., e o resgate de embriões, em hibridações entre genótipos apirenos, pode ser destacado como a mais significativa contribuição da cultura de tecidos para o melhoramento genético da uva de mesa (Mullins, 1990). O resgate de embriões em videiras estenoespermocárpicas foi primeiramente sugerido por Ramming (1983) e foi somente a partir de estudos desenvolvidos nos Estados Unidos e em Israel que a técnica passou a ser amplamente utilizada (Emershad & Ramming, 1984; Spiegel-Roy et al., 1985).

A maioria dos grupos de pesquisa que utiliza o resgate de embriões in vitro, mede a eficiência da técnica através da proporção de plantas obtidas a partir das sementes-traço resultantes de cruzamentos entre genitores apirenos. Eficiências da ordem de 2 a 15% podem ser encontradas na literatura como uma função das variações na técnica utilizada (Spiegel-Roy et al., 1985; Bouquet & Davis, 1989; Ponce et al., 1998; Amaral et al., 2000). O ponto crítico desta técnica é o estádio de desenvolvimento do embrião no momento da retirada da semente-traço. Segundo Ramming (1990), embriões muito pequenos, formados por 4 a 50 células, e em estádios iniciais de desenvolvimento, como o globular, são difíceis de cultivar diretamente em meio-de-cultura. Neste contexto, e para propiciar o desenvolvimento dos embriões até estádios mais promissores ao resgate in vitro, foi desenvolvida a cultura de sementes-traço (Ramming, 1983). Nessa técnica, o embrião continua o processo de desenvolvimento dentro de seu ambiente mais favorável, no interior da semente (Gray & Purohit, 1991) e tem a oportunidade de atingir a maturação mesmo depois do início da degeneração do endosperma, que geralmente ocorre 25 dias após a antese (Ledbetter & Ramming, 1989).

Observa-se que raros são os trabalhos que abordam este tema, apesar da sua importância na obtenção de plantas a partir de cruzamentos entre videiras apirenas. Assim sendo, realizou-se este trabalho com o objetivo de determinar o efeito do estádio de desenvolvimento de embriões resgatados sobre o êxito na obtenção de plantas de videira, em cruzamentos entre genitores estenoespermocárpicos, utilizando dois métodos de cultivo in vitro de sementes-traço.

 

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Uva e Vinho, em Bento Gonçalves-RS, utilizando-se de semente-traço provenientes de 12 cruzamentos entre videiras apirenas, efetuados em outubro de 1996. Os cachos foram colhidos oito semanas após a polinização, sendo as bagas esterilizadas com álcool etílico 70% (volume/volume), por um minuto, e hipoclorito de sódio (2,5% de cloro ativo), por 5 minutos. Foram extraídas 1.445 sementes-traço, em capela de fluxo laminar, e cultivadas in vitro, utilizando-se de dois métodos: M1- 60 dias em meio-de-cultura ER (Emershad & Ramming, 1984) semi-sólido com 0,65% de ágar, 6,0% de sacarose, 0,3% de carvão ativado; e M2- 60 dias de cultivo conforme referido em M1, seguido de 30 dias em meio-de-cultura MS (Murashigue & Skoog, 1962) semi-sólido com 0,65% de ágar, 3,0% de sacarose, 0,3% de carvão ativado. O cultivo das sementes-traço foi realizado em sala-de-crescimento com controle de temperatura (26±2°C) e na ausência de luz.

Concluído o tempo de cultura in vitro, as sementes-traço foram dissecadas para extração dos embriões em capela de fluxo laminar, com auxílio de microscópio estereoscópico e instrumentos cirúrgicos. No momento da abertura das sementes-traço para o resgate, os embriões obtidos foram classificados, em escala crescente, quanto ao estádio de desenvolvimento, como globulares, cordiformes e torpedos (Figura 1), conforme Cutter (1987). Embriões sem formato definido, ou atípicos, foram classificados como indefinidos. Imediatamente após a classificação, cada embrião foi cultivado em tubo-de-ensaio (25x120 mm) individual, contendo meio-de-cultura Woody Plant (WP), de Lloyd & McCown (1986), com 0,65% de ágar, 3,0% de sacarose, 0,3% de carvão ativado e suplementado com 2 mL de uma solução a 1 mM de 6-Benzilaminopurina (BAP) para cada 1 L de meio-de-cultura. O cultivo dos embriões foi estabelecido em sala-de-crescimento com controle de temperatura (24±2ºC), fotoperíodo de 16 horas de luz e luminosidade de 400 W/m2, produzida por lâmpadas fluorescentes do tipo extra luz-do-dia (PHILIPS®) e gro-lux (SYLVANIA®) na proporção 4:2, respectivamente.

 

 

As plantas com pelo menos 5 folhas e vigoroso sistema radicular foram consideradas, pelo seu desenvolvimento, aptas para iniciar o processo de aclimatização, sendo, portanto, computadas como plantas obtidas. Foi efetuado o teste de qui-quadrado para verificar se o estádio de desenvolvimento do embrião no momento do resgate influencia ou não a obtenção de plantas. Empregou-se o teste para cada método de cultivo utilizado.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de qui-quadrado permitiu verificar a influência significativa do estádio de desenvolvimento do embrião sobre a obtenção de plantas nos dois métodos de cultivo utilizados (c2= 17,05 , p < 0,05 em M1 e c= 8,79 , p < 0,02 em M2). Foi detectada a predominância de embriões globulares (79%) quando se utilizou o método de cultivo de sementes-traço M1 e dos tipos globular (52%) e torpedo (44%) em M2. Por outro lado, foram muito baixas as freqüências de embriões do tipo cordiforme (3%, tanto em M1 como em M2) e daqueles considerados indefinidos (1-55% e 1%) para os respectivos métodos de cultivo utilizados (Tabela 1). Quanto à capacidade de germinação dos embriões, ficou evidente a superioridade do tipo torpedo pelos altos valores obtidos em M1 (63%) e em M2 (85%) (Tabela 1).

Os percentuais de plantas obtidos estimam a probabilidade de sua ocorrência em cada estádio de desenvolvimento do embrião nos diferentes métodos de cultivo. Com a finalidade de desdobramento do teste qui-quadrado, esses valores serviram como indicadores do estádio de desenvolvimento do embrião mais apropriado para iniciar o processo de resgate in vitro. Assim, quanto à capacidade de germinação dos embriões, ficou evidente a superioridade do tipo torpedo pelos altos valores obtidos em M1 (63%) e em M2 (85%) (Tabela 1). No entanto, quanto à probabilidade de gerar plantas, Fficaram em destaque os estádios cordiforme em M1 (63%) e torpedo em M2 (57%). Foi constatado também que o maior número de plantas obtido a partir de embriões globulares (87, somando os dois métodos de cultivo) é uma função da predominância deste estádio de maturação no momento do resgate e não uma conseqüência da sua capacidade de gerar plantas, expressas por probabilidades de 20% em M1 e 38% em M2.

Considerando-se, contudo, os valores obtidos nos dois métodos de cultivo, observa-se a alta capacidade de gerar plantas dos embriões cordiformes e torpedos, indicando permite que estádios mais avançados de desenvolvimento do embrião são mais adequados para os métodos de resgate in vitro utilizados. O estádio cordiforme, apesar da alta capacidade de formar plantas, pode ser considerado menos expressivo que o torpedo em conseqüência da sua baixa freqüência de ocorrência, em qualquer dos métodos de cultivo. Desta forma, em função dos dois fatores analisados, ocorrência e capacidade de gerar plantas, o embrião do tipo torpedo pode ser considerado como o estádio mais promissor.

O fato de aqueles embriões que se encontram em estádios de desenvolvimento mais avançados, serem mais eficientes em gerar plantas, pode estar relacionado com as menores exigências em balanço nutricional dos meios-de-cultura, em tempo de permanência em cultura e em controle ambiental do cultivo in vitro. Isto vem ao encontro do preconizado por Ramming (1990) que se referiu à necessidade de meios mais complexos quanto menor e mais imaturo o embrião e de uma simulação in vitro das condições encontradas no interior da semente. Da mesma forma, Raghavan (1976) distinguiu duas 2 fases no desenvolvimento do embrião, com necessidades diferenciadas para o cultivo in vitro. Na primeira, heterotrófica, as exigências para o desenvolvimento do embrião seriam maiores e, na segunda, autotrófica, o embrião se caracterizaria pelo formato cordiforme e por não depender mais de fontes exógenas de reguladores de crescimento.

Como resultado geral do resgate de embriões, em diferentes estádios de desenvolvimento e métodos de cultivo in vitro, foram obtidas 163 plantas a partir de 501 embriões resgatados de 1.445 sementes-traço (Tabela 2). Os dois diferentes métodos de cultivo das sementes-traço utilizados para verificar a influência do estádio de desenvolvimento do embrião no resgate in vitro apresentaram diferenças significativas quanto ao número de plantas obtidas (c= 12,78 , p < 0,01). A superioridade do M2 ficou caracterizada pelas proporções de plantas formadas por sementes-traço cultivadas (plantas/sementes) e de plantas formadas por embriões resgatados (plantas/embriões), as quais podem ser adotadas como índices de eficiência da técnica de resgate de embriões. Neste sentido, o índice médio de eficiência de 14,5% para plantas/sementes, obtido com M2, e que superou o de 8,4% obtido com M1, pode ser atribuído ao período adicional de 30 dias em cultura das sementes-traço no meio MS. Esta diferença observada entre os dois métodos representa uma provável melhoria da técnica e caracteriza a vantagem de adoção do M2 na rotina laboratorial.

Os métodos de cultivo in vitro de sementes-traço também propiciaram respostas diferenciadas quanto à germinação dos embriões (Tabela 2). Ao fazer esta análise, verificou-se maior germinação em M2, que contemplou maior período de cultivo in vitro, representando a permanência do embrião imaturo no interior da semente por mais trinta dias, vindo a beneficiar o seu desenvolvimento, mais do que o resgate antecipado para o meio de cultura WP (M1), quando a maioria dos embriões ainda se encontra num estádio precoce de desenvolvimento, conforme indicado na Tabela 1. A partir destes estudos, pode-se sugerir que adaptações nas técnicas de cultivo de sementes-traço e de resgate de embriões, que venham a aumentar a freqüência de embriões em estádios de maturação mais avançados, como o torpedo, podem incrementar a eficiência de obtenção de videiras apirenas.

 

CONCLUSÕES

1- O estádio de desenvolvimento do embrião, no momento do resgate in vitro, tem efeito sobre a obtenção de plantas.

2- Quanto mais avançado o estádio de desenvolvimento do embrião, maior é a sua capacidade de gerar plantas in vitro.

3- O maior tempo de permanência do embrião, em cultivo in vitro de sementes-traço, favorece o desenvolvimento do embrião até estádios mais promissores para o resgate.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq/BIOEX o suporte financeiro para a execução do trabalho, aos Técnicos Agrícolas Valtair Comachio e Roque Zílio e à Bolsista Maria Luiza Milani, pelo auxílio na execução deste trabalho, à Técnica de Laboratório Iraci Sinski, pelas fotografias, e ao Pesquisador Carlos Alberto Ely Machado, pelo tratamento computacional das fotografias.

 

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1 (Trabalho 231/2000). Recebido: 20/10/2000. Aceito para publicação: 30/08/2001. Projeto CNPq/BIOEX, Embrapa Uva e Vinho e Cooperativa Agrícola Mista dos Produtores da Região de Jales Ltda.
2 Eng.-Agr. M.Sc. Bolsista DTI CNPq/BIOEX.
3 Eng.-Agr. Dr. Embrapa Uva e Vinho, Caixa Postal 130, CEP 95700-000, Bento Gonçalves, RS.
4 Eng.-Agr. M.Sc. Embrapa Uva e Vinho.

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