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Revista Brasileira de Fruticultura

Print version ISSN 0100-2945On-line version ISSN 1806-9967

Rev. Bras. Frutic. vol.29 no.3 Jaboticabal  2007

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-29452007000300016 

ARTIGOS
DEFESA FITOSSANITÁRIA

 

Seca dos ponteiros da goiabeira causada por Erwinia psidii: níveis de incidência e aspectos epidemiológicos1

 

Guava bacterial blight due to Erwinia psidii: incidence levels and epidemiological aspects

 

 

Abi Soares Anjos MarquesI; Marcus Vinícius Segurado CoelhoII; Marisa Álvares silva Velloso FerreiraIII; Joanice Pereira Santos DamascenoIV; Alexandre Peron MendesV; Tatiana Martins VieiraVI

IEngª Agrª Dra. Pesquisadora Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Cx. Postal 02372, 70770-900 Brasília-DF. amarques@cenargen.embrapa.br
IIEngº Agrº MSc Fiscal Agropecuário Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Brasília-DF. marcuscoelho@agricultura.gov.br
IIIEngª Agrª Dra. Professora Departamento de Fitopatologia, Universidade de Brasília, 70910-900, Brasília- DF. marisavf@unb.br
IVAssistente de operações Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Cx. Postal 02372, 70770-900 Brasília-DF. joanice@cenargen.embrapa.br
VAssistente de operações Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Cx. Postal 02372, 70770-900 Brasília-DF. aperon@cenargen.embrapa.br
VIBióloga MSc Bolsista Cnpq. tativieira@yahooo.com.br

 

 


RESUMO

Um dos fatores limitantes ao cultivo da goiabeira no Brasil é a 'seca dos ponteiros', causada por Erwinia psidii, presente nas regiões Sudeste e Centro-Oeste, onde se concentram grandes áreas produtoras. Considerando a pequena disponibilidade de informações sobre a epidemiologia e níveis de incidência dessa bacteriose, este estudo teve como objetivos: confirmar a distribuição e verificar a dispersão da seca dos ponteiros da goiabeira no Distrito Federal; investigar o efeito da temperatura sobre a multiplicação in vitro de E. psidii; desenvolver um teste de patogenicidade prático e eficiente e avaliar a sobrevivência in vitro da bactéria em diferentes substratos. A doença foi identificada em 56% das propriedades produtoras avaliadas no DF, com 81,9% de correlação entre a presença de sintomas e o diagnóstico laboratorial. A melhor faixa de temperatura para multiplicação de E. psidii foi de 24 a 33 ºC, e a bactéria permaneceu viável por até 120 dias em suspensão em água. A inoculação da bactéria em folhas ou hastes destacadas levou ao aparecimento de sintomas a partir do sétimo dia e mostrou-se eficiente como um teste rápido para se avaliar a patogenicidade de isolados.

Termos para indexação: Psidium guajava, bacteriose, sobrevivência in vitro, teste de patogenicidade.


ABSTRACT

A major disease that affects guava is 'bacterial blight', caused by Erwinia psidii, which has been reported in Southeastern and Central Regions of Brazil where the major producing areas are located. Considering the lack of information on epidemiology and incidence levels of this disease, the objectives of this study were to confirm the presence and to verify the spread of the disease in Distrito Federal (DF); to determine optimal temperature for in vitro multiplication of E. psidii; to develop a simple and effective method for pathogenicity testing and to evaluate in vitro bacterial survival on different substrates. The disease was detected in 56% of producing orchards evaluated in DF, with a correlation of 81, 9% between presence of symptoms and positive laboratorial diagnosis. The best temperature range for E. psidii growth was from 24 to 33 ºC, and the best method for short term preservation (up to 120 days) was in water suspension. Inoculation of the pathogen on detached leaves or stems allowed symptom development in seven days and it was shown to be a quick and suitable method for testing isolate pathogenicity.

Index terms: Psidium guajava, in vitro survival, pathogenicity test.


 

 

INTRODUÇÃO

Um dos fatores limitantes ao cultivo de goiabeira em algumas regiões brasileiras é a bacteriose ou seca dos ponteiros, causada por Erwinia psidii Rodrigues Neto, Robbs & Yamashiro, cujos sintomas são: a) murcha dos ramos e brotos seguida de seca, os quais adquirem coloração pardo-escura ou negra; b) amarelecimento das folhas, com manchas de aspecto encharcado próximo às nervuras; c) necrose de nervuras em brotações, e d) mumificação de flores e de frutos imaturos.

A seca dos ponteiros foi descrita em 1982, nos municípios paulistas de Valinhos e Pindamonhangaba (Rodrigues Neto et al., 1987). Posteriormente, foi registrada em Minas Gerais (Romeiro et al., 1994), no Espírito Santo (Oliveira et al., 2000) e no Distrito Federal (Lima et al., 1999; Junqueira et al., 2001; Uesugi et al., 2001) (Figura 1). A doença é favorecida por temperatura elevada e alta umidade relativa. Não foram encontrados relatos de resistência genética em Psidium guajava à bactéria, e as medidas de controle recomendadas são o corte e a destruição de ramos atacados. Deve-se evitar poda ou colheita quando a planta estiver umedecida e recomenda-se a pulverização com cúpricos após as podas e a partir da floração (Ribeiro et al., 1985). Essa estratégia, entretanto, não tem garantido um controle da doença (Romeiro et al., 1994), levando-se em conta que o uso de cúpricos pode provocar fitotoxicidade em frutos jovens (25 a 35 mm de diâmetro), inviabilizando-os para a comercialização destinada ao mercado de frutas frescas (Goes et al., 2004).

 

 

Não há registros da ocorrência da bacteriose em outros países e, apesar da sua importância para a cultura da goiabeira no Brasil, não há estudos sobre sua biologia, características de distribuição e prevalência da doença nas áreas de cultivo. Os testes de patogenicidade existentes são longos e dispendiosos, considerando-se o tempo necessário à obtenção de mudas provenientes de sementes ou do enraizamento de estacas. E. psidii não sobrevive por muito tempo em cultura, sendo necessárias repicagens sucessivas que podem levar os isolados a perder a patogenicidade ou se tornarem atípicos.

Este trabalho foi realizado com os seguintes objetivos: a) investigar o efeito da temperatura sobre a multiplicação in vitro de E. psidii; b) avaliar a sobrevivência in vitro da bactéria em diferentes substratos; c) desenvolver um teste de patogenicidade prático e eficiente e, d) confirmar a dispersão da seca dos ponteiros da goiabeira no DF, gerando subsídios para as autoridades fitossanitárias locais, na tentativa de minimizar os efeitos negativos da bacteriose na cadeia produtiva da goiaba.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Levantamento para verificar a incidência de E. psidii no DF - Foi realizado levantamento em 19 propriedades rurais de Brazlândia (35 km de Brasília), no período de março a setembro/2001 (Tabela 1). As propriedades foram selecionadas em função de resultados negativos para a presença de E. psidii obtidos em 2000. Nessa região, os pomares de goiaba ocupam em média 2,5 ha e foram formados, em sua maioria, com mudas provenientes do Estado de São Paulo. As variedades mais comumente plantadas são: Paluma, Pedro Sato, Ogawa, Australiana e a "Vermelha Comum".

 

 

Os isolamentos foram realizados a partir de brotações e frutos com sintomas, por metodologia convencional. A identificação dos isolados foi feita através de testes fisiológicos, nutricionais e de patogenicidade. Uma lista mínima desses testes foi proposta, gerando um perfil que diferencia E. psidii das demais espécies do grupo (Tabela 2). Os isolados obtidos, após identificação, foram preservados em glicerol 20%, a -20 ºC.

 

 

Na segunda etapa (ano de 2002), a incidência da seca dos ponteiros foi avaliada pela correlação entre plantas sintomáticas e o isolamento da bactéria, verificando-se a proporção de plantas infectadas por propriedade. Foram avaliadas 17 propriedades (16.193 plantas), coletando-se amostras de até 20 plantas, com diferentes sintomas, por propriedade (Tabela 3). Após os isolamentos, colônias típicas da bactéria foram identificadas pelos testes nutricionais (Tabela 2) e sorológicos (Mendes et al., 2002).

 

 

Avaliação do efeito da temperatura sobre a multiplicação in vitro de E. psidii - Foi realizado ensaio em meio líquido (523 de Kado & Heskett, 1970), sob oito regimes de temperatura (15; 18; 21; 24; 27; 30; 33 e 36 ºC), com cinco repetições por tratamento. As temperaturas foram definidas visando a conhecer a faixa de multiplicação da bactéria e seus extremos. A população inicial foi aquela contida em 0,5 ml de suspensão bacteriana, a 106 ufc/ml, para 50 ml de meio líquido. A avaliação foi realizada após 16 horas de incubação sob agitação, a 140 rpm (Agitador PsycroTherm, New Brunswick Scientific Co., Inc.), em função do crescimento populacional da bactéria, medido pela absorbância (590 nm) do meio e pela contagem do número de colônias sobre meio sólido. A análise de variância foi realizada conforme delineamento inteiramente casualizado, e as médias, comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. Houve necessidade de se transformarem os dados [log(x+2], para ajustá-los à distribuição normal. Foi também efetuada a análise de resíduos, a fim de se verificarem eventuais valores discrepantes dentro dos tratamentos. O programa utilizado foi o SAS (SAS Institute, 1998).

Desenvolvimento do teste de patogenicidade para E. psidii - Hastes, com 20 cm de comprimento, foram destacadas da extremidade de galhos de plantas adultas e colocadas em frascos contendo água destilada, imergindo-se 5 a 8 cm da base das mesmas. As inoculações foram feitas na axila de uma das folhas do último par completamente expandido, depositando-se 10 µl de suspensão bacteriana, a 108 ufc/ml, sobre ferimento provocado por microagulha e de água destilada estéril na testemunha. O conjunto foi coberto com plástico transparente, por 48 h, para formação de câmara úmida, e o ensaio, mantido à temperatura e luminosidade ambientes, em laboratório. A evolução dos sintomas foi observada diariamente.

Metodologia similar foi avaliada em folhas destacadas do último par completamente expandido, as quais foram acondicionadas em frascos de vidro (5 cm de diâmetro x 12 cm de altura), contendo camada de 1,0 cm de agar-água, ou em placas de Petri de 9,0 x 2,0 cm com o mesmo meio. Em ambos os casos, o pecíolo das folhas foi levemente forçado a perfurar o meio. As inoculações foram feitas por ferimento com microagulha seguida de depósito de suspensão bacteriana (condições descritas acima), ou por ferimento com palito contendo massa bacteriana. Inoculações com água destilada estéril foram feitas como controle. O ensaio foi mantido nas mesmas condições acima descritas. Foi realizado reisolamento sete dias depois da inoculação, em ambas as situações.

Avaliação da sobrevivência in vitro de E. psidii em dois substratos - A preservação em água destilada estéril foi comparada com o meio de cultura 523, para a manutenção dos isolados a curto prazo. Culturas dos isolados Emb.A18-7 e IBSBF 435 de E. psidii foram repicadas para tubos com meio de cultura sólido (523) inclinado, incubadas em estufa a 28 ºC (±2), e a sobrevivência, avaliada por repicagem aos 5; 6; 10; 15 e 20 dias. Suspensões dos mesmos isolados em água destilada estéril, na concentração de 2,0x107 ufc/ml, foram distribuídas em microtubos (1,5 ml por tubo), que foram mantidos à temperatura ambiente e avaliados aos 30, 60, 90 e 120 dias, em função da observação visual de crescimento bacteriano, com quatro repetições por tratamento.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Incidência de E. psidii no DF - Considerando-se o diagnóstico positivo quando os isolados apresentaram perfil idêntico ao esperado para a espécie E. psidii (Tabela 2), foi confirmada a presença do patógeno em 10 das 19 propriedades inspecionadas em 2001 (52,6%). Levando-se em conta esse resultado e o levantamento realizado em 2000 pela Secretaria de Agricultura e Universidade de Brasília (Uesugi et al., 2001), estima-se em 56% a taxa de pomares infectados em Brazlândia-DF. A presença da bacteriose em pomares que se apresentaram sadios no levantamento do ano anterior, pode ser resultado da introdução do patógeno na região através de mudas contaminadas. É necessário também considerar a possibilidade da dispersão entre pomares, pois os produtores utilizam maquinário em comum. Outras formas possíveis de transmissão da bactéria ainda não foram investigadas, como a transmissão por insetos vetores, ventos, granizo, entre outros.

Na segunda etapa de avaliação, foi verificada a proporção de plantas infectadas nos pomares, pela correlação entre plantas sintomáticas e o isolamento da bactéria. Os resultados indicaram que, de 309 plantas coletadas, 290 apresentaram frutos mumificados, das quais 242 (83,4%) resultaram em diagnóstico laboratorial positivo; 289 plantas apresentaram seca de ponteiros, com 239 (82,7%) de diagnóstico positivo; em 99 das plantas, havia necrose de nervuras, das quais 79 (79,8%) resultaram em diagnóstico positivo. Das 88 plantas que apresentaram os três sintomas concomitantemente, foi identificada a presença de E. psidii em 72 (81,9%) das mesmas (Tabela 3). A discrepância entre esses dois parâmetros pode ser devida ao fato de que alguns sintomas podem ser confundidos com descolorações naturais da planta ou deformações de natureza diversa à doença (Coelho et al., 2002). Pode também haver escape nos procedimentos de isolamento da bactéria, que é dependente da quantidade de células-alvo presentes na amostra (Lepoivre, 2003). Entretanto, mesmo havendo sintomas semelhantes aos da bacteriose causados por outros fatores, o isolamento em meio de cultura permite diagnosticar a situação dos pomares em relação à seca dos ponteiros com nível de segurança de 81,9%. Esse resultado também indica a necessidade do desenvolvimento de métodos mais sensíveis, que permitam o monitoramento preciso da dispersão de E. psidii numa determinada região.

Efeito da temperatura sobre o desenvolvimento in vitro de E. psidii – Nas condições do experimento, E. psidii foi capaz de se multiplicar, in vitro, numa ampla faixa de temperatura. A 33 ºC, a população bacteriana passou de um patamar inicial de 103 ufc/ml para 108 ufc/ml, em 16 horas (Figura 2), resultado que diferiu significativamente dos demais, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. Não houve diferença significativa entre as médias obtidas a 24; 27 e 30 ºC, sendo que esse grupo também diferiu significativamente das temperaturas a 15; 18; 21 e 36 ºC, nas quais o crescimento populacional foi menor (Figura 2). A 15 ºC e 36 ºC, não houve crescimento bacteriano detectável pela espectrofotometria, embora as células permanecessem viáveis após o período de incubação, pois foi possível contar a população em meio sólido. A pequena multiplicação da bactéria a 36 ºC coincide com os dados apresentados na descrição de E. psidii (Rodrigues Neto et al., 1987). Esses autores relatam que a bactéria não apresentou crescimento nessa temperatura. Por outro lado, considerando a presença da doença em regiões mais frias, será necessário realizar estudos de campo, pois a temperatura mais favorável para o crescimento bacteriano in vitro pode não ser necessariamente a mesma para a atividade bacteriana durante os processos de infecção e colonização da planta hospedeira.

 

 

Teste de patogenicidade para E. psidii em hastes e folhas destacadas - Houve reprodução de sintomas típicos da bacteriose tanto na inoculação em hastes quanto em folhas destacadas, provenientes de plantas adultas. Nas hastes, os sintomas evoluíram a partir do ponto de inoculação, causando o enegrecimento de nervuras e, posteriormente, do limbo das folhas, a morte dos ponteiros e exsudação bacteriana muito freqüente (Figura 3A). A evolução dos sintomas nas folhas foi semelhante e não houve alteração nas testemunhas inoculadas com água estéril (Figura 3B1 e B2). As culturas obtidas nos reisolamentos foram submetidas aos testes bioquímicos estabelecidos (Tabela 2) e responderam aos resultados esperados. Considera-se que esse tipo de teste atenda à finalidade de avaliar a patogenicidade de isolados, embora alguns autores não considerem o uso de partes destacadas das plantas como um teste de patogenicidade, pela hipótese de que organismos saprófitas possam interferir nos resultados (Romeiro, 2001). Entretanto, em diversas situações, diferentes órgãos vegetais têm sido utilizados para essa finalidade, como vagens imaturas de feijão para avaliar a patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola e P. syringae pv. syringae, podendo-se inclusive observar diferenças nos sintomas causados individualmente pelas bactérias (Marques et al., 2000); folhas destacadas de fortuna (Kalanchoe tubiflora) para Agrobacterium tumefaciens (Romeiro et al., 1999); frutos imaturos de maçã ou pêra para Erwinia amylovora; frutos de nozes para X. campestris pv. juglandis; frutos verdes de pepino para P. syringae pv. lachrymans (Lelliot & Stead, 1987), e pecíolos de folhas de melão para Acidovorax avenae subsp. citrulli (Melo et al., 2003).

 

 

Sobrevivência in vitro de E. psidii - A sobrevivência de E. psidii em meio de cultura foi menor que 10 dias, sendo que, aos seis dias, havia células viáveis em três e quatro das cinco repetições, para os isolados Ibsbf 435 e Emb.A18-7, respectivamente. Aos dez dias, já não foram identificadas células viáveis. Em suspensão aquosa, células de E. psidii permaneceram viáveis por até 120 dias, sendo necessário continuar o experimento por um período mais longo. Tem sido observado que o tempo de sobrevivência é variável entre as espécies bacterianas, o que também depende do método escolhido (Lelliot & Stead, 1987). A preservação em suspensão aquosa é um método muito utilizado para Ralstonia solanacearum, que perde facilmente a patogenicidade sob outras formas (Hayward, 1964).

 

CONCLUSÕES

1- A seca dos ponteiros da goiabeira encontra-se amplamente distribuída na principal região produtora de goiaba do Distrito Federal.

2 - A faixa de temperatura favorável para a multiplicação in vitro de E. psidii encontra-se entre 24 e 33 ºC.

3- A patogenicidade de isolados pode ser confirmada através da inoculação em hastes e folhas destacadas de plantas adultas.

4- A preservação de E. psidii pode ser feita na forma de suspensão em água destilada estéril, à temperatura ambiente por até 120 dias.

 

AGRADECIMENTOS

A Sérgio Eustáquio de Noronha, pela montagem do mapa, e a Wesley Rodrigues de Souza, pela edição das imagens. Aos engenheiros agrônomos da Emater-DF, Marcelo Pereira, Escritório de Brazlândia e Paulo César Tarchetti, Escritório de Alexandre Gusmão-Incra 8; Álvaro E. Caldas Filho, Thomé L. Guth e estagiários da Secretaria de Agricultura do DF, pelo auxílio na coleta das amostras, facilitando o contato com os produtores. A Eduardo Leonardecz Neto e Maria Aldete J. da Fonseca Ferreira, pelo auxílio na análise estatística.

 

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Recebido em 04-10-2006. Aceito para publicação em 13-07-2007.

 

 

1 (Trabalho 153-06).

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