Identificação molecular da uva 'Goethe' de Urussanga - SC por marcadores microssatélites

Molecular identification of the grapevine 'Goethe' from Urussanga (SC) with microsatellite markers

ARTIGOS

GENÉTICA E MELHORAMENTO

Identificação molecular da uva 'Goethe' de Urussanga - SC por marcadores microssatélites¹

Molecular identification of the grapevine 'Goethe' from Urussanga (SC) with microsatellite markers

Mariane Ruzza Schuck^I; Flavia Maia Moreira^II; José Afonso Voltolini^III; Miguel Pedro Guerra^III; Maria Stella Grando^II; Aparecido Lima da Silva^III

^IDoutoranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia - Produção Vegetal. Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, SCA/Universidade Federal do Paraná, Rua dos Funcionários, 1540 , Juvevê, Caixa Postal 19061, 80035-050, Curitiba, PR, Brasil - [e-mail]

^IIPesquisadoras da Fondazione Edmund Mach - Istituto Agrario di San Michele all'Adige, via E. Mach 1, 38010 San Michele a/A, TN, Italia - [e-mail]; [e-mail]

^IIIProfessores e Pesquisadores do Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais. Departamento de Fitotecnia, CCA/Universidade Federal de Santa Catarina, Rodovia Admar Gonzaga, 1346, Caixa Postal 476, 88040-900, Florianópolis, SC, Brasil. - [e-mail], [e-mail], [e-mail]

RESUMO

A variedade Goethe é símbolo da vitivinicultura da região de Urussanga, sul do Estado de Santa Catarina, a qual, atualmente, busca a Indicação Geográfica da Uva e do Vinho Goethe. Para isto, um dos requisitos necessários é a identificação precisa do material genético. Os marcadores microssatélites constituem a ferramenta molecular mais utilizada para a identificação varietal de videira em todo o mundo e têm a capacidade de produzir um perfil genético único para cada material vitícola. O objetivo deste trabalho foi caracterizar duas seleções de uva 'Goethe', presentes no município de Urussanga, por meio de marcadores moleculares microssatélites, visando a atender aos requisitos de denominação de origem e indicação de procedência controlada. A extração do DNA genômico foi realizada a partir de folhas jovens e ramos de nove acessos de cada seleção de 'Goethe Classica' e 'Goethe Primo' provenientes de uma coleção pública e de oito coleções privadas da região de Urussanga. Dez loci microssatélites VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62, VrZAG79, VVMD25, VVMD28, VVMD31 e VVMD32 foram genotipados através de eletroforese capilar. As análises realizadas mostraram que as duas variantes da uva 'Goethe' apresentaram um perfil molecular idêntico e único, isto é, representam a mesma variedade e sem nenhuma correspondência com variedades descritas anteriormente na literatura e nos bancos de dados consultados. As diferenças fenotípicas observadas provavelmente são devidas a mutações somáticas em regiões funcionais do genoma, fenômeno que dá origem aos clones em videira.

Termos para indexação:Vitis, identificação varietal, marcadores microssatélites, variabilidade intravarietal.

ABSTRACT

'Goethe' grape is a symbol of the viticulture of Urussanga region, South of Santa Catarina State, which is currently claiming the geographical indication of the grape and wine Goethe. Microsatellite markers are the biotechnological tool most used for molecular identification of grapevine varieties worldwide. These markers have the potential of generate unique DNA profiles for all the diverse grape genotypes. The aim of this work was to characterize two selections of the grapevine 'Goethe' from Urussanga, using microsatellite markers. Genomic DNA was extracted from young leaves and branches of nine accessions of each selection "Goethe Clássica and 'Goethe Primo' maintained at one public and eight private collections of Urussanga. Ten microsatellite loci VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62, VrZAG79, VVMD25, VVMD28, VVMD31 and VVMD32 were genotyped by capillary electrophoresis. Results showed that the two variants of 'Goethe' have an identical molecular profile which doesn't match any other DNA profile of grapevines previously described in literature or available in databases. The phenotypic differences observed are probably due to somatic mutations in functional regions of the genome, a phenomenon which leads to the creation of clones in grape.

Index terms:Vitis, identification of cultivars, microsatellite markers, intravarietal variability.

INTRODUÇÃO

O município de Urussanga, localizado na região sul-catarinense, é o berço de desenvolvimento da uva 'Goethe'. Esta foi trazida pelo advogado Giuseppe Caruso Mac Donald, dos EUA, no início do século XX, ao município de Urussanga, onde se adaptou perfeitamente as condições climáticas locais (MARIOT, 2002). Nesta região, duas variantes de 'Goethe' são tradicionalmente cultivadas pelos produtores: a 'Goethe Clássica' e a 'Goethe Primo', que se diferenciam, principalmente, pela cor da baga e acidez do mosto e do vinho.

A importância desta variedade reside na qualidade do vinho produzido, que exprime o máximo do "terroir" e agrega origem, cultura e "savoir-faire". Neste sentido, os produtores desta região estabeleceram parcerias com o SEBRAE-SC, UFSC e EPAGRI para implementar a denominação de origem e solicitação da Indicação Geográfica.

Um dos requisitos para se obter a denominação de origem e indicação geográfica de procedência controlada é a identificação precisa da variedade envolvida. Esta é uma necessidade concreta do setor, mas nem sempre de simples solução. A difusão por séculos de genótipos de videira em diferentes ambientes e condições culturais faz com que o reconhecimento varietal seja um processo muito complexo. Atualmente, estima-se que a coleção mundial de Vitis spp. compreenda cerca de 10.000 variedades, com mais de 25.000 nomes diferentes em uso (ALLEWELDT; DETTWEILER, 1992).

A identificação das variedades de videira tem sido tradicionalmente baseada na ampelografia, que é a análise e a comparação de características morfológicas das folhas, ramos, cachos e bagas (ANONYMOUS, 2003). Entretanto, a expressão destas características é influenciada por fatores ambientais e pela biologia individual da planta. Além disso, algumas variedades geneticamente próximas são morfologicamente muito similares e difíceis de diferenciar mediante comparação botânica.

O uso de marcadores ao nível de DNA na distinção de variedades oferece muitas vantagens em relação aos estudos baseados na morfologia ou composição dos frutos por não serem influenciados pelo ambiente, estado sanitário ou estágio de desenvolvimento da planta (SEFC et al., 2001).

Os diferentes marcadores hoje disponíveis diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar a variabilidade do DNA. Os marcadores microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeats), desde a década de 90, são preferencialmente utilizados como descritores moleculares em videira. A utilidade destes na identificação e na caracterização de variedades-copa e porta-enxerto, na avaliação da variabilidade genética, em estudos de pedigree e mapeamento genético já foi amplamente demonstrada (BOWERS et al., 1999a; COSTANTINI et al., 2005; DOLIGEZ et al., 2006). Além disso, a genotipagem das plantas de videira com marcadores SSRs permite o estabelecimento de perfis identificativos e o desenvolvimento de bancos de referência para as variedades (DETTWEILLER et al., 1998; LEFORT; ROUBELAKIS-ANGELAKIS, 2000; GRANDO et al., 2002). O acesso aos bancos de dados permite que as informações sejam compartilhadas, contribuindo significativamentecom os esforços internacionais para a correta identificação do germoplasma vitícola.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar geneticamente as variedades Goethe Primo e Goethe Clássica presentes no município de Urussanga por meio de marcadores moleculares microssatélites (SSRs), visando a atender a requisitos de denominações de origem e indicações de procedência controladas.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram coletadas folhas jovens e ramos de nove acessos de cada seleção de 'Goethe Classica' e 'Goethe Primo' provenientes de uma coleção pública (Empresa de Pesquisa Agropecuária de Santa Catarina - EPAGRI) e de oito coleções privadas (Vinhos Quarezemim, Vinícola Irmãos Felippe, Vinhos Trevisol, Vinícola Mazzuco, Vinícola Mazon, Vitivinícola Urussanga, Marcio Scremin e Moacir Possamai) do município de Urussanga (28°31'04''S 49°19'15''W, a 48 metros de altitude).

A extração de DNA do material vegetal foi realizada de acordo com o método de Doyle e Doyle (1990) com as seguintes modificações: foi macerado material vegetal liofilizado ao invés de material fresco e foi adicionado RNAse ao isopropanol durante a fase de precipitação do DNA. A quantificação do DNA extraído foi feita em gel de agarose (0,8%), tendo como padrão o DNA fago λ, nas concentrações de 20; 50; 100 e 200 ng/μl, e sucessivamente, as amostras foram diluídas para concentração de 20 ng/μl. Esta etapa do projeto foi realizada no Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal (UFSC).

No sentido de facilitar a comparação com os dados da literatura e com os bancos de dados internacionais, as amostras foram genotipadas com os dez loci microssatélites mais difundidos pela comunidade científica internacional: VVS2 (Thomas e Scott, 1993), VVMD27 (BOWERS et al., 1996), VVMD5, VVMD7, VVMD25, VVMD28, VVMD31, VVMD32 (BOWERS et al., 1999b), VrZAG62 e VrZAG79 (SEFC et al., 1999) (Tabela 1).

A reação de amplificação foi preparada segundo Moreira (2006) com um volume final de 12.5μl, contendo 25mM de cada dNTP, 0.5mM de cada primer, 0.5U Taq DNA polimerase (GoldTaq - Applied Biosystems ou BioTaq - Bioline), 1X solução de buffer, 1.5mM MgCl₂ e 20ng de DNA genômico para cada amostra. O programa utilizado para reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi: (i) desnaturação do DNA e ativação da Taq DNA polimerase a 95°C, por 7 minutos (GoldTaq) ou 3 minutos (BioTaq); (ii) 35 ciclos de amplificação distribuídos em 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 50°C (VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 and VrZAG79) ou 56°C (VVMD25, VVMD28, VVMD31 and VVMD32), 1 minuto e 30 segundos a 72°C; (iii) extensão final de 7 minutos a 72°C, e (iv) resfriamento a 4°C.

Para a definição do tamanho dos alelos nos loci microssatélites, foi utilizada a eletroforese capilar. A separação dos fragmentos microssatélites foi realizada utilizando um sequenciador ABI 3100 e o software GeneScan 3.7 (Applied Biosystems). A disponibilidade de primers marcados com diferentes fluorescências (HEX ou FAM) permitiu carregar em multiplex o produto derivado de diferentes reações PCR (Figura 1). O processamento dos dados produzidos pelo sequenciador foi feito com o programa Genotyper 3.7 (Applied Biosystems). Todas as análises foram realizadas utilizando o DNA da variedade Chardonnay como referência, tanto da qualidade de amplificação como do tamanho dos alelos, permitindo a comparação destes dados com aqueles disponíveis na literatura e nos bancos de dados internacionais. Esta etapa do projeto foi realizada no Laboratório de Genética Molecular da Fundação Edmund Mach - Instituto Agrario di San Michele all'Adige (FEM - IASMA, Itália).

Os perfis moleculares obtidos foram comparados com: (a) banco de dados online (Grape Microsatellite Collection (GMC) - http://www.ismaa.it/aerabioav/gmc.html; Greek Vitis Database - (GVD) http://www.biology.uch.gr/gvd; Swiss Vitis Microsatellite Database (SVMD) - http://www.unine.ch/nccr/svmd; e GENRO (http://www.genres.de/eccdb/vitis/); (b) com dados da literatura, e (c) dados dos Estados Unidos, Suíça, Itália, Turquia, Armênia e Geórgia (Vouillamoz, dados não publicados). Os últimos bancos de dados citados (c) contêm atualmente detalhes de microssatélites de mais de 2.000 variedades de uva, correspondendo a aproximadamente 1.500 variedades diferentes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise dos dez loci microssatélites revelou que as duas seleções da variedade Goethe apresentam perfil molecular idêntico (Tabela 2), ou seja, correspondem à mesma variedade, apesar das evidentes diferenças entre elas, como a coloração da epiderme da baga e a acidez total (mosto e vinho). Neste caso, provavelmente, a variedade Goethe Clássica sofreu uma mutação, dando origem ao clone 'Goethe Primo' (Figura 1). Esta afirmação é sustentada por dados históricos, onde a comparação da 'Goethe Clássica', encontrada em Urussanga, com a uva 'Goethe', encontrada nos bancos de dados ampelográficos (Mariot, 2002), revela que ambas possuem a coloração das bagas rosáceas, enquanto a 'Goethe Primo' possui a baga de cor branca.

Diversas mutações deste tipo foram encontradas no germoplasma vitícola catarinense, como, por exemplo, a 'Niágara Branca', que difere da 'Niágara Rosada' pela coloração das bagas, a 'Grano d'Oro', que difere da 'Bordô' pelo vigor e produtividade, a 'Isabel Precoce', que se diferencia da 'Isabel' pelo menor ciclo, e a uva 'Itália', com suas diferentes mutações de coloração das bagas, como a 'Rubi', 'Benitaka', 'Red Meire' e 'Brasil' (Schuck et al., 2009).

Segundo alguns autores (Vignani et al., 1996; Franks et al., 2002; Riaz et al., 2002; Walker et al., 2006), os clones intravarietais podem diferir fenotipicamente entre si em diversos aspectos, como caracteres morfológicos, aspectos fenológicos, vigor, potencial de produção e qualidade, mesmo que tenham perfis de DNA praticamente idênticos. Isto ocorre porque poucos marcadores de DNA, e especialmente os microssatélites que são localizados principalmente em regiões anônimas do genoma (não codificantes), são capazes de distinguir variantes de uma mesma variedade (Sefc et al., 1998; Lopes et al., 1999; Crespan et al., 2001; Martín et al., 2003; Ibãnéz et al., 2003; Zulini et al., 2005). Essas variantes, referidas comumente como mutações somáticas, geralmente ocorrem em regiões funcionais do genoma chamadas codificantes.

Além disso, variações clonais são difíceis de serem caracterizadas pela análise de alguns loci microssatélites, mas a extensão no número de marcadores utilizados na genotipagem aumenta a chance de se encontrar clones mutantes. Isto foi demonstrado por Riaz et al. (2002), que encontraram diferenças dentro de clones de 'Pinot Noir' e 'Chardonnay', genotipando cem loci SSRs. Em nosso trabalho, utilizamos apenas dez loci microssatélites, que demonstraram ser um número insuficiente para caracterizar variações clonais. Os marcadores moleculares AFLPs, embora menos repetíveis, podem ser úteis na distinção clonal, como foi demonstrado recentemente (Cervera et al., 1998; Scott et al., 2000; Bellin et al., 2001; Zulini et al., 2005).

A comparação do perfil molecular microssatélite obtido para as variedades Goethe Clássica e Goethe Primo com os dados disponíveis na literatura e nos bancos de dados internacionais consultados não revelou nenhuma correspondência varietal para a uva 'Goethe' cultivada em Urussanga, nem mesmo com outros acessos com o mesmo nome, significando que se trata de um genótipo único, nunca descrito anteriormente.

A identificação e a descrição do perfil molecular único da uva 'Goethe' de Urussanga revelada neste trabalho são aspectos importantes para a viticultura local, visto que hoje esta variedade reivindica a primeira Indicação Geográfica de Santa Catarina. O aprofundamento deste estudo com o auxílio de outros tipos de marcadores moleculares poderá melhor explicar a variabilidade observada na uva 'Goethe', assim como sua expressão nesta região.

CONCLUSÕES

1- As análises moleculares realizadas em todos os acessos de 'Goethe Clássica' e 'Goethe Primo' coletados mostraram que esses correspondem a uma única variedade de videira.

2- As diferenças fenotípicas observadas entre as seleções de uva 'Goethe Clássica' e 'Goethe Primo' não correspondem a diferenças genotípicas nos dez loci microssatélites utilizados neste estudo e, provavelmente, se devem a mutações genéticas não detectadas por esses marcadores.

3- A existência de um perfil molecular único confirma a importância e o potencial da uva 'Goethe' para a viticultura catarinense.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao projeto PROGOETHE, pelo apoio financeiro; à CAPES, pela concessão da bolsa de estudos a Mariane Schuck; à UFSC; à EPAGRI; à CIDASC; a Província Autônoma de Trento e à Fundação Edmund Mach - Instituto Agrario di San Michele all'Adige (FEM/IASMA). Um especial agradecimento a José Vouillamoz (Universidade de Neuchâtel, CH), pelo auxílio na análise dos perfis moleculares.

Recebido em: 29-06-2009.

Aceito para publicação em: 28-01-2009.

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Trabalho 160-09. Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Set 2010
• Data do Fascículo
  Set 2010

Histórico

• Recebido
  29 Jun 2009
• Aceito
  28 Jan 2009