Uso de antibióticos para o controle de bactérias endógenas visando à micropropagação da figueira

Use of antibiotics for the control of endogenous bacteria aiming the micropropagation of fig trees

PROPAGAÇÃO

Uso de antibióticos para o controle de bactérias endógenas visando à micropropagação da figueira¹

Use of antibiotics for the control of endogenous bacteria aiming the micropropagation of fig trees

Ednamar Gabriela Palú^I; Luiz de Souza Corrêa^II; Aline Namie Suzuki^III; Aparecida Conceição Boliani^IV

^IEngª.-Agrª., Ms., Doutoranda em Agronomia UNESP, Campus de Ilha Solteira - SP, E-mail: [e-mail]

^IIEngº. Agrº., Dr., prof. do Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Sócio Economia/UNESP, Campus de Ilha Solteira -SP, E-mail: [e-mail]

^IIIGraduanda em Agronomia UNESP, Campus de Ilha Solteira - SP, E-mail: [e-mail]

^IVEngª.Agrª., Dra., profa. do Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Sócio Economia/UNESP, Campus de Ilha Solteira -SP, E-mail: [e-mail]

RESUMO

A descontaminação dos explantes é um dos princípios básicos para o sucesso da cultura de tecidos. Um dos problemas diagnosticados na propagação in vitro da figueira, através de gemas apicais, é a contaminação endógena dos explantes por bactérias. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de alguns antibióticos em meio de cultura para o controle de bactérias endógenas em gemas apicais de figueira. Foram avaliados os seguintes tratamentos: T₁(sem adição de antibiótico); T₂ (30 mg L^-1 de cloranfenicol); T₃ (250 mg L^-1 de ampicilina sódica); T₄ (500 mg L^-1 de ácido nalidícico); T₅ (150 mg L^-1 de cefalotina sódica); T₆ (500 mg L^-1 de tetraciclina), e T₇ (400 mg L^-1 de norfloxacina). Após coletados em campo, os segmentos de ramos contendo as gemas foram colocados em recipiente com água corrente. Posteriormente, as gemas apicais foram imersas em álcool etílico a 70% e hipoclorito de sódio a 2,5%. Todo procedimento de desinfestação externa dos explantes foi realizado em câmara de fluxo laminar. Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio básico MS suplementado, após a autoclavagem, com as doses de antibióticos de acordo com os tratamentos estabelecidos. Após a inoculação, os explantes foram mantidos em sala de crescimento por quatro dias no escuro e, em seguida, sob fotoperíodo de 16 horas de luz branca fria e irradiância de 25 µmol m s^-1, na temperatura de 22 ± 3ºC. A assepsia realizada externamente nos explantes foi suficiente para o controle de contaminação fúngica, e a adição de antibióticos ao meio, após autoclavagem, foi eficiente para o controle de bactérias endógenas, cujo antibiótico ampicilina sódica proporcionou mais de 90% de explantes sobreviventes.

Termos para indexação:Ficus carica L., gema apical, assepsia, in vitro.

ABSTRACT

The explants decontamination is one of the basic principles for the success of Tissue Culture. One of the problems diagnosed in vitro propagation using fig shoot tips is the endogenous contamination of the explants by bacteria. This study aimed to verify the efficiency of the addition of some antibiotics to the culture medium to control potential endogenous bacteria in fig apical buds. It was evaluated the following antibiotics added to the culture medium: T₁ (without antibiotic), T₂ (30 mg L^-1 of chloramphenicol), T₃ (250 mg L^-1 of ampicillin sodium), T₄ (500 mg L^-1 of nalidicic acid), T₅ (150 mg L^-1 of cephalothin sodium), T₆ (500 mg L^-1 of tetracycline) and T₇ (400 mg L^-1 of norfloxacin). Once collected in the field the segments of branches containing the gems were placed in a container with water and subsequently, the apical buds were immersed in 70% ethyl alcohol and sodium hypochlorite 2.5%. All external disinfection procedure of the explants was conducted in a laminar flow chamber. The explants were inoculated in test tubes containing 15 mL of enriched MS basal medium and with doses of antibiotics according to pre-established treatments. After inoculation, the explants were kept in a growth chamber for four days in the dark and then under photoperiods of 16 hours of cold white light and irradiance of 25 µmol m s^-1 at 22 ± 3 º C. The results showed that the explants external disinfection was sufficient to control fungal contamination and the addition of antibiotics to the medium after autoclaving was effective to control of endogenous bacteria. The best result was obtained with the antibiotic ampicillin sodium which provided more than 90% of survivor explants.

Index terms:Ficus carica L., apical buds, aseptic, in vitro.

INTRODUÇÃO

O Brasil destaca-se como o maior produtor de figo da América do Sul, ocupa a 11ª colocação entre os principais produtores mundiais e é o segundo exportador de figo in natura no mundo, superado apenas pela Turquia (FOOD AGRICULTURAL ORGANIZATION, 2008).

A estaquia é o método de propagação mais utilizado na cultura da figueira (Ficus carica L.) (FACHINELLO et al., 2005). Mesmo proporcionando elevados percentuais de enraizamento, a estaquia acarreta intenso uso de mão de obra, contribuindo para a elevação do custo da muda, além de disseminar patógenos, como vírus, fungos e nematoides, reduzindo a qualidade final da muda.

A utilização de mudas de alta qualidade é um dos requisitos mais importantes para implantação de pomares com maior longevidade e elevada produtividade. Em pomares comerciais, deve-se buscar uniformidade de plantas e principalmente dos frutos, de modo que eles estejam embasados em plantas originadas por processos vegetativos, sendo que um deles pode ser a micropropagação (MANICA et al., 2003).

A propagação in vitro pode auxiliar na produção eficiente de mudas de figueira com alta qualidade fitossanitária e genética. De acordo com Paiva (1998), esta técnica vem sendo aplicada com sucesso para obtenção de mudas sadias em grande número de espécies economicamente importantes ou com dificuldades de propagação, realizando avanços importantes nas áreas de genética, fisiologia e fitopatologia. No entanto, para a cultura da figueira, são escassos os trabalhos realizados in vitro, conhecendo-se pouco sobre o comportamento da planta, e principalmente como é realizado o estabelecimento desta. Gerra e Costa (1987) e Barbosa et al. (1992) relatam que a planta é estabelecida in vitro através da inoculação de meristemas ao meio de cultura, mas nenhum dos autores cita a percentagem de explantes sobreviventes após a inoculação. Brum (2001) e Fráguas (2003) descrevem sobre a micropropagação da figueira, mas em ambos os trabalhos realizados pelos autores utilizam-se plantas já estabelecidas in vitro.

Na cultura de tecidos, são essenciais o controle e a prevenção da contaminação microbiana, pois o meio de cultura proporciona um ambiente favorável para o crescimento de microrganismos, como bactérias, leveduras e fungos (DANTAS et al., 2002), constituindo-se nas principais causas de perdas de material vegetal.

Um dos problemas da micropropagação da figueira através de gemas apicais é a alta taxa de contaminação, principalmente por bactérias endógenas. Os contaminantes, especialmente as bactérias endógenas, impõem consideráveis limitações mesmo na fase de introdução in vitro. Quando a contaminação por microrganismos é exógena, a possibilidade de controle dos principais agentes contaminantes (fungos e bactérias) é considerável. Quando a contaminação é endógena, as consequências podem ser limitantes, podendo haver perda de tempo, de recursos financeiros e de material genético (SOUZA et al., 2006). Os antibióticos usados para o controle de bactérias podem possuir ação bacteriostática, e não bactericida, serem fitotóxicos e favorecerem alterações nas respostas morfogenéticas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990).

Diversas pesquisas têm sido realizadas para a prevenção ou eliminação dos contaminantes do cultivo in vitro de plantas, desde o desenvolvimento de protocolos de assepsia, cuidados com as plantas-matrizes, até o uso de produtos antimicrobianos, adicionados ao meio de cultura (PEREIRA et al., 2009). Biasi (1995) testou a adição, ao meio de cultura, de diferentes doses dos antibióticos ácido nalíxico, cloranfenicol e estreptomicina, para o controle in vitro de bactérias, em segmentos nodais e discos foliares de abacateiro. Pereira et al. (2003) observaram que a adição dos antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina e tetraciclina, em concentrações que variam de 32 a 256 mg L ^-1, inibem o crescimento de bactérias contaminantes na cultura de tecidos da batata (Solanum tuberosum L.).

Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência da descontaminação de gemas apicais de figueira, utilizando-se de diferentes antibióticos, para seu estabelecimento in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia pertencente à Faculdade de Engenharia da UNESP - Câmpus de Ilha Solteira - SP, em maio de 2009. Foram utilizadas gemas apicais de figueira cv. Roxo de Valinhos, seleção Gigante, procedentes da coleção do campo experimental da Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da Faculdade de Engenharia da UNESP - Câmpus de Ilha Solteira, localizada em Selvíria – MS.

O experimento foi constituído da adição de antibióticos ao meio de cultura. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com sete tratamentos, cinco repetições e sete gemas por repetição. Os tratamentos foram: T₁ (sem adição de antibiótico); T₂ (30 mg L^-1 de cloranfenicol); T₃ (250 mg L^-1 de ampicilina sódica); T₄ (500 mg L^-1 de ácido nalidícico); T₅ (150 mg L^-1 de cefalotina sódica); T₆ (500 mg L^-1 de tetraciclina), e T₇ (400 mg L^-1 de norfloxacina). Os antibióticos e as doses testadas foram estabelecidos de acordo com os trabalhos de Pereira et al. (2003), Pereira e Fortes (2003), Donato et al. (2005) e Naue et al. (2007).

O meio de cultura utilizado foi o MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com 20 g L^-1 de sacarose e 7,0 g L^-1 de ágar, com pH ajustado para 5,7 ± 0,1, antes da autoclavagem a 120 ºC com 1 Kgf cm^-2, durante vinte minutos. As doses dos antibióticos correspondentes aos tratamentos foram adicionadas ao meio de cultura após a autoclavagem, dentro da câmara de fluxo laminar, e em seguida foram vertidos 15 mL do meio nutritivo em tubos de ensaio.

Após coletados em campo, os segmentos de ramos contendo as gemas foram colocados em recipiente com água corrente. Em seguida, as gemas apicais foram seccionadas com bisturi esterilizado, permitindo assim a redução de seu tamanho. Para desinfestação superficial dos explantes, eles foram submetidos a um protocolo previamente estabelecido, realizado fora da câmara de fluxo laminar. Neste caso, foram realizadas as seguintes etapas: 1º) os explantes foram imersos em etanol a 70% durante 1 minuto, lavados 3 vezes com água destilada autoclavada; 2º) imersos em uma solução de 2 g L^-1 de methiltiofan (fungicida) + 250 mg L^-1 de cloranfenicol (antibiótico) durante 5 minutos e lavados 3 vezes com água destilada autoclavada; 3º) na sequência, os explantes foram imersos durante 5 minutos em 250 mg L^-1 de ácido cítrico + 250 mg L^-1 de ácido ascórbico, e 4º) imersos em hipoclorito de sódio (2,5% cloro ativo), sob agitação constante, durante 15 minutos, e sua lavagem foi realizada dentro da câmara de fluxo laminar, em condições assépticas, onde as gemas foram inoculadas ao meio de cultura com os respectivos tratamentos. A fase de estabelecimento foi realizada em sala de crescimento com temperatura 22 ± 3 ºC, sendo mantidas durante os quatro primeiros dias no escuro, e em seguida, em fotoperíodo de 16 horas de luz a uma intensidade luminosa de 30 µmol m^-2 s^-1. Os explantes foram avaliados trinta dias após a inoculação. As variáveis avaliadas foram: explantes contaminados por bactérias, oxidados e sobreviventes, cujos valores foram expressos em percentagem.

Os dados obtidos foram transformados em arco-seno de acordo com Banzatto e Kronka (2006), visando à análise de variância. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os contaminantes bacterianos manifestaram-se, nos quinze primeiros dias, na base dos explantes e no interior do meio de cultura. A bactéria que se desenvolveu na base dos explantes foi identificada como Serratia spp., pelo Laboratório de análises clínicas São Marcos, localizado no município de Ilha Solteira – SP. Segundo Anahory et al. (1998), espécies do gênero Serratia geralmente são isoladas de plantas, cogumelos, musgos, trato digestivo dos roedores (40% de pequenos mamíferos silvestres são portadores de Serratia sp.), insetos, água e solo. Uma das espécies conhecidas é a S. ficaria, que pode ser isolada de plantas e de insetos e é encontrada em um determinado nicho ecológico, pois está associada à figueira brava (F. glabra), à figueira cultivada e aos insetos que desempenham um papel importante na fertilização dessas plantas.

Não houve contaminação fúngica, provavelmente devido à eficiência da assepsia realizada nos explantes antes da inoculação destes ao meio de cultura. Kumar et al. (1998) também observaram 95% de eliminação de contaminantes fúngicos em gemas apicais de figueira, através da imersão das gemas em álcool a 70%, durante 30 segundos, e em seguida em hipoclorito de sódio a 1%, durante cinco minutos. Cid e Zimmermann (2006) relatam que o uso de compostos químicos, como hipoclorito de sódio, etanol e fungicidas nas doses e tempos certos, podem ser eficientes para o controle da contaminação fúngica em explantes coletados a campo.

Na Tabela 1, são apresentados os efeitos dos tratamentos na redução da contaminação bacteriana, na oxidação e sobrevivência dos explantes.

Para a variável percentagem de contaminação bacteriana, verificou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos T₁ (sem antibiótico) e T₅ (cefalotina sódica 150 mg L^-1), os quais propiciaram maior percentagem de contaminação (51,43% e 39,14%, respectivamente). Entre os demais tratamentos: T₂ (cloranfenicol 30 mg L^-1); T₃ (ampicilina sódica 250 mg L^-1); T₄ (ácido nalidíxico 500 mg L^-1); T₆ (tetraciclina 500 mg L^-1), e T₇ (norfloxacina 400 mg L^-1) também não houve diferença significativa (Tabela 1). Pereira et al. (2003), estudando bactérias endofíticas contaminantes da cultura in vitro da batata (Solanun tuberosum), observaram que entre doze antibióticos testados, seis apresentaram algum tipo de controle e, destes, os melhores resultados foram proporcionados pela ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina e tetraciclina.

Houve diferenças significativas entre os tratamentos em relação à percentagem de oxidação dos explantes, em que os tratamentos T₃ (ampicilina sódica 250 mg L^-1), T₁ (sem anibiótico) e T₅ (cefalotina sódica 150 mg L^-1) apresentaram as menores percentagens de oxidação, (0; 3,58 e 8,91%, respectivamente) (Tabela 1). A maior percentagem de explantes sobreviventes, após 30 dias de inoculação, ocorreu no tratamento T₃ (ampicilina sódica 250 mg L^-1), em que 90,69% dos explantes se mantiveram vivos e em desenvolvimento (Tabela 1).

Os dados obtidos estão de acordo com Pereira e Fortes (2003), que obtiveram os mesmos resultados com relação à toxicidade de antibióticos no cultivo in vitro de explantes de batatas e relatam que a adição de ampicilina sódica no meio de cultura não afetou a sobrevivência e o desenvolvimento dos explantes, mesmo nas mais altas concentrações. Houve cerca de 100% de sobrevivência dos explantes após 21 dias de cultivo, indicando não haver efeito fitotóxico deste antibiótico para esta cultura. As menores taxas de sobrevivência dos explantes ocorreram na presença de cloranfenicol e tetraciclina, concordando com o observado com os explantes de figueira.

Um dos fatores limitantes ao uso dos antibióticos adicionados ao meio nutritivo, juntamente com o explante, é a fitotoxidez dessas substâncias, principalmente devido ao uso comum de concentrações elevadas. Segundo Cid e Zimmermann (2006), os antibióticos podem afetar os processos sensíveis dentro da bactéria (síntese de proteína, ácidos nucléicos), e como a nível molecular estes processos são parecidos com os da célula vegetal, torna-se necessário ficar atento a problemas de fitotoxicidade, os quais também são uma decorrência da concentração usada.

A tetraciclina é um antibiótico de amplo espectro de ação, mesmo assim seu uso deve ser considerado restrito na cultura de tecidos, justamente pelo alto grau de fitotoxicidade (POLLOCK et al., 1983). A ação fitotóxica ocorre, principalmente, em virtude de distúrbios da síntese proteica e da ação inibitória na síntese de ARNs e ATPs, interferindo, desta forma, nos sistemas energéticos da planta (PRADO FILHO, 1975). De acordo com Pollock et al. (1983), há eficiência no controle de contaminações quando os tratamentos com este antibiótico são feitos durante curtos períodos.

Quanto à fitotoxicidade do cloranfenicol, pode ter ocorrido porque este antibiótico é inibidor da síntese proteica em plantas, podendo, em alguns casos, interferir no desenvolvimento de cloroplastos e mitocôndrias (LEIFERT et al., 1991).

Koneman et al. (2001) citam que antibióticos pertencentes ao grupo dos betalactanos, como a ampicilina e a carbenicilina, as cefalosporinas (cefotaxime, cefaloridine, cefalotina) e a rifampicina, são considerados antibióticos de amplo expectro, ativos contra bactérias gram-positivas e negativas, sendo também pouco ou não tóxicos aos cultivos in vitro. Fato esse que se deve, possivelmente, a sua ação sobre sítios específicos da parede celular bacteriana, os quais não ocorrem em células de plantas (POLLOCK et al. 1983).

CONCLUSÕES

1-A adição de antibiótico ao meio de cultura é necessária para o controle da contaminação bacteriana em gemas apicais de figueira.

2-A ampicilina sódica, na concentração de 250 mg.L^-1, inibe o crescimento de bactérias in vitro, após a inoculação de gemas apicais de figueira, proporcionando mais de 90% de explantes sobreviventes.

3-Nas dosagens testadas, os antibióticos clorofenicol, ácido nalidícico, tetracicliona e norfloxacina são fitotóxicos para gemas apicais de figueira.

Recebido em: 24-05-2010. Aceito para publicação em: 19-10-2010.

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1

(Trabalho 130-10). Parte da tese, apresentada pelo primeiro autor, a Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"(UNESP), campus de Ilha Solteira –SP, como um dos requisitos do curso de Doutorado em Agronomia, especialidade Sistemas de Produção.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Jul 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Recebido
  24 Maio 2010
• Aceito
  19 Out 2010