COMPORTAMENTO IN VITRO DE Chalara paradoxa,AGENTE CAUSAL DA PODRIDÃO-NEGRA DO ABACAXIZEIRO, EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO

BEHAVIOR IN VITRO OF CHALARA PARADOXA,CAUSAL AGENT OF PINEAPPLE BLACK ROT IN DIFFERENT GROWTH CONDITIONS

RESUMO

Na pós-colheita do abacaxizeiro, a podridão-negra é considerada como um dos principais problemas na comercialização dos frutos. A doença é causada pelo fungoChalara paradoxa (De Seynes) Sacc.. Apesar da importância deste patógeno para a cultura, são poucas as informações relacionadas ao estudo do mesmo, com base em características fisiológicas in vitro. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar o crescimento micelial, a esporulação e a germinação de C. paradoxa, em diferentes condições de cultivo. A partir de placas contendo colônias puras do isolado de C. paradoxa, foram retirados individualmente discos para inoculação em diferentes meios. A incubação das placas foi feita em três diferentes regimes de luminosidade e em três diferentes temperaturas. Para o crescimento micelial, esporulação e germinação, as melhores condições de cultivo in vitro de C. paradoxa foram os meios aveia (OA) e batata (PDA) em alternância luminosa a 25°C, os meios batata (PDA) e abacaxi (PJA) no escuro contínuo, na mesma temperatura.

Termos para indexação
Ananas comosus L; crescimento micelial; esporulação; germinação

ABSTRACT

In pineapple postharvest, black rot disease is considered as the main problem of fruits trade. The disease is caused by the fungus Chalara paradoxa (De Seynes) Sacc.. Despite the importance of this pathogen to pineapple, there is little information related to it, based on physiological characteristics in vitro. The objective of the study was to evaluate the mycelial growth, sporulation and germination of C. paradoxain different growing conditions. Mycelial discs were removed from pure cultures and placed for growing on petri plates containing the medias: potato-dextrose-agar (PDA), oat-agar (OA), coconut milk-agar (CMA), and pineapple juice agar (PJA).Incubation of the plates was done at three different light regimes and three different temperatures. For mycelial growth, sporulation and germination the best conditions of in vitro cultivation of C. paradoxa were OA and PDA medias in alternating light at 25 ° C, the PDA and PJA medias in continuous darkness at the same temperature.

Index terms
Ananas comosus L; mycelial growth; sporulation; germination

INTRODUÇÃO

Na pós-colheita do abacaxizeiro, a podridãonegra é considerada como um dos principais problemas na comercialização dos frutos.

A doença é causada pelo fungo Chalara paradoxa (De Seynes) Sacc. (= Thielaviopsis paradoxa (De Seyn.) Hohn.,teleomorfo:ceratocystis paradoxa (Dade) C.Moreau) (INDEX FUNGORUM, 2014; MATOS,2005).

O cultivo in vitro de C. paradoxa é um dos entraves para o desenvolvimento de estudos específicos sobre a característica do microrganismo, pois o conhecimento das condições ideais para o seu cultivo ainda são um quesito a ser observado. Poucos relatos científicos dessa natureza são encontrados na literatura atual remetendo a estudos que possam enriquecer esse banco de informações.

Ao reproduzir fungos in vitro, alguns fatores precisam estar de acordo com as necessidades do fungo, tanto nutricionais quanto ambientais. Dentre os fatores, estão luminosidade e temperatura, importantes para o crescimento micelial e produção de esporos. No entanto, nem sempre as condições que favorecem o crescimento são as mesmas para esporulação. Sabe-se ainda que alguns meios de cultura são mais favoráveis para o crescimento e esporulação de fungos que outros, por apresentarem substâncias nutritivas complexas que são menos exigidas para a produção de hifas vegetativas, porém mais exigidas à produção de esporos (HANADA et al., 2002).

A temperatura exerce influência no crescimento, esporulação e germinação dos fungos por ser um dos principais fatores ambientais que afetam a taxa de crescimento vegetativo e a produção de esporos (WINDER, 1999; TEIXEIRA et al., 2001). Resultados de pesquisas indicam que as mudanças na temperatura podem alterar o estágio e a taxa de desenvolvimento do patógeno, sua agressividade ou virulência e suas relações fisiológicas (GARRET et al., 2006).

A luminosidade, para a maioria dos organismos, é um fator ambiental que regula o desenvolvimento e os processos de metabolismo (BABITHA et al., 2008). O crescimento das várias espécies de fungos parece ser diferentemente influenciado pela luz. No trabalho desenvolvido porMonteiro et al. (2004) com isolados deVerticillium lecanii, a ausência de luminosidade proporcionou a melhor condição para o crescimento, quando comparados com o regime de luz contínua e alternada.

Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar o crescimento e a esporulação de C. paradoxa in vitrosob diferentes condições de cultivo.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia, Centro de Ciências Agrárias - CCA, Universidade Federal da Paraíba – UFPB.

A partir de placas contendo colônias puras do fungo C. paradoxa, foram retirados, individualmente, discos com cinco mm de diâmetro, para inoculação nos meios de cultura de aveia-ágar (OA; 60 g Aveia em Flocos Quaker®, 10 g dextrose, 15 g Ágar) adaptado de Googing e Lucas (1959); de batatadextrose- ágar (PDA; 200 g batata, 10 g dextrose, 15 g Ágar) adaptado de Riker e Riker (1936); de leite de coco (CMA; 200 mL de leite de coco, 20 g dextrose 15 g Ágar) adaptado de Menezese Silva- Hanlin (1997); e de abacaxi (PJA; 200 mL do suco do abacaxi puro, 20 g dextrose, 15 g Ágar) adaptado de Romero e Gallegly (1963) para 1.000 mL de água destilada esterilizada (ADE).

O pH de todos os meios foi ajustado para 5,0 (WISMER, 1961). A incubação das placas (90 mm) contendo o fungo foi feita em três diferentes regimes de luminosidade (claro contínuo, escuro contínuo e alternância luminosa) e três diferentes temperaturas (15,; 25 e 35 °C). As placas contendo os discos permaneceram em câmara incubadora B.O.D com controle de temperatura e fotoperíodo.

A avaliação foi realizada diariamente, mediante o uso de paquímetro digital, com mensurações diametralmente opostas, sendo aferida a média, para a determinação do crescimento micelial.

A quantificação do número de esporos produzidos e germinados em cada tratamento foi feita ao final do experimento. Para fins de avaliação, o esporo foi considerado germinado quando o comprimento de seu tubo germinativo foi maior ou igual ao menor diâmetro do esporo (AMORIM et al., 2011).

A suspensão de esporos foi obtida pela adição de 20 mL de ADE nas placas de Petri e raspagem da colônia com escova de cerdas macias. A filtragem da suspensão deu-se por intermédio de uma camada dupla de gaze estéril, sendo determinados o número de esporos e os esporos germinados (1,0 x 10⁴/ mL) em hemacitômetro. O delineamento estatístico utilizado foi o DIC (Delineamento Inteiramente Casualisado), com cinco repetições (cada repetição composta por cinco placas), em arranjo fatorial 4 x 3 x 3 (quatro meios de cultura (PDA, OA, CMA, PJA), três regimes de luminosidade (luz contínua, escuro contínuo, alternância luminosa-12 horas de claro e 12 horas de escuro) e três temperaturas (15; 25e35 °C).

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância; e as médias, comparadas entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, para testar as hipóteses dos efeitos principais e das interações, utilizando o SOFTWARE SAS versão 9.2 (SAS, 2009).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As melhores condições de crescimento micelial ocorreram nos meios OA, PDA e PJA, nos três regimes de luminosidade testados e na temperatura de 25 ºC (Tabela 1). Os meios de cultura OA e PDA, ambos ricos em carboidratos, têm função importante no crescimento micelial de fungos fitopatogênicos. Em geral, os fungos fitopatogênicos utilizam para o seu crescimento e desenvolvimento várias fontes nutricionais, entre as quais os açúcares, que são carboidratos mais requeridos pelos fungos, que podem variar desde os mais simples ao mais complexo (ORLANDELLI et al.,2012).

O meio PJA, rico também em carboidratos e amido, contribuiu para os altos valores de crescimento micelial do fungo (Tabela 1), além de a variedade utilizada para a preparação do meio de cultura ser hospedeira de C. paradoxa.

Os valores para crescimento nos meios OA (aveia) 90,0; 90,0 e 88,4 mm, PDA (batata) 89,2; 90,0 e 90,0 mm e PJA (abacaxi) 89,3; 90,0 e 90,0mm nas condições de alternância luminosa, escuro contínuo e claro contínuo, respectivamente a 25 °C, demonstraram uma adequação do substrato às exigências fisiológicas do fungo, atingindo os bordos da placa em 4 dias (Tabela 1).

Em CMA, foi observada uma redução no crescimento micelial, em que apenas na temperatura de 25 °C, nos regimes de escuro contínuo, e claro contínuo foi observado um pequeno crescimento de 15,7 e 18,3 mm, respectivamente, e nas demais temperaturas e regimes de luminosidade o fungo não se desenvolveu (Tabela 1). Pode-se sugerir que os constituintes deste meio podem ter interferido no crescimento do fungo por conter excesso de gordura e, em pequena quantidade de carboidratos, não estimulando o pleno crescimento (Tabela 1).

O fungo C. paradoxa é considerado um fungo do tipo amilolítico, ou seja, produz maior quantidade de enzimas extracelulares amilolíticas, degradando amido, substância derivada de carboidratos (ALEXANDRE et al., 2009). Esse fato explica o maior índice de crescimento do fungo em meios contendo maior quantidade de carboidratos.

Nos estudos relacionados ao efeito de temperatura no crescimento da C. paradoxa, Santos et al. (2011) afirmaram ser 25 °C a temperatura ideal de crescimento, o que corrobora a presente pesquisa. Em isolados de coqueiro (Cocos nuciferaL.), Carvalho et al. (2011) concluíram como a exata temperatura ótima para o crescimento micelial daC. paradoxa a de 28,28 °C, e Yadahalli et al. (2007) observaram o desenvolvimento em abundância entre as temperaturas de 25 e 28 °C, aumentando o limite para o desenvolvimento vegetativo do fungo.

Por se tratar de um fungo que se manifesta na vida pós-colheita, e a maioria dos plantios de abacaxizeiro encontrar-se em regiões em que a faixa de temperatura se situa entre 15 e 30 °C, este fungo torna-se um sério problema nesta fase, necessitando de refrigeração para prevenir perdas ocasionadas pela podridão-negra dos frutos (QUYEN et al., 2013).

Os regimes de luminosidade testados não apresentaram diferenças significativas entre si, nos meios OA, PDA e PJA e na temperatura de 25 °C (Tabela 1).

Na alternância luminosa e no escuro contínuo a 25 °C, os três meios de cultura (OA, PDA e PJA) que obtiveram maior crescimento micelial obtiveram também os melhores índices de esporulação (Tabela 2).

No trabalho desenvolvido por Carvalho et al. (2011), avaliando diferentes condições ambientais no crescimento e na esporulação de C. paradoxa, eles observaram como melhor temperatura para esporulação a de 28,99 °C, e o crescimento, a de 28,28° C, concluindo como estreita a faixa de diferença entre as temperaturas de crescimento de esporulação. Porém, no presente trabalho, algumas condições de cultivo divergiram para o crescimento e para a esporulação da C. paradoxa.

O PJA em alternância luminosa na temperatura de 15° C apresentou valores de esporulação de 106,43 x 104, embora reduzido crescimento micelial (41,9 mm). Fato semelhante ocorreu a 15 °C no claro contínuo em meio PDA. Na temperatura a 35 °C no escuro, apenas o meio PJA apresentou esporulação mais elevada (83,0 x 104) apesar do pequeno crescimento micelial (22,3 mm) ao comparar com os meios OA e PDA (Tabela 2).

Pesquisas relatam o fato de fatores ambientais e nutricionais influenciarem de forma diferente no crescimento e na esporulação de fungos fitopatogênicos.

Caixeta et al. (2008), ao avaliarem uma interação tripla significativa entre meios de cultura, temperatura e luminosidade, no crescimento micelial e na produção de esporos de isolados de Guignardia citricarpa, concluíram que o meio de cultura que melhor estimulou o crescimento micelial foi o meio cenoura a 25 ºC sob o fotoperíodo de 12 horas, e a maior na produção de esporos (conídios) foi verificada em meio PDA a 20 ºC, no mesmo fotoperíodo.

Em alternância luminosa a 25 °C, o maior índice de germinação ocorreu nos meios OA (11,2 x 104) e PDA (10,6 x 104), e no escuro, na mesma temperatura, o meio PDA apresentou índice de germinação de 13,9 x 104 (Tabela 3), com crescimento micelial de 90 mm (Tabela 1) e maior número de esporos (Tabela 2), comparando-se com os demais meios estudados. No meio PJA em alternância luminosa a 25 °C, em que os resultados para crescimento e esporulação foram de 89,3 mm (Tabela 1) e 276,0 x 104 (Tabela 2), respectivamente, este obteve germinação de 7,6 x 104 (Tabela 3), diferenciando-se estatisticamente dos meios PDA e OA nas mesmas condições.

Na temperatura de 15°C em alternância luminosa, os meios OA e PDA apresentaram índices de germinação semelhantes aos obtidos com a temperatura de 25 °C. Na temperatura de 35 °C no escuro contínuo, o meio PJA apresentou quantidade de esporos germinados alta em comparação à temperatura de 25 °C no mesmo meio de cultivo e condição luminosa (Tabela 3).

Samapundo et al. (2014) explicam a ligação da germinação de esporos em condições adversas ao fato da luta pela propagação da espécie, afirmando que, quando um organismo encontra situação adversa de sobrevivência, este propaga-se para se perpetuar no tempo e espaço. Ao emitir o tubo germinativo, a continuidade de seu desenvolvimento vai depender das condições ambientas e nutricionais impostas ao microrganismo, pois é nesta fase que o mesmo está mais vulnerável aos fatores externos.

TABELA 1
Desdobramento de interação tripla significativa (meio de cultura x regime de luz x temperatura) para Chalara paradoxa para a variável crescimento micelial.

TABELA 2
Desdobramento de interação tripla significativa (meio de cultura x regime de luz x temperatura) para Chalara paradoxa para a variável esporulação (1,0 x 10⁴/mL).

TABELA 3
Desdobramento de interação tripla significativa (meio de cultura x regime de luz x temperatura) para Chalara paradoxa para a variável germinação (1,0 x 10⁴/mL).

CONCLUSÃO

Para o crescimento micelial, as melhores condições de cultivo in vitro de C. paradoxa foram os meios OA, PDA e PJA a 25 °C nas três luminosidades estudadas.

Os meios OV, PDA e PJA a 25°C, em alternância luminosa, e o meio PDA no escuro contínuo, na mesma temperatura, proporcionaram as melhores condições para esporulação.

Para a germinação, os meios OV e PDA em alternância luminosa a 25°C, os meios PDA e PJA no escuro contínuo na mesma temperatura, o meio PDA em alternância luminosa a 15°C e o meio abacaxi, no escuro a 35°C, proporcionaram os melhores valores de germinação.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Oct-Dec 2015

Histórico

• Recebido
  17 Jul 2014
• Aceito
  11 Jun 2015