Ésteres triterpênicos de Himatanthus sucuuba (Spruce) Woodson

Triterpenic esters from himatanthus sucuuba (Spruce) Woodson

Resumo

Bioactivity-guided fractionation from hexane extract of Himatanthus sucuuba barks utilizing Cladosporium sphaerospermum led to the isolation of iridoids plumericin and isoplumericin, which showed higher inhibition against C. sphaerospermum than the antibiotic nistatin. Besides bioactive iridoids were isolated the inactive triterpenes lupeol cinnamate, alpha-amyrin cinnamate and lupeol acetate.

Himatanthus sucuuba; iridoids; triterpenes

Himatanthus sucuuba; iridoids; triterpenes

ARTIGO

Ésteres triterpênicos de Himatanthus sucuuba (Spruce) Woodson

Jefferson Rocha de A. Silva, Claudia M. Rezende e Ângelo C. Pinto

Instituto de Química - Universidade Federal do Rio de Janeiro - Cidade Universitária - Ilha do Fundão - C. T.; Bloco A - 21945-970 - Rio de Janeiro - RJ

Maria L. B. Pinheiro, Milade C. Cordeiro e Everaldo Tamborini

Departamento de Química - Universidade Federal do Amazonas - Campus Universitário - Mini-Campus - Estrada do Contorno nº 3000 - Japiim - 69077-000 - Manaus - AM

Cláudia M. Young

Instituto de Botânica de São Paulo - CP 4005 - 01061-970 - São Paulo - SP

Vanderlan da S. Bolzani

Instituto de Química - Universidade Estadual Paulista - 14800-900 - Araraquara - SP

Recebido em 17/7/97; aceito em 14/5/98

Triterpenic esters from Himatanthus sucuuba (Spruce) woodson. Bioactivity-guided fractionation from hexane extract of Himatanthus sucuuba barks utilizing Cladosporium sphaerospermum led to the isolation of iridoids plumericin and isoplumericin, which showed higher inhibition against C. sphaerospermum than the antibiotic nistatin. Besides bioactive iridoids were isolated the inactive triterpenes lupeol cinnamate, a-amyrin cinnamate and lupeol acetate.

Keywords: Himatanthus sucuuba; iridoids; triterpenes.

INTRODUÇÃO

Himatanthus sucuuba (Spruce) Woodson (Apocynaceae) é uma planta conhecida na região norte do Brasil como sucuuba, janaguba ou sucuba. Esta planta é amplamente utilizada na medicina popular como antitumoral, antifúngica, vermífuga e anti-anêmica¹.

Estudos anteriores revelaram a presença de depsídeos, terpenos e iridóides em H.sucuuba^2,3. Dentre os iridóides foram encontrados a fulvoplumierina, isoplumericina e plumericina, de comprovada ação antineoplásica, antiflogística e antimicrobiana^4-10. Os depsídeos isolados de H.sucuuba apresentaram atividade como inibidores da enzima beta monoamino-oxidase (MAO-B)³. No entanto, como foram encontrados nas cascas podem não ser provenientes da planta e sim de líquens infestantes.

No presente trabalho são descritos os resultados do estudo fitoquímico do extrato hexânico das cascas do caule de H.sucuuba. Este extrato é constituído basicamente por uma mistura de ésteres triterpênicos, que corresponde aproximadamente a 7% do peso do extrato. Estes ésteres triterpênicos já foram descritos no gênero Himatanthus^11,12. A atividade fungicida apresentada pelo extrato foi monitorada por bioautografia, utilizando-se o fungo fitopatogênico Cladosporium sphaerospermum^13-14. A análise das frações bioativas por CGAR-EM, RMN ¹H e ¹³C revelou a presença dos iridóides plumericina 1 e isoplumericina 2.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato hexânico das cascas do caule foi submetido a bioautografia, utilizando o fungo Cladosporium sphaerospermum. A cromatoplaca de sílica foi eluída com uma mistura de hexano e acetato de etila (6:4). Uma zona de inibição intensa na cromatoplaca indicou a presença de substâncias fungitóxicas.

O extrato hexânico foi fracionado em coluna de SEPHADEX-LH 20, usando hexano, diclorometano, acetona e metanol como eluentes. Das oito frações obtidas, a segunda e a terceira frações apresentaram zona de inibição na bioautografia. A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas destas duas frações mostrou a presença dos iridóides plumericina 1, isoplumericina 2, e de uma mistura de ésteres triterpênicos das séries lupano e ursano, como constituintes em maior proporção na mistura.

Ao extrato hexânico dissolvido em clorofórmio adicionou-se etanol. Este procedimento levou à obtenção de um sólido amorfo que foi cromatografado em coluna de gel de sílica. A eluição da coluna com uma mistura de hexano/benzeno em gradiente de polaridade crescente forneceu uma mistura de duas substâncias e um sólido cristalino. A análise da mistura, por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria massas, mostrou o mesmo íon molecular de m/z 556 para as duas substâncias, compatível com a fórmula molecular C₃₉H₅₆O₂. Foram observados íons característicos de triterpenos das séries lupano de m/z 189 (32%) e D¹² -urseno ou oleaneno de m/z 218 (46%), este último proveniente de um rearranjo de tipo retro- Diels-Alder^15-16. O íon de m/z 408 (M+^·-148), resultante da perda de C₉H₈O₂ , acompanhado do fragmento de m/z 131 (100%) levaram a suposição da presença de um grupamento cinamoíla no esqueleto triterpênico^17-18.

Os espectros de RMN ¹³C (desacoplado e DEPT 90^o e 135^o) da mistura registraram os pares de deslocamentos químicos 124.5 (CH) e 139.8 (C), e 109.6 (CH₂) e 151,1 (C), característicos para as ligações duplas C(12) - C(13) da série urseno e C(20)- C(29) do grupo isopropilideno do esqueleto lupano^19-20, respectivamente. A unidade cinamoila foi confirmada através dos deslocamentos químicos em d 128,2 (C-2' e C-6'), 129,0 (C-3'e C-5'), 130,3 (C-4') e 134,3 (C-1') do anel aromático e em 119,0, 144,4 e 166,3 da unidade (CH=CH-COO). O par de dubletos no RMN ¹H em d 7,70 (1H, J=16Hz) e 6,48 (1H, J=16 Hz) e 7,65 (1H, J=16Hz); e 6,42 (1H, J=16 Hz.) mostram que a ligação dupla tem configuração E^21-22. A hidrólise básica desta mistura levou a obtenção de ácido cinâmico, lupeol e a-amirina²³, cujas as estruturas foram confirmadas através de seus espectros de massas (CGAR-EM) e co-injeção com padrões.

O sólido cristalino 5 mostrou o íon molecular de m/z 468, compatível com a fórmula molecular C₃₂H₅₂O₂, e fragmentos no espectro de massas característicos do esqueleto lupano^19-21,24-26.

A unidade acetil foi caracterizada pelos espectros de RMN ¹H e ¹³C de 5^{19-21, 24-26}, que foi identificado como acetato de lupeol.

O fracionamento guiado por bioensaio das frações bioativas levou à obtenção de uma mistura dos iridóides 1 e 2. A análise por CGAR-EM mostrou que ambos os iridóides tem o mesmo peso molecular (M^+• 290, C₁₅H₁₄O₆). Os fragmentos de m/z 258 (M^+•-32, 42%) e de m/z 230 (M^+•-60, 85%) são provenientes da perda de MeOH e de formiato de metila, enquanto o de m/z 193 (M^+•-97, 78%) é resultante da perda do anel da lactona.

O espectro de RMN ¹H desta mistura registrou um par de dubletos de quartetos em d 7,14 (1H, J=1,0 e 7,0 Hz) e 6,80 (1H, J=1,0 e 7,0 Hz), que foram atribuídos ao hidrogênio olefínico no C-13 da plumericina 1 e isoplumericina 2, respectivamente.

A avaliação biológica foi feita utilizando a suspensão de esporos do fungo fitopatogênico Cladosporium sphaerospermum. Pelo método da autobiografia utilizando diferentes concentrações das substâncias 1 e 2 , verificou-se que o limite de deteção, tanto para plumericina 1 quanto para isoplumericina 2 está abaixo de 1mg. Este resultado indica uma atividade fungitóxica para estes iridóides cinco vezes maior do que o observado para o antibiótico nistatina (5mg), usado como padrão.

EXPERIMENTAL

Planta - Coletada em janeiro de 1995 no município de Santarém, estado do Pará. A exsicata está depositada no Herbário do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brasil, registrada sob N^o5436.

Extração e separação - 350g de material botânico (casca do caule) de Himatanthus sucuuba, seco e moído, foram submetidos a extração em aparelho Soxhlet por 3 dias, utilizando-se sucessivamente, hexano, clorofórmio e etanol. O resíduo hexânico (28,7g), de coloração laranja e consistência pastosa, foi tratado com clorofórmio e etanol, precipitando 2,0 g de um sólido branco amorfo. 200 mg deste sólido foram cromatografados em coluna de gel de sílica (hexano/benzeno em gradiente crescente de polaridade), fornecendo uma mistura constituída de 3 e 4 (58,8 mg) e um sólido 5 (25,2 mg). 6,0 g da fração hexânica bruta foram ainda cromatografados em coluna aberta utilizando SEPHADEX LH-20 (60 g) como fase estacionária e como eluentes hexano, diclorometano, acetona e metanol em gradiente de polaridade crescente fornecendo: (A) C₆H₁₄ (5,0 g); (B) C₆H₁₄:CH₂Cl₂ (8:2; m=0,5 g); (C) C₆H₁₄:CH₂Cl₂ (6:4; m=0,3 g); (D) C₆H₁₄:CH₂Cl₂ (2:8; m=0,05 g); (E) CH₂Cl₂:C₃H₆ O (8:2; m=0,08 g); (F) CH₂Cl₂:C₃H₆ O (6:4; m=0,03 g); (G) CH₂Cl₂:C₃H₆ O (2:8; m=0,008 g); (H) MeOH (m=0,002 g).

A cromatografia em camada fina das frações obtidas indicou a presença de substâncias com o mesmo Rf nas frações B e C. Estas frações foram reunidas (m=0,8 g) e cromatografadas em coluna de gel de sílica tendo como eluentes hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol em gradiente de eluição. Após a bioautografia das frações (vide procedimento abaixo), a fração eluída com CH₂Cl₂:AcOEt (8:2,108 mg) foi cromatografada em coluna de gel de sílica com hexano/acetato de etila em gradiente de eluição, obtendo-se oito frações das quais a fração eluída com C₆H₁₄ : AcOEt (7:3) é uma mistura constituída pelos iridóides 1 e 2 (16,3 mg).

Hidrólise da mistura de 3 e 4 -45 mg deste material foram refluxados com 6 ml de solução metanólica de KOH a 5% em 60 ml de hexano. Após evaporação do metanol e adição de água, extraiu-se a solução com clorofórmio, obtendo-se uma fração insaponificável, que foi identificada por co-injeção em CGAR como lupeol e a-amirina. A fração aquosa alcalina acidificada com HCl e extraída com acetato de etila forneceu um sólido cristalino que foi identificado por comparação com amostra autêntica, através de CCD, IV e co-injeção em CGAR, como o ácido cinâmico.

Bioensaio - A análise do extrato hexânico foi realizada em cromatografia de camada fina, tendo como sistema de solventes hexano:acetato de etila (6:4).Após o registro das bandas cromatográficas que absorveram na luz ultravioleta, fez-se a aplicação da suspensão, contendo Cladosporium sphaerospermum, sobre a cromatoplaca com subsequente deposição em atmosfera úmida para incubação por um período de dois a três dias.

Suspensão de Cladosporium sphaerospermum - Uma solução contendo KH₂PO₄ (7 g), Na₂HPO₄. 2H₂O (3 g), KNO₃ (4 g), MgSO₄. 7H₂O (1 g) foi autoclavada a 120^oC por 20 minutos. A 60 ml desta solução foram adicionados 10 ml de uma solução de glicose a 30% e, em seguida, adicionou-se o fungo Cladosporium sphaerospermum até obter-se uma suspensão.

Dados físicos e espectrométricos: Plumericina (1). IV(KBr) n_max cm^-1 (mistura de 1 e 2): 1757, 1707, 1685 e 1647. EM m/z (int.rel.): 290(30), 230(60), 201 (70), 193(80), 173 (40), 160 (70), 139 (100) e 115 (60). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃.): d 7,14 (dq, J=1,0 e 7,0 Hz, H-13), 6,04 (dd, J=2,0 e 5,0 Hz, H-6), 5,64 (dd, J=2,0 e 5,0 Hz, H-7), 5,30 (sl, H-10), 4,00 (m, H-5), 3,76 (COOMe), 2,01 (d, J=7,0 Hz, H-14). RMN ¹³C (75,25 MHz, CDCl₃): 102,3 (C-1), 153 (C-3), 38,4 (C-5), 141,1 (C-6), 126,4 (C-7), 53,9 (C-9), 80,3 (C-10), 144,6 (C-13)^27-29.

Isoplumericina (2). IV (KBr) n_max cm^-1 (mistura de 1 e 2): 1757, 1707,1685 e 1647. EM m/z (int.rel.): 290 (29), 230 (94), 201 (100), 193 (80), 173 (40), 160 (98), 139 (90) e 115 (60). RMN ¹ H.(300 MHz, CDCl₃.): d 6,80 (dq, J=1,0 e 7,0 Hz, H-13 ), 6,04 (dd, J=2,0 e 5,0 Hz, H-6), 5,64 (dd, J=2,0 e 5,0 Hz, H-7), 5,30 (sl, H-10), 4,00 (m, H-5), 3,76 (COOMe), 2,01 (d, J=7,0 Hz, H-14). RMN ¹³C (75,25 MHz, CDCl₃): 102,3 (C-1), 153 (C-3), 38,4 (C-5), 141,16 (C-6), 126,4 (C-7), 53,9 (C-9), 80,3 (C-10), 144,6 (C-13)^27-29.

Cinamato de lupeol (3). IV (KBr) n_max cm ^-1 : 2940, 2860, 1709, 1638, 1458, 1171, 766 e 706 cm^-1. EM m/z (int.rel.): 556[M]⁺ (2), 408 (2), 337 (2), 218 (46), 190 (14), 189 (32), 131 (100) e 103 (26). RMN ¹H (300MHz,CDCl₃): d 7.70 (d, J=16,0 Hz, H-7'), 7,35-7,55 (m, Ar-H), 6,42 (d, J=16 Hz, H-8^'), 4,67 (m, H-29b), 4,57 (m, H-29a). RMN ¹³C (Tabela 1).

Cinamato de a-amirina (4). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃ ): d 7,65 (d, J=16,0 Hz, H-7), 7,35-7,55 (m, Ar-H), 6,48 (d, J=16,0 Hz, H-8^'), 5,14 (t, J=3,4 Hz , H-12). RMN ¹³C (Tabela 1).

Acetato de lupeol (5). p.f. 154-156^oC; IV (KBr) n_max cm ^-1 : 2950, 1734, 1244 e 1173 cm¹. EM m/z: 468 [M]⁺ (11), 408 (4), 218 (44), 189 (100), 121 (66). RMN ¹H (300 MHz,CDCl₃): d 4,69 (m), 4,57 (m), 2,04 (s), 1,03 (s), 0,94 (s), 0.85 (s) e 0.79 (s). RMN ¹³C (Tabela 1)

Instrumental - Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75,25 MHz, respectivamente) foram obtidos em um espectrômetro Bruker, utilizando CDCl₃ como solvente e TMS como padrão interno. A análise por CGAR (Cromatografia Gasosa de Alta Resolução) foi realizada em cromatógrafo HP5890 - Condições: injetor: 260^oC; detetor por ionização de chama: 330^oC (DIC), gás carreador H₂; vazão: 2ml/min; temperatura programada: 250-320^oC (5^o C/min), 320^oC (30min); injeção com divisão de fluxo (20:1); coluna capilar de sílica fundida, fase estacionária SE-54, 25 m, d_ext=0,3mm, d_fase=0,2 nm. CGAR/EM - Cromatógrafo a gás HP-5880 acoplado a um espectrômetro de massas computadorizado HP-5897A com analisador de íons quadrupolo e ionização por impacto de elétrons, 70eV; Temperatura programada: 40^o-320^oC (10^oC/min); injeção on colunm, coluna capilar de sílica fundida, fase estacionária Silarem-30, 10m. d_ext 0,3 mm. Os espectros de IV foram realizados em espectrômetro Nicolet: Magna-IR 760

Os fracionamentos cromatográficos foram realizados em coluna de vidro, empacotadas com Si 60-MERCK e SEPHADEX LH-20 (PHARMACIA); a CCD foi realizada em cromatofolhas MERCK PL, Si 60 F₂₅₄, 0,2mm de espessura. Os pontos de fusão foram obtidos em aparelho MICROQUÍMICA MQAPF-301 e não foram corrigidos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq e ao PRONEX/FINEP nº 41.96.00911.00 reg. 4002-96 pelo suporte financeiro.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Abr 2001
• Data do Fascículo
  Nov 1998

Histórico

• Aceito
  14 Maio 1998
• Recebido
  17 Jul 1997