Triterpenos da resina de Protium heptaphyllum March (B0urseraceae): caracterização em misturas binárias

Triterpenes from the resin of Protium heptaphyllum March (Burseraceae): characterization in binary mixtures

Resumo

Eight triterpenes, maniladiol, breine, ursa-9(11):12-dien-3beta-ol, oleana-9(11):12-dien-3beta-ol, 3alpha-hydroxy-tirucalla-8,24-dien-21-oic acid, 3alpha-hydroxy-tirucalla-7,24-dien-21-oic, alpha and beta amyrines were isolated as binary mixtures obtained from the chloroform extract of the oil-resin of Protium heptaphyllum March. The identification of the compounds was based mainly in 13C NMR data and mass spectra. The diene and the tetracyclic acid triterpenes were not reported before in the literature as constituents of the studied resin.

Protium heptaphyllum; triterpenes; Burseraceae

Protium heptaphyllum; triterpenes; Burseraceae

ARTIGO

Triterpenos da resina de Protium heptaphyllum March (B0urseraceae): caracterização em misturas binárias

Robinson Magalhães Maia, Pedro Rocha Barbosa, Frederico Guaré Cruz, Nídia Franca Roque e Miguel Fascio

Instituto de Química - Universidade Federal da Bahia - 40170-290 - Salvador - BA

Recebido em 20/7/99; aceito em 8/1/00

Triterpenes from the resin of Protium heptaphyllum March (Burseraceae): characterization in binary mixtures. Eight triterpenes, maniladiol, breine, ursa-9(11):12-dien-3b-ol, oleana-9(11):12-dien-3b-ol, 3a-hydroxy-tirucalla-8,24-dien-21-oic acid, 3a-hydroxy-tirucalla-7,24-dien-21-oic, a and b amyrines were isolated as binary mixtures obtained from the chloroform extract of the oil-resin of Protium heptaphyllum March. The identification of the compounds was based mainly in ¹³C NMR data and mass spectra. The diene and the tetracyclic acid triterpenes were not reported before in the literature as constituents of the studied resin.

Keywords:Protium heptaphyllum; triterpenes; Burseraceae.

INTRODUÇÃO

Muitas espécies vegetais se notabilizam pela gama variada de substâncias triterpenoídicas, presentes nos seus órgãos, onde devem desempenhar diferentes papéis.¹ Alguns gêneros da família Burseraceae (Elaphrium, Icica, Canarium e Protium) são produtores de resinas oleosas. Estas resinas são conhecidas genericamente como elemi e são constituidas de triterpenos tetracíclicos, como os ácidos elemadienólico e elemadienônico, e pentacíclicos, como a e b amirinas, maniladiol e breína entre outros².

A espécie Protium heptaphyllum é largamente encontrada na região amazônica e produz uma resina oleosa também conhecida como breu branco, almécega do Brasil, goma-limão, etc. Sua utilização é amplamente difundida, sendo usada na medicina popular, como analgésico, cicatrizante e expectorante; na indústria de verniz; na calafetagem de embarcações e em rituais religiosos (incenso). Isto torna, sobremodo, importante o conhecimento de sua constituição química para contribuir com o aproveitamento e controle na medicina e na indústria. A literatura revela a presença de a e b amirinas, taraxastano-3, 20-diol, taraxastan-3-oxo-20-ol, bem como de sitostenona na resina de Protium heptaphyllum March, coletada na reserva da Campina (Manaus-AM)³.

Triterpenos são facilmente encontrados na natureza e quando utilizam-se as técnicas cromatográficas usuais, raramente consegue-se o isolamento destes triterpenos puros, sendo estes portanto obtidos, quase sempre, em misturas de difícil resolução. Esta dificuldade pode às vezes ser superada empregando-se as técnicas cromatográficas especiais, como CLAE e CG de alta resolução. Na ausência destas, é possível utilizar-se métodos físicos de análise e identificar-se triterpenos em misturas. Um exemplo é a metodologia desenvolvida por Gallegos Olea e Roque⁴. O emprego desta metodologia, coadjuvada por dados espectrais de RMN de ¹H, UV, IVTF e EM, tornou possível a identificação de oito triterpenos presentes na resina de P. heptaphyllum (Burseraceae), descrita neste trabalho.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos Experimentais: nas separações em coluna foi utilizada a técnica de empacotamento a seco tendo como adsorvente gel de silica 60 (0,063-0,200) da Merck. Nas cromatografias em camada delgada (0,3 mm) analíticas, a fase estacionária utilizada foi gel de silica GF-254 da Merck. As revelações cromatográficas foram feitas através da observação direta das cromatoplacas em câmara com luz ultra-violeta modelo UVGL-58, UVP com comprimento de onda de 254 e 399 nm e por borrifamento das cromatoplacas com o reativo de Liebermann-Burchard. Os espectros na região do infra-vermelho foram obtidos em um espectrômetro III JASCO (Varian) com transformada de Fourrier. Os espectros de RMN de ¹He de ¹³C foram obtidos em espectrômetro Varian operando a 300 e a 75 MHz respectivamente. O CDCl₃ (SIGMA 99,8%) foi usado como solvente e como referência secundária. Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetro Hewlett-Packard 5890 empregando a técnica de impacto eletrônico a 70 eV. O espectro na região do ultra-violeta foi obtido em um espectrofotômetro modelo UVICON 941 PLUS da Kontron Instruments.

Material Vegetal: a resina exsudada do tronco da espécie Protium heptaphyllum March, foi coletada em Tairú, distrito da ilha de Itaparica, Bahia, em dezembro de 1993 e foi identificada pela botânica Maria Lenise da S. Guedes do Instituto de Biologia da UFBA através da comparação com a exsicata existente no Herbário Alexandre Leal Costa desta universidade.

Isolamento dos Constituintes: a resina (75,0 g) foi submetida a extração com hexano à temperatura ambiente, sendo o solvente eliminado sob pressão reduzida em evaporador rotativo, obtendo-se um sólido amarelo âmbar (39,0 g). O resíduo insolúvel em hexano, foi solubilizado em clorofórmio, obtendo-se cerca de 36,0 g do extrato clorofórmico .

O extrato solúvel em clorofórmio impregnado em 3,0 g de gel de sílica, foi submetido a uma filtração rápida em coluna de gel sílica 60 Merck (60,0 g), utilizando-se como eluente hexano e misturas de acetato de etila em hexano, com gradiente crescente de polaridade. Duas frações foram trabalhadas, as eluídas com 5% de acetato de etila (FA) e as eluidas com 20% de acetato de etila (FB). FA (7,78g) foi purificada por cromatografia de adsorção em coluna de gel de sílica 60 (60,0 g), usando-se como fase móvel hexano e misturas de acetato de etila em hexano. A fração desta coluna que foi recolhida com 5% de acetato de etila (5,0 g), foi analisada por CCD e apresentou uma única mancha de coloração róseo-avermelhada quando revelada pelo reativo de Liebermann-Burchard. A análise por IVTF, RMN de ¹H e de ¹³C permitiu identificar uma mistura constituída por a e b amirinas (1 e 2). A fração FB (3,0 g), da coluna filtrante inicial, apresentou-se como um sólido branco de aspecto amorfo e foi cromatografada em coluna de gel de sílica 60 (60,0 g), usando-se como eluente misturas de acetato de etila em hexano com gradiente crescente de polaridade. Com hexano / AcOEt (9:1), foram recolhidas sete frações, uma das quais (0,062 g) apresentou uma única mancha, quando analisada por CCD (AcOEt/hexano 2:3), após revelação com o reativo de Liebermann-Burchard. A análise desta fração por IVTF, EMIE, RMN de ¹H e de ¹³C permitiu identificá-la como sendo uma mistura dos dióis 3 e 4. Com hexano / AcOEt (8:2) foram recolhidas várias frações que foram comparadas por CCD. Uma destas frações (0,59 g) que apresentou-se quase pura foi recristalizada com acetona/hexano (3:7) fornecendo um material cristalino (0,036 g). Análise dos dados espctrométricos de UV, IVFT e RMN revelou tratar-se de mistura das substâncias 5 e 6 .A água mãe foi concentrada e o resíduo obtido foi cromatografado, em coluna de sílica gel 60 utilizando-se os mesmos eluentes descritos anteriormente. As frações coletadas com hexano / AcOEt (95:5) forneceram um material puro (0,033 g). A análise dos dados espectrais de RMN de ¹³C e ¹H e IVTF deste material, permitiu identificá-lo como sendo uma mistura dos dois triterpenos tetracíclicos 7 e 8.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato clorofórmico da resina de P. heptaphyllum foi submetido à separação cromatográfica, originando misturas binárias de triterpenos. Esta constatação foi feita através da contagem dos sinais presentes nos espectros de RMN de ¹³C totalmente desacoplado, e DEPT (90^o e 135^o). A identificação dos triterpenos foi conseguida, mediante a comparação desses dados com os descritos na literatura indicada.

A ocorrência da mistura de a e b amirinas (1 e 2) na resina é majoritária em relação aos outros triterpenos. A identificação destes triterpenos foi baseada na análise, usando a metodologia descrita por Olea e col⁴, usando dados de RMN de ¹³C e comparação destes com os valores descritos na literatura^5,6. Os dados de RMN de ¹³C estão indicados na Tabela 1 .

O espectro de RMN de ¹H da mistura de 3 e 4 apresentou sinais simples na região de d 0,8 a 1,0 que revelou o caráter triterpênico de seus constituintes. Após a identificação dos sinais de cada terpeno⁴ presentes no espectro de RMN de ¹³C, observaram-se os sinais de CH carbinólicos em d 66,46 e 65,45, além dos demais sinais semelhantes aos das séries oleanano e ursano. Esta análise permitiu identificar uma mistura de triterpenos diidroxilados do tipo oleanano e ursano e colocar a segunda hidroxila dos triterpenos na posição 16, em ambos esqueletos carbônicos. Esta posição pôde ser estabelecida mediante a constatação da existência de efeitos a, b e g, exercidos pela presença da hidroxila no carbono 16 nas moléculas da a-amirina (1) e da b-amirina (2), tomadas como padrão de comparação⁵.

Para a breína (3) notam-se diferenças nos deslocamentos químicos em torno de 8 ppm (efeito b) para C-15, de 5 ppm para C-17 (efeito b), de 40 ppm para C-16 (efeito a), de 6 ppm para C-22 (efeito g) e de 7 ppm para C-28 (efeito g), quando comparados com os deslocamentos químicos dos carbonos correspondentes da a-amirina 1 (Tabela 1).

No tocante ao maniladiol (4), as interações da hidroxila em C-16 com os carbonos da vizinhança, através dos efeitos a, b e g, foram verificadas por comparação com os deslocamentos observados no seu análogo mono-hidroxilado, a b-amirina (2). As diferenças aproximadas dos deslocamentos, foram observadas em cerca de 8 ppm para C-15 (efeito b), de 40 ppm para C-16 (efeito a), de 5 ppm para C-17 (efeito b), de 8 ppm para C-22 (efeito g) e de 7 ppm para C-28 (efeito g). A presença de efeito g (proteção) no carbono 28, é o indicativo da configuração b para a hidroxila do carbono 16 .Os deslocamentos químicos destes e dos demais carbonos, com suas correspondentes multiplicidades, têm valores concordantes com os da literatura para o maniladiol⁶. Na região do infravermelho, além de outras absorções presentes nas moléculas das a e b amirinas (1 e 2), observaram-se duas vibrações de deformação axial C-O (1029 e 1050 cm^-1), que podem ser correlacionadas com as hidroxilas em C-3 e C-16.

O espectro de massas da mistura obtido por injeção direta e impacto eletrônico (EMIE) 70 eV, comprova a presença da hidroxila no C-16 em ambas substâncias através da fragmentação típica por retro Diels-Alder ocorrida no anel C (m/z 442 ® m/z 234), caracterizando a presença de uma ligação dupla em D¹² nos respectivos esqueletos, bem como a presença dos grupos hidroxílicos no mesmo anel. A perda da metila (C-28) do carbono 17, origina um cátion formado por um processo de fragmentação em etapa única (m/z 234 ® m/z 219).⁷ Os esqueletos triterpênicos ursano e oleanano e seus respectivos análogos substituídos, por serem isômeros de posição, possuem diferenças apenas na intensidade de alguns fragmentos. Deste modo, o espectro de massas da mistura mostra a presença de picos comuns aos triterpenos 3 e 4.

O espectro de RMN de ¹H da mistura de 5 e 6 apresenta quatro dubletos em d 5,42 ; 5,48; 5,54 e 5,56 (J= 6,5 Hz) que correspondem a hidrogênios de ligações duplas conjugadas. A presença de um dieno homoanular nas substâncias foi verificada pelo comprimento de onda máximo da absorção na região do UV da mistura em metanol, l_máx.^MeOH = 280 nm (e= 4.624).Este valor está de acordo com o cálculo aproximado utilizando a regra de Woodward⁸ para dienos cisóides.

Os deslocamentos químicos dos carbonos olefínicos no espectro de RMN de ¹³C em d 154,04 (C-9), 140,72 (C-13), 122,58 (C-12) e 114,86 (C-11) são compatíveis com o esqueleto ursa-9(11):12-dieno, e os sinais em d 153,80 (C-9) 146,59 ( C-13 ) 120,23, 115,23 (C-11) indicam o esqueleto oleana-9(11):12-dieno. Os deslocamentos dos demais carbonos, com suas correspondentes multiplicidades, foram obtidos através da análise de espectros DEPT (90^o e 135^o) e são idênticos aos divulgados na literatura para 3b-hidroxi-ursa-9(11),12-dienol (5) e 3b-hidroxi-olea-9(11),12-dieno (6).

As absorções na região do infravermelho em 1631 e 832 cm^-1, correspondentes ao dieno D^9(11):12 presente nos esqueletos ursadieno e oleanadieno confirmam a identificação dos triterpenos 5 e 6 em mistura.

Os hidrogênios carbinólicos presentes nas substâncias 7 e 8 apresentam-se no espectro de RMN de ¹H como singletos largos (d: 3,48 e 3,44), ao invés de duplos dubletos como observados nos espectros dos demais triterpenos e que foram atribuídos ao H-3 . Através da medida da largura do pico a meia altura W_1/2 (6,8 Hz), pôde-se estabelecer a estereoquímica do hidrogênio carbinólico dos triterpenos 7 e 8 como sendo 3-b equatorial. Este fato está de acordo com os deslocamentos químicos para o carbono 3 de d 75,58 (7) e d 75,96 (8) indicando a configuração axial para a hidroxila a ele ligada nos dois triterpenos. Observa-se ainda naquele espectro a presença de um hidrogênio vinílico (dubleto largo) em d 5,23 (J= 3,3 Hz), característico de ligação dupla em anel. Um outro hidrogênio apresenta-se como um tripleto em dd 5,07 (J= 6,6 Hz) podendo ser atribuído à presença de uma ligação dupla na cadeia lateral D²⁴ de triterpenos tetracíclicos. Este sinal apresenta integração aproximadamente duas vezes maior que o sinal em d 5,23, sugerindo que o próton vinílico endocíclico está presente em apenas uma das substâncias. Esses dados, assim como a presença das absorções no espectro de infravermelho correspondentes a grupos carboxílicos (1702 cm ^­1),e os sinais em d 181,1 e 181,4 presentes no espectro de RHN de ¹³C são compatíveis com uma mistura constituída por ácidos triterpênicos tetracíclicos.

A análise dos dados mencionados sugere que a substância mais abundante na mistura, seja o ácido 3-a-hidroxi-tirucala-7,24-dien-21-óico (8), anteriormente isolado de resinas elemi extraídas de plantas do gênero Canarium¹¹. Os dados de RMN de ¹³C deste ácido só foram descritos quando ele foi isolado de outra espécie de Burseraceae, a Aucoumea klaineana¹². Uma comparação desses dados com os obtidos da mistura, identificou os deslocamentos químicos da substância 8, e desse modo por exclusão, deixou evidente os deslocamentos químicos de 7 (Tabela 1). Os dados de RMN de ¹³C desta última substância, não foram encontrados na literatura, embora o triterpeno já tenha sido isolado anteriormente de outras resinas oleosas^11,13. Uma análise detalhada dos espectros totalmente desacoplados, DEPT (90^o e 135^o), bem como pela comparação dos mesmos com os de substâncias análogas descritas na literatura^11,14,15, permitiu atribuir os deslocamentos químicos aos carbonos de 7.

O espectro de massas da mistura, forneceu um pico em e/m 456 (25%), seguido da perda de um grupo metílico (15%) e de uma molécula de água, resultando no pico base. Estes dados estão de acordo com as estruturas dos ácidos 3a-hidroxi-tirucala-8,24-dien-21-óico e 3a-hidroxi-tirucala-7,24-dien-21-óico respectivamente para 7 e 8.

CONCLUSÃO

Este trabalho mostra que utilizando-se, principalmente, os dados de RMN de ¹³C, com auxílio de outras técnicas, é possível identificarem-se substâncias triterpênicas em misturas. A dificuldade de separação destas muitas vezes não justifica, quando o objetivo for apenas registrar a composição química da mistura,o gasto de tempo e o de material na obtenção das substâncias puras. Embora não exista trabalho publicado anteriormente relatando a composição química da resina oleosa de P. heptaphyllum, há uma comunicacão ³ que relata a presença de a e b amirinas, assim como de taraxastan-3,20-diol, 20-hidroxi- taraxastan-3-ona e sitostenona, em resina de uma planta da mesma espécie, coletada na Amazônia. A diferença na composição química das duas resinas evidencia, mais uma vez, que uma espécie em ambientes diferentes pode elaborar metabólitos secundários diferentes. O ácido 3-a-tirucalalan-21-óico e derivados parecem ser característicos dessas resinas, não tendo sido encontrados em outras partes de plantas da família Burseraceae ou em outras espécies vegetais.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Dez 2000
• Data do Fascículo
  Out 2000

Histórico

• Aceito
  08 Jan 2000
• Recebido
  20 Jul 1999