Estudo fitoquímico das cascas do caule de Duguetia glabriuscula - Annonaceae, biomonitorado pelo ensaio de toxicidade frente a Artemia salina leach

Activity-guided isolation of the constituents from bark of stem of Duguetia glabriuscula - Annonaceae, using Brine Shrimp Lethality test (BSL)

Resumo

The extract obtained from stem bark of Duguetia glabriuscula - Annonaceae was evaluated by Brine Shrimp Lethality test (BSL). The bioactive compounds, oxobufoline and lanuginosine, two oxoaporphine alkaloids were isolated by activity-guided fractionation. In addition, the compounds asaraldehyde, (+)-allo-aromadendrane-10beta, 14-diol, and two aporphine alkaloids, polyalthine and oliveridine were also obtained.

Annonaceae; Duguetia glabriuscula; Artemia salina; oxoaporphine alkaloids

Annonaceae; Duguetia glabriuscula; Artemia salina; oxoaporphine alkaloids

ARTIGO

Estudo fitoquímico das cascas do caule de Duguetia glabriuscula - Annonaceae, biomonitorado pelo ensaio de toxicidade frente a Artemia salina leach

João Máximo de Siqueira^*, Maria Graziela Ziminiani

DFB, CCBS, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, CP 549, 79070-900 Campo Grande - MS

Ubirazilda Maria Resende

DBI, CCBS, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, CP 549, 79070-900 Campo Grande - MS

Maria Amélia Diamantino Boaventura

Departamento de Química, ICEx, Universidade Federal de Minas Gerais, CP 702, 31270-901 Belo Horizonte - MG

^*E-mail: [e-mail]

Recebido em 3/3/00; aceito em 2/8/00

Activity-guided isolation of the constituents from bark of stem of Duguetia glabriuscula - Annonaceae, using Brine Shrimp Lethality test (BSL). The extract obtained from stem bark of Duguetia glabriuscula - Annonaceae was evaluated by Brine Shrimp Lethality test (BSL). The bioactive compounds, oxobufoline and lanuginosine, two oxoaporphine alkaloids were isolated by activity-guided fractionation. In addition, the compounds asaraldehyde, (+)-allo-aromadendrane-10b, 14-diol, and two aporphine alkaloids, polyalthine and oliveridine were also obtained.

Keywords: Annonaceae; Duguetia glabriuscula; Artemia salina; oxoaporphine alkaloids.

INTRODUÇÃO

Dando continuidade ao estudo fitoquímico biomonitorado das espécies nativas da família Annonaceae em Mato Grosso do Sul com a utilização do ensaio de toxicidade frente a Artemia salina¹, TAS, serão apresentados os dados referentes à espécie Duguetia glabriuscula. O TAS, por ser um ensaio biológico rápido, de baixo custo e simples tem sido amplamente utilizado e demonstrando uma boa correlação com a atividade antitumoral², sendo então indicado na avaliação preliminar de extratos vegetais³.

Na família Annonaceae, o gênero Duguetia está representado, até o momento, por 70 espécies, mas não está entre os mais estudados fitoquimicamente. O estudo fitoquímico tem se concentrado nos gêneros Annona (120 espécies catalogadas), Goniothalamus (115), Monodora (20), Rollinia (65), Uvaria (150) e Xylopia (100-150)⁴. Diversos alcalóides já foram isolados de várias espécies de Duguetia⁵ e, pelo estudo fitoquímico biomonitorado de D. panamensis, utilizando o ensaio de toxicidade frente a Artemia salina, foi obtida como substância ativa o 2,4,5-trimetoxilestireno (1), porém apresentando baixa toxicidade frente a esse microcrustáceo e também fraca atividade antitumoral⁶.

Duguetia glabriuscula é um arbusto de pouco exemplares em Mato Grosso do Sul. Desta espécie vegetal foi isolado, inicialmente, do extrato hexânico das folhas e agora também isolado das cascas do caule, o (+)-10b,14-allo-aromadendranodiol, (2), essa substância apresentou-se inativa para o microcrustáceo⁷, mas com atividade antimicrobiana considerável⁸. Devido a abundância do referido sesquiterpeno, o mesmo foi submetido a algumas modificações na porção funcional da molécula, conduzindo a produtos de baixa atividade antimicrobiana e com atividade frente a Artemia salina, ainda que pouco significativa⁷.

O objetivo do presente trabalho é o isolamento de substâncias biologicamente ativas do extrato etanólico 95% ativo, em água, obtido das cascas do caule de Duguetia glabriuscula - Annonaceae, pelo estudo cromatográfico biomonitorado, utilizando a Artemia salina como organismo teste.

RESULTADOS E DISCUÇÃO

O extrato etanólico 95% das cascas do caule de D. glabriuscula apresentou atividade sobre o microcrustáceo, TAS, DL₅₀ = 131,7 (76,3-227,5)^†mg/mL. Este extrato então foi submetido a partição entre CHCl₃ e MeOH/H₂O. A atividade se concentrou na fração clorofórmica (TAS, DL₅₀ = 56,6 mg/mL), como descrito na Tabela 1.

Essa fração ativa foi fracionada em coluna, da qual foram obtidas os asaraldeído (3), oxobuxifolina (4), (+)-10,14b-allo-aromadendranodiol (2), descrito anteriormente⁸, lanuginosina (5), polialtina (6) e oliveridina (7).

A substância 3 apresentou aspecto de um sólido branco amorfo. O espectro de RMN de ¹H exibe dois sinais simples relativos a hidrogênios aromáticos em d 7,31 e d 6,48, três sinais de metoxilas aromáticas em d 3,96, 3,91 e 3,86 e um sinal em d 10,30, relacionado ao hidrogênio formila.

O espectro RMN de ¹³C de 3, juntamente com os sinais encontrados no espectro de DEPT 135, evidenciam três sinais intensos relativos as metoxilas aromáticas em d 56,19; d 56,21 e d 56,28. Seis sinais relativos a carbonos aromáticos, aparecem em d 95,90, 108,98, 117,31, 143,55, 155,64, 158,77 e o sinal em d 188,10 do carbono formila⁹. Foi obtido o mapa de contorno HMQC que confirma as correlações observadas para os hidrogênios aromáticos e formila dessa substância. O EM-IE é caracterizado por um pico de íon molecular intenso (sendo também o pico base) a m/z 196 e por um pico M^+. -1 (34%).

As substâncias 4 e 5, derivados de alcalóides oxaporfínicos, possuem espectros no RMN ¹H e ¹³C muito semelhantes. Uma outra observação importante é que quando adicionada à essas substâncias uma solução de ácido clorídrico a 5%, observa-se a formação de cor avermelhada⁵.

Os espectros de RMN de ¹H de 4 e 5 exibem, em cada um deles, 2 sinais de hidrogênios aromáticos (d 8,15 e 8,85, em 4 e d 7,77 e 8,75 em 5) com constantes de acoplamentos, J, igual 5,2 Hz, comum em hidrogênios a e b do anel piridínico (anel B), em C-4 e C-5¹⁰, respectivamente. A diferença do deslocamento químico, d para os hidrogênios em C-4 (d 8,15 para 4 e 7,77 para 5) é devido a presença de uma metoxila em C-3 (anel A) de 4, que provoca um efeito g-gauche sobre H-4 deslocando-o para maiores valores de d. A mesma substituição não é observada em 5 e é confirmada pela presença de um singleto em d 7,09, relativo ao H-3, completando o padrão de substituição de 4 e 5 nesse anel. Observa-se também um sinal simples referente aos hidrogênios do grupo metilenodioxi em d 6,44 em 4 e 6,35 em 5. Mais três sinais de hidrogênios aromáticos, juntamente com um outro sinal de metoxila aparecem em ambas as substâncias e foram atribuídos ao anel D e pelo deslocamento da metoxila e multiplicidade dos hidrogênios, foi possível determinar o padrão de substituição em 4 e 5 (vide dados experimentais).

Semelhanças espectrais também são observadas para as substâncias 6 e 7, uma vez que são derivados de alcalóides aporfínicos-7-oxigenados. Basicamente, observa-se o mesmo padrão para as duas substâncias: a presença do grupo metilenodioxi, em C-1/C-2, que devido à torção do anel no sistema bifenílico, aparece como dupleto (d 6,05 e 5,92 em 6 e 6,08 e 5,96 em 7, J = 1,2 Hz)⁵; a presença de um singleto (d 6,54) em 7 relativo ao hidrogênio em C-3 e para 6, nessa mesma posição, observa-se um singleto de metoxila (d 4,01). Uma informação importante que pode ser obtida no espectro de RMN ¹H para esse tipo de alcalóide 7-oxigenado é a definição da estereoquímica cis ou trans dos hidrogênios H-6a e H-7. Na espécie Duguetia spixiana^,, dentre outras espécies da família Annonaceae⁵, os alcalóides 7-oxigenados apresentam configuração trans e o sinal do espectro é constituído de dupletos com constantes de acoplamento de 9 a 12 Hz (mais comum, 12 Hz)^11,12. Na estereoquímica cis, o J observado foi de 2 a 3 Hz, como descrito para alcalóides isolados do gênero Stephania (Menispermaceae)⁵. O padrão de substituição no anel D, caracterizado em ambas moléculas pela presença de um substituinte em C-9 (metoxila) e os deslocamentos químicos e multiplicidade observados para de H-8, H-10 e H-11.

A substância 2 foi descrita anteriormente⁸.

De todas as substâncias citadas a atividade sobre a Artemia salina convergiu para as 4 e 5, como demonstrado na Tabela 1.

O estudo fitoquímico biomonitorado das cascas do caule de D. glabriuscula convergiu para as frações ativas ao microcrustáceo das quais foram isolados representantes dos alcalóides oxaporfínicos. Os oxaporfínicos têm sido avaliados em diferentes atividades biológicas, entre elas: atividade citotóxica^13-15, anti-agregante plaquetário¹⁶, antimicrobiana e antifúngica¹⁷, e tem sido sugerido, para esse grupo de alcalóides, a predominância da atividade citotóxica¹⁶. Assim, se o TAS tem como interesse convergir para substâncias com atividade citotóxica, presente em um determinado extrato, o estudo fitoquímico biomonitorado das cascas do caule de D. glabriuscula foi efetivo, pois foram isoladas substâncias como a oxobuxifolina e a lanuginosina, ativas ao TAS e merecedoras de testes mais específicos³.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos Experimentais Gerais: Os espectros de RMN de ¹He ¹³C, de 300 e 75MHz, respectivamente, foram registrados em espectrômetro DPX-300-Bruker. Os deslocamentos químicos, d, relativos ao sinal do tetrametilsilano (d=0,0). Os espectros de massas foram obtidos no espectrômetro de massas TRIO-1000 através de injeção direta. Os solventes e reagentes utilizados tiveram grau de pureza P.A. Para as cromatografias em camada delgada (CCD) analítica e preparativa utilizou-se sílica-gel 60 G MERCK.

Ensaio biológico: O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina (TAS) foi executado de acordo com a metodologia proposta por Meyer². Diluições das amostras e do controle positivo foram feitos pelo método de diluições aritméticas em solução aquosa de sal marinho sintético (38g/L, Enterprise Co.) com 1% DMSO (v/v). Todas as etapas foram acompanhadas utilizando-se o sulfato de quinidina como controle positivo² e cada avaliação foi repetida pelo menos duas vezes. Utilizou-se o método Probitos de análise para obtenção das DL₅₀ e respectivos intervalos de confiança. Os extratos foram considerados ativos quando TAS <1000ppm.

Material vegetal: As cascas do caule de Duguetia glabriuscula R. E. Fries (R. E. Fries) - Annonaceae - foram coletadas no município de Jardim/MS. A amostra botânica foi identificada pelo Prof R. de Mello-SiIva. A exsicata foi depositada no Herbário da UFMS (Campo Grande, Mato Grosso do Sul) sob o número 4769.

Obtenção dos extratos vegetais: As cascas do caule foram extraídas exaustivamente com etanol 95% por maceração a 40^oC, concentrados à pressão reduzida e testados (vide Tabela 1). Esse extrato foi então solubilizado em metanol:água 9:1 e submetido a partição entre clorofórmio. A fração clorofórmica, ativa, foi fracionada em coluna cromatográfica (sílica gel, CHCl₃:CH₃OH-gradiente).

Asaraldeído ou 2,4,5-Trimetoxi-benzaldeído (3): Sólido branco amorfo. I.V. n_máx (KBr, cm^-1): 2962, 2920, 2850, 1660, 1609, 1520, 1479, 1292, 1219, 1129, 1027, 864, 823. RMN ¹H: (300 MHz, d): 10,30 (H-7); 7,31 (H-6) e 6,48 (H-3) (s, 1 H cada); 3,96; 3,91; 3,86 (s, 3H cada). RMN ¹³C(75 MHz, d) 188,10 (C-7); 158,64 (C-2); 155,77 (C-4); 143,55 (C-5); 117,31 (C-1); 108,98 (C-6); 95,90 (C-3); 56,28; 56,21; 56,19 (metoxilas). EMIE m/z (int. rel.): 197 [M+1]^.+ (10);196 (100); 195 [M -1]^.+ (34); 181 (68); 150 (53); 125 (84); 69 (91).

Oxobuxifolina (4): Sólido microcristalino alaranjado. U.V g (CH₃OH, nm) 245, 281, 320(ombro), 382, 457; [+ HCl, 1N, 1 gota]; 265, 283, 320 ombro, 408, 530. RMN de ¹H (DMSO-d₆, 300 MHz): 8,85 (d, J = 5,2 Hz, H-5), 8,48 (d, J = 8,8 Hz, H-11), 8,15 (d, J = 5,2 Hz, H-4), 7,77 (d, J = 3,0 Hz, H-8), 7,43 (dd, J = 8,8 e 3,0 Hz, H-10), 6,44 (s, OCH₂O em C-1/C-2), 4,21 e 3,93 (OCH₃ em C-3 e C-9, respectivamente). RMN de ¹³C (DMSO-d₆, 75 MHz): 180,90 (C-7), 158,61 (C-9), 149, 28 (C-1), 146,10 (C-6), 144,11 (C-5), 137,54 (C-2), 134,93 (C-3), 131,63 (C-11a), 130,20 (C-3a), 128,24 (C-11), 126,04 (C-7a), 124,70 (C-11b), 122,18 (C-10), 121,36 (C-11c), 119,01 (C-4), 109,75 (C-8), 103,29 (OCH₂O em C-1/C-2), 60,27 (OCH₃), 55,48 (OCH₃ em C-9). EMIE, m/z (int. rel.) M^.+ 335 (100), 320 [M^.+-CH₃] (73%), 305 [M^.+-CH₂O] (36%).

Lanuginosina (5): Sólido microcristalino alaranjado.RMN 1H: (300 MHz, CDCl₃/MeOD) d: 8,75 (d, J = 5,2 Hz, H-5); 8,43 (d, J = 8,9 Hz, H-11); 7,90 (d, J = 2,9 Hz, H-8); 7,77 (d, J = 5,2 Hz, H-4); 7,23 (dd, J = 8,9 e J = 2,9 Hz, H-10); 7,09 (s, H-3); 6,35 (s, OCH₂O em C-1/C-2) e 3,96 (s, OCH₃ em C-9). EMIE, m/z (int. rel.) M^.+ 305 (100), 304 [M^.+-1] (82), 290 [M^.+-CH₃] (11).

Polialtina (6): sólido amorfo castanho: U.V l (CH₃OH, nm) 215; 239; 283; [+NaOH, 01N, 1 gota] sem alteração. RMN de ¹H (CDCl₃, 300 MHz) 7,88 (d, J = 8,6 Hz, H-11), 7,29 (sl, H-8), 6,84 (dd, J = 8,6 e 2,4 Hz, H-10), 6,05 e 5,92 (dupletos, J = 1,4 Hz, OCH₂O em C-1/C-2), 4,63 (d, J = 12,2 Hz, H-6a), 4,01 e 3,85 (s, OCH₃ em C-3 e C-9, respectivamente), 3,65 (d, J = 12,2 Hz, H-7), 2,65 (s, NCH₃). EMIE, m/z (int. rel.) 355 (90), 337 [M^+. - H₂O] (27), 324 [M^+.- OCH₃] (38) e 312 [M^+.-CH₂NCH₃](31), 43 (100%).

Oliveridina (7): sólido amorfo castanho: U.V l (CH₃OH, nm) 215; 239; 283; [+NaOH, 01N, 1 gota] sem alteração. RMN de ¹H (CDCl₃, 300 MHz): 7,94 (d, J = 9,0 Hz, H-11), 7,34 (dl, J = 2,0 Hz, H-8), 6,87 (dd, J = 9,0 e 2,0 Hz, H-10), 6,54 (s, H-3), 6,08 e 5,96 (dupletos, J = 1,2 Hz, OCH₂O em C-1/C-2), 4,73 (d, J = 12,5 Hz, H-6a), 3,65 (d, J = 12,5 Hz, H-7), 3,86 (s, OCH₃ em C-9), 2,79 (s, NCH₃). RMN de ¹³C (CDCl₃, 75 MHz): 159,16 (C-9), 147,6 (C-2), 141,14 (C-7a), 140,60 (C-1), 127,54 (C-11), 127,23 (C-3a), 121,98 (C-3b), 121,38 (C-11a), 116,48 (C-11b), 113,40 (C-10), 109,11 (C-8), 106,66 (C-3), 100,80 (OCH₂O em C-1/C-2), 69,62 (C-7), 64,39 (C-6a), 59,57 (OCH₃ em C-9), 48,90 (C-5), 40,00 (NCH₃), 22,75 (C-4).

AGRADECIMENTOS

À PROPP/UFMS pelo apoio financeiro. Aos Depto de Química/CCET/UFMS (docentes, corpo técnico) e Chemistry Departament of University of Liverpool - UK por terem gentilmente facilitado as análises das substâncias aqui descritas (RNM ¹H ¹³C, IV e Espectros de massas, respectivamente). À Maria da Conceição Guerra de Souza (Lab. de Farmacognosia, DFB, CCBS, UFMS) pelo apoio técnico durante a execução da parte experimental desse trabalho.

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^†

Intervalo de confiança de 95%.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Jun 2007
• Data do Fascículo
  Abr 2001

Histórico

• Aceito
  02 Ago 2000
• Recebido
  03 Mar 2000