Diterpenóides com esqueleto cleistantano de Vellozia aff. carunculares martius ex seubert (Velloziaceae)

Cleistanthane diterpenoids from Vellozia aff. carunculares martius ex seubert (Velloziaceae)

Resumo

From the hexane extract of leaves, stem and roots, of Vellozia aff. carunculares, fourteen cleistanthane diterpenoids were detected by HRGC-MS, through the analysis of their fragmentation patterns. Comparison of their MS spectra with those of authentic standards previously isolated from other species of the family Velloziaceae allowed the identification, with a high degree of confidence, of eigth known cleistanthane diterpenoids. Of these, four were isolated and identified from their MS, IR and ¹H and 13C NMR spectra, as the known cleistantha-8,11,13-trien-7-one, cleistantha-8,11,13-trien-3,7-dione, cleistantha-1,8,11,13-tetraen-3,7-dione and the first reported 6-alpha-hydroxy-cleistantha-8,11,13-trien-7-one. The triterpenoid beta-amyrin was also isolated.

Vellozia aff. carunculares; Velloziaceae; cleistanthane diterpenoids

Vellozia aff. carunculares; Velloziaceae; cleistanthane diterpenoids

Artigo

DITERPENÓIDES COM ESQUELETO CLEISTANTANO DE VELLOZIA AFF. CARUNCULARES MARTIUS EX SEUBERT (VELLOZIACEAE)

Gilson Cruz da Silva, Ligia Maria Marino Valente, Maria Lucia Patitucci, Angelo da Cunha Pinto

Instituto de Química, Departamento de Química Orgânica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, CT, Bloco A, Ilha do Fundão, 21949-900 Rio de Janeiro - RJ

Nanuza Luíza de Menezes

Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Universidade de São Paulo, 05599-970 São Paulo - SP

Recebido em 24/8/00; aceito em 29/11/00

CLEISTANTHANE DITERPENOIDS FROM VELLOZIA AFF. CARUNCULARES MARTIUS EX SEUBERT (VELLOZIACEAE). From the hexane extract of leaves, stem and roots, of Vellozia aff. carunculares, fourteen cleistanthane diterpenoids were detected by HRGC-MS, through the analysis of their fragmentation patterns. Comparison of their MS spectra with those of authentic standards previously isolated from other species of the family Velloziaceae allowed the identification, with a high degree of confidence, of eigth known cleistanthane diterpenoids. Of these, four were isolated and identified from their MS, IR and ¹H and ¹³C NMR spectra, as the known cleistantha-8,11,13-trien-7-one, cleistantha-8,11,13-trien-3,7-dione, cleistantha-1,8,11,13-tetraen-3,7-dione and the first reported 6-a-hydroxy-cleistantha-8,11,13-trien-7-one. The triterpenoid b-amyrin was also isolated.

Keywords:Vellozia aff. carunculares; Velloziaceae; cleistanthane diterpenoids.

INTRODUÇÃO

Velloziaceae é uma interessante família de plantas tropicais com ocorrência na África e América do Sul, expandindo-se até o Panamá. Possui cerca de 250 espécies de ervas e arbustos perenes, que crescem em solos rochosos ou arenosos, sob alta incidência solar e pouca água¹.

A longevidade dessas plantas, apesar das condições inóspitas das regiões onde são encontradas, vem motivando por mais de duas décadas um estudo fitoquímico, visando encontrar as possíveis substâncias responsáveis por esse comportamento. Assim, de mais de trinta espécies brasileiras dessa família de plantas, foram isolados cerca de 180 diterpenóides inéditos, com nove diferentes tipos de esqueleto, cerca de trinta triterpenóides com seis diferentes tipos de esqueleto² e, mais recentemente, flavonóides³.

Em um estudo sobre a bioatividade da família Velloziaceae, quarenta e seis extratos de vinte e seis espécies foram testados em bioensaio in vitro para atividade antitumoral, contra cultura de leveduras Saccharomyces cerevisiae mutantes que perderam a capacidade de regenerar o DNA⁴. Como resultado, oito apresentaram atividade; destes, a espécie Vellozia candida Mikan teve seus extratos ativos analisados, levando ao isolamento de uma lactona diterpênica ativa⁵.

Vellozia aff. carunculares, uma planta herbácea coletada em Diamantina, MG, é uma espécie quimicamente inédita, cujos extratos se mostraram inativos para a atividade antitumoral.

Este trabalho apresenta os primeiros resultados do estudo fitoquímico do extrato hexânico de Vellozia aff. carunculares. Através de seu perfil químico, traçado por meio de Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada à Espectrometria de Massas (CGAR/EM), foi evidenciada uma composição rica em di e triterpenóides. Posterior isolamento de alguns compostos e a coinjeção dos mesmos em frações brutas permitiu a identificação inequívoca de quatro diterpenóides de esqueleto cleistantano e do triterpenóide b-amirina. A utilização simultânea de técnicas instrumentais acopladas e de metodologia clássica de investigação fitoquímica, apoiada no amplo estudo fitoquímico pré-existente sobre a família Velloziaceae, revelou-se uma estratégia interessante no estudo dessa espécie, permitindo até mesmo a caracterização de compostos minoritários.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Estudo de perfil químico

As folhas, caule e raízes de Vellozia aff. carunculares, depois de secos, foram moídos e percolados seqüencialmente com hexano, AcOEt e MeOH.

Inicialmente, o extrato bruto filtrado [pequena alíquota, cromatografia em coluna (CC) em sílica gel, hexano-AcOEt 70:30 como eluente] foi submetido a CGAR. Aplicando metodologia recentemente desenvolvida⁶, foi possível obter um perfil cromatográfico que permitiu observar a eluição dos componentes do extrato em regiões que seriam características para di e triterpenóides, e detectar a presença de um pico com tempo de retenção maior que os demais (Figura 1).

Uma alíquota de 82,0 mg do extrato foi submetida a CC filtrante em sílica gel (gradiente hexano®AcOEt) gerando nove frações. As cinco primeiras, que se apresentaram menos polares em cromatografia em camada fina (CCF), foram analisadas por CGAR e posteriormente submetidas a CGAR/EM. A observação dos espectros de massas revelou a provável presença dos triterpenóides a ou b-amirona e a ou b-amirina, caracterizados pelos íons M⁺ 424, m/z 218 e 203 e M⁺ 426, m/z 218 e 203, respectivamente⁷ e diterpenóides (M⁺ de 282 à 314).

Estudos de fragmentografia de massas de diterpenóides com esqueleto podocarpano (com o anel C aromático), mostraram que o padrão de fragmentação destes compostos não é usual, mas segue um conjunto de rearranjos estreitamente relacionados^8-11.

Estes estudos envolveram derivados oxigenados em diferentes posições e também o modo como a fragmentação é afetada nestes casos. As informações obtidas na fragmentação dos podocarpanos foram estendidas aos diterpenóides com esqueleto cleistantano¹², em um estudo envolvendo cerca de quarenta substâncias oxigenadas nas posições 3, 7, 11, 17, 18 e 20¹³. Este estudo concluiu que em geral, os cleistantanos apresentam íon molecular e íon correspondente a M⁺-15 bastante intensos, assim como os íons M⁺-85, M⁺-97 e M⁺-111. O espectro de massas do hidrocarboneto M1 foi utilizado como referência, para a análise da influência exercida pela presença de oxigênio em diferentes posições, nas rotas de fragmentação. O Quadro 1 apresenta as estruturas e intensidades relativas dos íons relacionados a M1. No Quadro 2 observam-se os íons característicos de cleistantanos oxigenados nos anéis A e B (posições 3 e 7) e o Quadro 3 apresenta as características dos espectros de massas de cleistantanos oxigenados no anel C e nas metilas 17, 18, 19 e 20¹³.

Das frações obtidas em CC, a de número 3 apresentou um cromatograma de íons totais (Figura 2) com maior diversidade estrutural. Análise dos espectros de massas dos picos a-n (Figura 2a) revelou a presença dos fragmentos característicos para cleistantanos, conforme descrito nos Quadros 1-3, e íon molecular relativo a presença de um a três oxigênios (Tabela 1). Os picos b e d foram também observados na fração 1-2; o pico f foi observado em todas as frações; o pico i, na fração 4 e os picos k e n nas frações 4 e 5.

Com base nestes dados, ficou evidenciada a presença de um total de quatorze diterpenóides com espectros de massas compatíveis com o de cleistantanos. A comparação desses espectros com os de alguns compostos anteriormente isolados de outras espécies da família Velloziaceae^14-16 permitiu a proposição estrutural, com alto grau de confiabilidade, para os picos b-e, i, k e m como sendo os compostos 1-4 e 6-8 respectivamente.

Isolamento de alguns diterpenóides cleistantanos e b-amirina

Baseado nos resultados deste estudo de perfil químico, 5,0 g do extrato bruto foram submetidos a CC sob pressão em sílica gel (gradiente: hexano®AcOEt), sendo obtidas quarenta e seis frações, que foram analisadas por CCF e agrupadas por semelhança. As menos polares foram submetidas a CGAR/EM e recromatografadas em coluna em sílica gel e/ou CCF preparativa, levando ao isolamento dos cleistantanos 1, 5, 6 e 7. Os compostos 1, 6 e 7 foram caracterizados por comparação de seus dados espectrais de Infravermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN¹H) e Espectrometria de Massas (EM) com o de padrões autênticos.

Das frações combinadas 18-19, após acetilação com Ac₂O/DMAP, foi isolado o triterpenóide b-amirina (9), na forma de seu acetato (9a), que foi identificado com base nos seus dados de EM e RMN¹H.

O cleistantano 1 foi isolado anteriormente de V. leptopetala¹⁴ e V. declinans¹⁵ e os cleistantanos 6 e 7 de V. leptopetala¹⁴ e V. piresiana¹⁶. O triterpeno 9 é de ocorrência freqüente na família Velloziaceae.

O composto 5 minoritário, mostrou por EM, M⁺ 300 e um padrão de fragmentação compatível para um diterpenóide de esqueleto cleistantano, com um átomo de oxigênio em C-7 (Tabela 1, pico f). Seu espectro de IV confirmou a presença de um grupo carbonila conjugado (n1665 cm^-1) além de um grupo hidroxila (n 3367 cm^-1). Os espectros de RMN ¹H e ¹³C mostraram sinais que confirmaram o esqueleto diterpênico cleistantano: anel C aromático contendo os grupos metila e etila [d 1,20 (3H, t, J = 7,0Hz), 2,34 (3H, s) e 3,08 (2H, m)], dois hidrogênios aromáticos vicinais (d 7,15, d, J = 8,0Hz e 7,29, d, J = 8,0Hz) e quatro átomos de carbono aromáticos substituídos (d 127,0, 135,4, 145,4 e 154,7). Esses espectros mostraram também um grupo carbonila em d 201,2 e a presença de um grupo hidroxila secundário em posição equatorial (d_H 4,58, 1H, dl, J = 12,3Hz e d_C 74,6). Esses dados permitiram identificar o composto 5 como o diterpenóide 6-a-hidróxi-cleistanta-8,11,13-trieno-7-ona, também isolado de Vellozia leptopetala¹³ e pela primeira vez descrito. Para verificar a possível desidratação do composto 5 no injetor do CG, que resultaria na formação do composto 3, o composto 5 puro foi submetido às mesmas condições de CG-EM. O cromatograma resultante não demonstrou a presença de produtos de degradação.

Coinjeções

Os compostos 1, 6 e 7 majoritários, isolados neste trabalho, foram coinjetados nas frações 1-2 e 3, onde foram inicialmente detectados. Foram observadas coeluições com aumento de cerca de 30% nas áreas dos picos cromatográficos correspondentes.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

O espectro no UV do composto 5 foi feito em MeOH em espectrofotômetro Beckman DB-GT e sua rotação ótica em um polarímetro Perkin-Elmer modelo 241 usando CHCl₃ como solvente. Os espectros de RMN ¹H a 200 MHz (d ppm, J em Hz) foram obtidos em Espectrômetro Brüker AC 2000-A e o espectro de RMN ¹³C a 25,2 MHz do composto 5 foi feito em um espectrômetro Varian XL-100 sempre usando CDCl₃ como solvente e TMS ou solvente como padrão interno. As análises por Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) foram feitas em cromatógrafo HP 5790 em coluna SE-54 (fase: 1% vinil, 5% fenil 94% metilsilicone) de 20 metros, injetor a 270 ^oC e detetor FID a 290 ^oC, vazão do gás de arraste (H₂) de 2 ml min^-1, razão de split 1:20 e volume de injeção de 1 ml, utilizando como programação uma temperatura inicial de 140^oC, com rampa de aquecimento de 12^oC/min até 290^oC, e isoterma de 20 a 30 minutos nesta temperatura. Os espectros de massas foram obtidos a 70 eV em Espectrômetro de Massas HP 5987 A. Os espectros na região do Infravermelho foram obtidos em Espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 467 de feixe duplo, usando pastilhas de KBr. As freqüências de absorção foram medidas em unidades de número de onda (cm^-1). As colunas cromatográficas foram desenvolvidas em sílica gel 60 (35-70 mesh para coluna filtrante e 230-400 mesh para coluna sob pressão). As análises cromatográficas em camada fina analítica foram desenvolvidas em placas pré-preparadas com sílica gel 60 F₂₅₄, com detecção dos compostos sob luz UV (254 e 366 nm) e por borrifamento de CeSO₄/H₂SO₄ seguida de aquecimento; placas cromatográficas de camada fina preparativa foram desenvolvidas em sílica gel 60 PF com espessura de camada de 0,7 mm, detecção sob luz UV e recuperação dos compostos usando CH₂Cl₂ ou AcOEt.

Material vegetal

A espécie Vellozia aff. carunculares utilizada neste estudo foi coletada em Diamantina, Minas Gerais, em 1993. A exsicata encontra-se depositada no herbário do Jardim Botânico da Universidade de São Paulo (São Paulo, Brasil), sob o número 0329-SPF.

Isolamento dos constituintes de V. aff. Carunculares

A planta inteira (raízes, caule e folhas) seca e moída foi percolada sucessivamente com hexano (84,2 g), AcOEt (57,7 g) e MeOH (46,2 g). Parte do extrato hexânico (5,0 g) foi submetida a CC e eluída com mistura de hexano/AcOEt de polaridade crescente, sendo obtidas quarenta e seis frações. Com base no perfil em CCF, três frações combinadas principais foram obtidas: n^os 14-17 (2,4 g), 18-19 (341,5 mg) e 20-21 (774,2 mg). Uma porção de 1,01 g das frações 14-17 foi recromatografada em CC sob pressão com hexano-AcOEt 95:5 como eluente, gerando 30 subfrações. Da subfração 14-16 (158,7 mg), após cristalização, obteve-se 54,1 mg do composto 1 e da subfração 17 (13,7 mg), após CCF preparativa eluída com hexano-AcOEt 99:1, obteve-se o composto 5 (1,3 mg). Parte da fração 20-21 (99,1 mg) após duas CCF preparativas consecutivas usando hexano-AcOEt 97:3 e hexano-i-PrOH 95:5 como eluentes respectivamente, gerou 3,5 mg do composto 7 e uma mistura dos compostos 6 e 7 (3,6 mg). Os dados de RMN ¹H do composto 6 foram obtidos por comparação dos dados em RMN ¹H da mistura dos compostos 6 e 7 com aqueles do composto 7 puro. A fração 18-19 (341,5 mg) foi recromatografada em CC sob pressão, eluindo-se com CH₂Cl₂-AcOEt 70:30, gerando 24 subfrações. Acetilação de 51,2 mg da subfração 16 com 10 mL de Ac₂O e DMAP como catalisador (4 h., t.a.), produziu após purificação com CCF preparativa seguida de cristalização, 8,0 mg do composto 9a.

Cleistanta-8,11,13-trien-7-ona (1)

Cristais incolores (hexano-AcOEt 10:1); p.f.= 88-91^oC; RMN¹H (200 MHz, CDCl₃) d 0,90 (3H, s), 1,01 (3H, s), 1,15 (3H, s), 1,21 (3H, t, J = 7,3 Hz), 2,32 (3H, s), 2,90 (2H, m), 7,08 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (1H, d, J = 8,0 Hz); IV n_max (KBr) cm^-1 2925, 2865, 1672, 1470, 1378, 1270, 1245, 1132; EM 70 eV (ab. rel.) m/z: Tabela 1 (letra b).

6-a-Hidróxi-cleistanta-8,11,13-trien-7-ona (5)

UV l_max (MeOH) nm (log e) 222 (3,87), 257 (3,85) e 302 (2,29); ; IV n_max (KBr) cm^-1 3367, 2933, 1665, 1600, 1445, 1380, 1013, 830; RMN¹H (200 MHz, CDCl₃) d 1,20 (3H-16, t, J = 7,0 Hz), 1,25 (3H, s), 1,34 (6H, s), 1,76 (H-5, d, J = 12,3 Hz), 2,34 (3H-17, s), 3,08 (2H-15, m), 3,83 (OH, sl), 4,58 (H-6, dl, J = 12,3 Hz), 7,15 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,29 (1H, d, J = 8,0 Hz). RMN ¹³C (25,2 MHz, CDCl₃) d 14,0 (C-16), 19,1 (C-17), 19,2 (C-2), 22,0 (C-19), 23,8 (C-15), 25,3 (C-20), 34,1 (C-4), 35,6 (C-18), 39,4 (C-1), 39,5 (C-10), 42,8 (C-3), 55,7 (C-5), 74,6 (C-6), 121,4 (C-11), 127,0 (C-8), 135,4 (C-13), 135,6 (C-12), 145,4 (C-14), 154,7 (C-9), 201,2 (C-7); EM 70 eV (ab. rel.) m/z: Tabela 1 (letra f).

Cleistanta-8,11,13-trien-3,7-diona (7)

IV n_max (KBr) cm^-1 2940, 2860, 1710, 1670, 1460, 1375, 1110; RMN¹H (200 MHz, CDCl₃) d 1,09 (3H, s), 1,20 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,37 (3H, s), 1,51 (3H, s), 2,33 (3H, s), 7,04 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,26 (1H, d, J = 8,2 Hz);. EM 70 eV (ab. rel.) m/z: Tabela 1 (letra k).

Cleistanta-1,8,11,13-tetraen-3,7-diona (6)

IV n_max (KBr) cm^-1 2960, 1700, 1670, 1465, 1375, 1110, 1045, 815; RMN¹H (200 MHz, CDCl₃) d 1,08 (3H, s), 1,20 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,37 (3H, s), 1,52 (3H, s), 2,33 (3H, s), 6,08 (1H, d, J = 10,4 Hz), 7,04 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,26 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,40 (1H, d, J = 10,4 Hz); EM 70 eV (ab. rel.) m/z: Tabela 1 (letra i).

3-b-Acetóxi-oleano-12-eno (9a)

RMN ¹H (200 MHz, CDCl₃) d 0,84 (6H, s), 0,88 (9H, s), 0,94 (3H, s), 0,97 (3H, s), 1,13 (3H, s), 2, 04 (3H, s), 4,51 (1H, m), 5,18 (1H, t, J = 3,5 Hz); EM 70 eV (ab. rel.) m/z 468 (3), 218 (100), 203 (48), 189 (17), 175 (7), 164 (6), 147 (9), 135 (12), 119 (16), 109 (16), 95 (21), 81 (19), 69 (26), 55 (21).

CONCLUSÃO

Através da obtenção do perfil cromatográfico por CGAR e posterior uso de CGAR/EM para determinação do perfil químico, apoiado na análise de padrões de fragmentação, foram detectados, no extrato hexânico de Vellozia aff. carunculares, quatorze diterpenóides com esqueleto cleistantano e triterpenóides. O uso de métodos fitoquímicos clássicos levou ao isolamento de quatro dos cleistantanos detectados e um triterpenóide.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Laboratório de Produtos Naturais-FIOCRUZ, pelos espectros de IV e RMN (200 MHz); ao Laboratório de Análise do DQI/IQ-UFRJ pelos espectros de IV; ao CESTEH/ENSP/FIOCRUZ e LADETEC IQ-UFRJ, pelos espectros de massas e ao CNPq/CEPG-UFRJ e CAPES, pelo apoio financeiro ao projeto.

2. Desde 1978 até o momento, foram publicados cerca de 40 artigos envolvendo o isolamento de di e triterpenóides de Velloziaceae.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Nov 2001
• Data do Fascículo
  Out 2001

Histórico

• Aceito
  29 Nov 2000
• Recebido
  24 Ago 2000