Perfil cromatográfico de duas espécies de Plumbaginaceae: Plumbago scandens L. E Plumbago auriculata Lam

Chromatographic profile of two Plumbaginaceae species: Plumbago scandens L. AND Plumbago auriculata Lam

Plumbago auriculata; Plumbago scandens; HPLC/PDA

Artigo

PERFIL CROMATOGRÁFICO DE DUAS ESPÉCIES DE PLUMBAGINACEAE: Plumbago scandens L. E Plumbago auriculata LAM

Selma Ribeiro de Paiva*, Licínio de Almeida Fontoura e Maria Raquel Figueiredo

Laboratório de Química de Produtos Naturais, Far-Manguinhos, Fundação Oswaldo Cruz, Rua Sizenando Nabuco 100, 21041-250 Rio de Janeiro - RJ

*e-mail: [e-mail]

José Luiz Mazzei

Escola de Química, CT, Bl. E, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, 21949-900 Rio de Janeiro - RJ

Maria Auxiliadora Coelho Kaplan

Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, CCS, Bl. H, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, 21949-900 Rio de Janeiro - RJ

Recebido em 20/2/01; aceito em 27/2/02

CHROMATOGRAPHIC PROFILE OF TWO PLUMBAGINACEAE SPECIES:Plumbago scandens L. AND Plumbago auriculata Lam. The genus Plumbago belongs to the family Plumbaginaceae, order Plumbaginales. Comparative chemical profile of P. scandens (native) and P. auriculata (cultivated) was obtained by normal and reversed-phase high performance liquid chromatography with photodiode array detector. Comparison of the ultraviolet espectra and the retention times for the compounds allowed to find similar metabolic patterns in roots, stems and leaves. Four flavonoids, one phenolic acid or derivative and the naphtoquinone plumbagin were comparatively identified to standards.

Keywords:Plumbago auriculata; Plumbago scandens; HPLC/PDA.

INTRODUÇÃO

Plumbago scandens L. e Plumbago auriculata Lam. (sin. Plumbago capensis Thunb.) pertencem à família Plumbaginaceae, ordem Plumbaginales, superordem Malviflorae¹. Essa família compreende cerca de 20 gêneros e aproximadamente 500 espécies, apresentando uma ampla distribuição geográfica².

Plumbago scandens L. é um sub-arbusto escandente, encontrado em vegetação típica de restinga, caracterizada por alta intensidade luminosa, solo arenoso e vegetação herbácea e arbustiva. P. auriculata Lam. é uma espécie arbustiva originária da África que se apresenta cultivada em locais com elevada exposição à luz e em solo adubado.

Plantas do gênero Plumbago têm sido usadas na medicina popular como anti-reumático, purgativo, contra sífilis e dores de dente^3,4. Em trabalho anterior⁵ de quimiossistemática, naftoquinonas e flavonóides foram considerados marcadores quimiotaxonômicos da ordem Plumbaginales, devido à representatividade e diversidade estrutural desses metabolitos. Algumas das atividades biológicas atribuídas às espécies de Plumbago estão relacionadas com a presença da naftoquinona plumbagina, isolada principalmente das raízes⁶.

A padronização química de plantas medicinais pode envolver técnicas cromatográficas como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que permite análises quali e quantitativas de misturas complexas com alta resolução e sensibilidade.

Gupta e colaboradores⁷ utilizaram CLAE em sílica para a determinação da naftoquinona plumbagina e de um cromeno em Plumbago zeylanica L., que é uma planta considerada medicinal na Índia.

Não se encontra na literatura a aplicação de CLAE para análise de flavonóides nas plantas em questão. No entanto, CLAE em fase reversa com grupos octil e octadecilsilanos é largamente aplicada para a análise de flavonóides em material vegetal. Recentemente Canela e colaboradores⁸ caracterizaram os flavonóides em espécies de Phyllanthus por CLAE com sílica modificada com grupo octadecilsilano sob modo gradiente de composição do eluente. A utilização da cromatografia líquida de alta eficiência conjugada à técnica de detecção por varredura de espectro ao ultravioleta é uma ferramenta muito útil na caracterização do perfil químico de plantas, permitindo caracterizar simultaneamente as substâncias constituintes ou seus principais grupos estruturais.

No presente trabalho foram realizadas análises de naftoquinonas por CLAE em fase normal pelo sistema similar ao de Gupta e colaboradores⁷ e de ácidos fenólicos e flavonóides por CLAE em fase reversa pelo sistema similar ao trabalho de Canela e colaboradores⁸ em amostras de caules, folhas e raízes de P. scandens L. e P. auriculata Lam., de modo a caracterizar o perfil cromatográfico dessas espécies.

PARTE EXPERIMENTAL

Material Botânico

Para este estudo foram coletadas, no estado do Rio de Janeiro, duas espécies em época de floração da família Plumbaginaceae, Plumbago scandens L., nativa, coletada na região de Búzios, e Plumbago auriculata Lam., cultivada no campus da Fundação Oswaldo Cruz, na cidade do Rio de Janeiro. A identificação do material botânico foi realizada por R. J. Paixão e as exsicatas encontram-se depositadas no herbário do Museu Nacional, sob os registros de número 194907 e 193592, respectivamente.

Procedimento de extração

Folhas e caules de ambas espécies foram secos, moídos e submetidos à extração por maceração dinâmica com metanol em mesa giratória modelo Shaker Bigger Bill com rotação de 50 rpm, em temperatura ambiente. Os extratos brutos clorofórmicos das raízes foram obtidos através de extração das raízes secas e moídas em Soxhlet por 30 h. O solvente foi eliminado em evaporador rotatório Büchi R114, com temperatura de 40 °C, equipado com controlador de vácuo e banho refrigerante.

Para as análises cromatográficas em sílica, alíquotas de extrato seco foram dissolvidas, sob ultrasom, à concentração de 30 mg/mL com fase móvel como solvente e posteriormente filtradas em filtros de 0,45 mm. Para as análises em fase reversa as amostras foram dissolvidas em metanol.

Os solventes foram de grau P.A. da Merck para extração e para as análises cromatográficas de grau HPLC/UV da Merck.

Aparelhagem

Para as análises cromatográficas foi utilizado cromatógrafo líquido Shimadzu Class-LC10, equipado com duas bombas LC10AT, detector por varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de fotodiodos SPD-M10A e injetor Rheodyne 7725i com volume de injeção de 20 ml.

Condições da cromatografia líquida de alta eficiência

As naftoquinonas foram avaliadas por CLAE em fase normalutilizando coluna Shim-pack CLC-SIL 250´4,6 mm e pré-coluna Shim-pack CLC-G-SIL 10´4,0 mm, ambos com partículas de sílica de 5 µm, e cicloexano-clorofórmio-isopropanol (50:50:1 v/v) como fase móvel à vazão de 1 ml/min. Detecção por varredura de espectro de 250 nm a 600 nm com acompanhamento em dois comprimentos de onda, 267 nm e 415 nm.

Para análise de flavonóides e substâncias fenólicas utilizou-se CLAE em fase reversa em coluna e pré-coluna com as mesmas dimensões das anteriores, Shim-pack CLC-ODS e CLC-G-ODS, respectivamente, ambas com fase C18. A composição da fase móvel variou em gradiente linear de acetonitrila-água nas proporções de 10:90 v/v a 70:30 v/v em 60 min. Ambas fases continham 0,05% de ácido trifluoroacético. A vazão da fase móvel permaneceu a 1 mL/min. Detecção por varredura de espectro de 200 nm a 400 nm com acompanhamento em 3 comprimentos de onda, 220 nm, 260 nm e 340 nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de flavonóides por CLAE em fase reversa foi executada com gradiente de composição de fase móvel em vista da rica produção de flavonóides em ambas espécies, evidenciada pelo número de substâncias nos resultados cromatográficos aliado à informação dos espectros de ultravioleta. Esta metodologia de gradiente com fase móvel ácida também caracteriza a presença de ácidos fenólicos e seus derivados nos extratos⁸. Um cromatograma típico para extrato metanólico de folhas é apresentado na Figura 1.

A similaridade entre os perfis cromatográficos obtidos para os diferentes órgãos das duas espécies foi avaliada através da comparação dos tempos de retenção dos sinais cromatográficos observados e de seus espectros de absorção obtidos de 220 a 400 nm, conforme apresentado na Tabela 1. A identificação das substâncias flavonoídicas e derivados de ácidos fenólicos foi realizada por comparação com banco de dados de padrões, contendo tempo de retenção e espectro no UV obtidos nas mesmas condições⁸.

Como detalhado na Tabela 1, o flavonóide orientina foi caracterizado nos extratos de caules das duas plantas e de folhas de P. auriculata, do mesmo modo que quercitrina foi caracterizada nos extratos de folhas de ambas espécies e de caule de P. auriculata.

Do mesmo modo, caracterizou-se a presença de outros flavonóides O-glicosilados ou O-metilados, particulares a cada espécie e parte da planta (Tabela 1), pela similaridade dos espectros com padrões de substâncias contendo a aglicona correspondente. Na Figura 2 encontram-se representados os espectros ao ultravioleta dos padrões em comparação com os das substâncias identificadas nos extratos.

Afora estas classes de metabolitos, a análise comparativa do perfil cromatográfico dos extratos metanólicos de folhas e caules de P. scandens e P. auriculata, bem como dos extratos clorofórmicos de raízes das duas espécies, demonstrou que as plantas apresentam perfis cromatográficos peculiares para cada órgão. A análise dos tempos de retenção relacionados na Tabela 1, comparada com os espectros de ultravioleta das substâncias, demonstrou algumas diferenças em relação à produção de metabolitos pelas espécies em questão. Na CLAE em fase reversa observa-se 5 substâncias que estão presentes nos caules das duas espécies, o mesmo acontecendo nos resultados obtidos em análise por CLAE em fase normal (Tabela 2). P. auriculata apresenta maior número de substâncias, dentre as detectadas, tanto nas folhas, como também no caule e nas raízes, o que foi evidenciado através do número de sinais nos cromatogramas. Esses resultados confrontam as observações apresentadas por Larsson e colaboradores⁹, nas quais a quantidade de substâncias fenólicas aumentam em plantas sujeitas a altas taxas de luminosidade e baixa disponibilidade de nutrientes. Assim sendo, uma vez estando P. scandens sujeita a maiores pressões ambientais sendo originária de ambiente pobre em nutrientes, sujeito a altas taxas de luminosidade e temperatura, deveria portanto exibir maior diversidade metabólica, destacando os produtos que pudessem atuar como defesa à radiação solar.

A partir dos dados apresentados na tabela é possível observar, na comparação entre as duas espécies, que ocorre maior equivalência química nas folhas pela similaridade dos sinais cromatográficos e seus respectivos espectros, além da presença de substâncias flavonoídicas. Este resultado referenda a peculiar proximidade taxonômica das plantas através do seu metabolismo secundário.

A análise de naftoquinonas por CLAE em fase normal foi executada no modo isocrático porque a utilização do modo gradiente implicaria em alteração significativa da linha-base devido à alta absorção ao ultravioleta dos solventes. O método foi desenvolvido partindo da composição da fase móvel conforme o método de Gupta e colaboradores⁷ e modulando a mesma, de modo a obter melhor resolução entre as substâncias. Os dados cromatográficos e espectrométricos obtidos foram analisados como descrito para substâncias fenólicas. A produção de quinonas pelas espécies em questão (Tabela 2) foi comprovada através da comparação dos espectros obtidos com o da naftoquinona plumbagina padrão. Um cromatograma típico para extrato metanólico de folhas em CLAE em fase normal é apresentado na Figura 3.

Como detalhado na Tabela 2, foram caracterizadas nove quinonas, incluindo a naftoquinona plumbagina que foi encontrada nos caules e raízes de ambas espécies. A análise por CLAE em fase normal novamente demonstra a maior produção de metabolitos em P. auriculata, confirmando o que já havia sido verificado na análise por CLAE em fase reversa.

A presença de quinonas foi observada em todos os órgãos das plantas em estudo, entretanto foram verificadas diferenças significativas relativas aos órgãos de maior ocorrência dessas substâncias. Em P. auriculata há predominância de quinonas nos caules, enquanto em P. scandens o maior número de substâncias dessa classe metabólica foi caracterizado nas folhas.

Em trabalho anterior¹⁰, a substância plumbagina havia sido isolada através de metodologia fitoquímica clássica e caracterizada por métodos espectrométricos. Essa naftoquinona foi caracterizada como produto majoritário produzido nas raízes de P. auriculata e P. scandens, representando cerca de 12% a 20% do extrato bruto.

A plumbagina foi caracterizada em CLAE em fase normal apresentando tempo de retenção de aproximadamente 4min (Tabela 2). Sua identificação foi realizada através da injeção de seu padrão e posterior comparação espectrométrica (Figura 4).

CONCLUSÃO

Perfis cromatográficos de folhas, caules e raízes de Plumbago auriculata e P. scandens foram caracterizados por CLAE em fase normal e em fase reversa para estudos de padronização química destas plantas, visando principalmente flavonóides e naftoquinonas. Plumbago auriculata demonstrou maior representatividade para as classes químicas analisadas, além de uma maior produção metabólica. Com a identificação da presença de quatro flavonóides, um ácido fenólico ou derivado e da naftoquinona plumbagina, além da caracterização de outras oito quinonas, o presente trabalho veio reafirmar os dados já obtidos em estudos anteriores de quimiossistemática da ordem Plumbaginales. A naftoquinona plumbagina, presente em grande quantidade nas raízes de ambas espécies pode indicar um desvio metabólico para sua produção, que deve apresentar uma função bastante significativa nessas espécies.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à R. J. Paixão (Museu Nacional, UFRJ), M. B. S. Almeida (Far-Manguinhos), à Central Analítica de Far-Manguinhos e às entidades de fomento, CAPES e CNPq.

REFERÊNCIAS

• 1. Dahlgren, R. M. T.; Bot. J. Linn. Soc. 1980, 80, 91.
• 2. Joly, A. B.; Botânica: Introdução à Taxonomia Vegetal, Companhia Editora Nacional: São Paulo, 1977, p. 542.
• 3. Corrêa, M. P.; Dicionário de Plantas Úteis do Brasil, Imprensa Nacional: Rio de Janeiro, 1926, vol. 1, p. 351.
• 4. Morton, J. F.; Atlas of Medicinal Plants of Middle America, Charles Thomas Publisher: Springfield, 1981, p. 1420.
• 5. Paiva, S. R. de; Kaplan, M. A. C.; Gottlieb, O. R.; An. Acad. Bras. Cienc. 1995, 67 (supl. 3), 461.
• 6. Lima, O. G. de; D'Albuquerque, I. L.; Maciel, G. M.; Maciel, M. C. N.; Rev. Inst. Antibiot. 1968, 8, 95.
• 7. Gupta, M. M.; Verma, R. K.; Uniyal, G. C.; Jain, S. P.; J. Chromatogr. 1993, 637, 209.
• 8. Canela, J. P. F.; Almeida, M. B. S.; Mazzei, J. L.; Silva, A. I. F.; Ferreira, J. L. P.; Gilbert, B.; Abstracts of 7^th Latin-American Congress on Chromatography and Related Techniques, Águas de São Pedro, Brasil, 1998.
• 9. Larsson, S.; Wirén, A.; Lundgren, L.; Ericson, T.; Oikos 1986, 47, 205.
• 10. Paiva, S. R. de.; Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil, 1999.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Nov 2002
• Data do Fascículo
  Set 2002

Histórico

• Aceito
  27 Fev 2002
• Recebido
  20 Fev 2001