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Química Nova

Print version ISSN 0100-4042On-line version ISSN 1678-7064

Quím. Nova vol.25 no.6b São Paulo Nov./Dec. 2002

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422002000700006 

Artigo

METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE Protium heptaphyllum MARCH


Paulo Nogueira Bandeira, Otília Deusdênia Loiola Pessoa, Maria Teresa Salles Trevisan e Telma Leda Gomes Lemos*
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, CP 12200, 60021-970 Fortaleza - CE

*e-mail: tlemos@dqoi.ufc.br

Recebido em 21/9/01; aceito em 20/3/02


 

 

SECONDARY METABOLITES OF PROTIUM HEPTAPHYLLUM MARCH. Phytochemical investigation of the resin, fruits, leaves, and trunk of Protium heptaphyllum led to the isolation of the monoterpene p-menth-3-ene-1,2,8-triol, a and b amyrin, quercetin, brein, quercetin-3-O-rhamnosyl, (-) catechin and scopoletin. Their structures were established by 1D and 2D NMR spectroscopy and comparison with published data.

Keywords: Protium heptaphyllum; Burseraceae; p-menth-3-ene-1,2,8-triol.

 

 

INTRODUÇÃO

A família Burseraceae compreende 16 gêneros e mais de 800 espécies tropicais e subtropicais. Alguns gêneros desta família são produtores de uma seiva oleosa rica em óleo essencial e triterpenos das séries oleano, ursano e eufano1. A espécie Protium heptaphyllum, conhecida popularmente como almecegueira, breu-branco-verdadeiro, almecegueira cheirosa, almecegueira de cheiro, almecegueira vermelha ou almecegueiro bravo, ocorre em todo Brasil, sendo largamente encontrada na região amazônica, onde sua seiva é conhecida como breu branco, goma limão, almécega do Brasil2. Na medicina popular, esta espécie é considerada como um importante agente terapêutico, sendo utilizada como antiinflamatório, analgésico, expectorante e cicatrizante. É utilizada também na indústria de verniz e calafetagem de embarcações3. Recentemente, estudos farmacológicos realizados com o óleo da resina comprovaram sua eficácia terapêutica, demonstrando atividades antiinflamatória, antinociceptiva e antineoplásica4. Há registros de vários trabalhos sobre a composição química da resina de P. heptaphyllum5-7. O mais recente relata a caracterização de oito triterpenos, os quais foram caracterizados em misturas binárias8.

O presente trabalho representa uma complementação aos estudos fitoquímicos já existentes sobre a composição química da resina, estendendo-se a outras partes da planta, tais como caule, folhas e frutos de um exemplar coletado no estado do Ceará. Da resina, além do óleo essencial, cujo teor é de 11%, foram isolados o monoterpeno triidroxilado 1, os triterpenos a-amirina, b-amirina e breina; dos frutos verdes, (-) catequina; dos frutos maduros e folhas, os flavonóides quercetina e quercetina-3-O-ramnosil, respectivamente; e do caule, escopoletina. O registro de monoterpenos triidroxilados é bastante raro, encontrando-se apenas oito exemplos9-13, dentre estes, o composto 1 na forma 2-O-acetil, o qual foi isolado da espécie Asiasari radix14. Embora todos os compostos isolados sejam conhecidos, este é o primeiro trabalho que menciona o isolamento de outras classes de metabólitos secundários diferentes de terpenos para a espécie em investigação. A composição química do óleo essencial da resina, caule, folhas e frutos de P. heptaphyllum foi recentemente publicada7.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O composto 1, foi isolado como um sólido cristalino, com p.f. 137¾ 138 °C e [a]20D + 2° (c 0,2 CH3OH). Seu espectro de infravermelho apresentou bandas em 3292 e 1135 cm-1 típicas de grupos hidroxila de álcoois, além de bandas em 1478 e 1458 cm-1 referentes a um sistema olefínico. A análise dos espectros de RMN 13C (BBD e DEPT 135°) indicou a presença de três átomos de carbono não-hidrogenado (um sp2 e dois sp3), dois carbonos metínicos (um sp2), dois metilênicos e três grupos metila. De acordo com os valores dos deslocamentos químicos, dois dos carbonos não hidrogenados e um metínico são oxigenados. Estes dados, aliados àqueles do espectro de RMN 1H permitiram sugerir a formula molecular C10H18O3, em acordo com o pico do íon molecular em m/z 186 (M+•), observado no espectro de massas obtido a 70 eV. A presença de uma ligação dupla trissubstituída foi evidenciada pelas absorções em dC 122,4 (CH) e 147,2 (C) e confirmada pela absorção em dH 5,58 (m), referente a um hidrogênio olefínico. O espectro de RMN1H revelou dois singletos intensos em dH 1,14 (3H) e 1,27 (6H) que, de acordo com a integração, correspondem a três grupos metila, os quais, através do experimento HMQC, foram associados aos sinais em dC 21,9; 29,1 e 29,2, respectivamente. O experimento HMBC mostrou a correlação dos átomos de carbono em dC 73,1 e 147,2 com os hidrogênios de dois grupos metilas, com os hidrogênios de um carbono metilênico e ainda com o hidrogênio olefínico. Observou-se também a correlação do carbono quaternário oxigenado em dC 72,7 com os hidrogênios referentes aos sinais em dH 1,14 (3H); 3,90 (1H) e 5,58 (1H), enquanto o carbono em dC 74,9 mostrou acoplamento com os hidrogênios correspondentes aos sinais em dH 1,14 (3H) e 1,60-1,70 (2H). Com base nestes resultados e nos dados descritos na Tabela 1, chegou-se à conclusão de que o composto 1 se trata de um monoterpeno triidroxilado, caracterizado como p-ment-3-eno-1,2,8-triol. A configuração cis das hidroxilas localizadas em C-1 e C-2 foi determinada através do efeito NOE observado no sinal relativo aos hidrogênios da metila em C-7, por irradiação na freqüência do hidrogênio carbinólico H-2. Estes dados permitiram definir a configuração relativa de 1. Como comentado anteriormente, a literatura cita o isolamento deste composto apenas na forma acetilada14.

 

 

Três compostos foram isolados da resina e identificados como sendo triterpenos pentacíclicos, através das informações fornecidas por seus espectros de RMN 13C totalmente desacoplado (BBD) e DEPT 135° correspondentes. A identificação individual de cada substância foi realizada levando-se em conta o padrão de hidrogenação de cada átomo de carbono, os deslocamentos químicos dos átomos de carbono, principalmente dos carbonos de ligação dupla, e ainda o número de metilas e multiplicidade destas, observadas nos espectros de RMN1H. Assim, dois dos compostos foram identificados como sendo a mistura de a e b-amirina15 e o terceiro, como breina16.

Três flavanóides foram identificados através de seus respectivos espectros de RMN13C (BBD e DEPT 135°) e 1H. Os espectros de carbono-13 de dois deles revelaram sinais correspondentes a 15 átomos de carbono que, de acordo com os valores de deslocamentos químicos, são compatíveis com a estrutura de uma catequina e um flavonol, respectivamente. De acordo com os espectros de RMN1H de dois destes flavonóides, a multiplicidade dos sinais na região de aromático mostrou-se semelhante indicando, portanto, o mesmo padrão de substituição, permitindo posicionar grupos hidroxilas nos carbonos 5 e 7 do anel A e 3' e 4' do anel B. O espectro de RMN13C do terceiro flavonóide revelou sinais correspondentes a 21 átomos de carbono, 6 deles relativos a uma unidade de açúcar, a qual após análise dos deslocamentos químicos de hidrogênio e carbono-13 foi identificada como a ramnose. Os deslocamentos químicos dos 15 átomos de carbono restantes mostraram-se semelhantes aos do flavonol indicando, portanto, que a única diferença entre estes constituintes trata-se do substituinte ligado ao C-3, em um deles um grupo hidroxila, enquanto no outro, a ramnose. Desta forma, os três flavonóides foram identificados como: (-) catequina17, quercetina18 e quercetina-3-O-ramnosil19, respectivamente.

O espectro de RMN13C do oitavo composto isolado apresentou sinais correspondentes a 10 átomos de carbono, dentre estes 9 com hibridação sp2, sendo 3 oxigenados e uma carbonila de éster conjugado. O espectro de RMN1H revelou absorções relacionadas a uma metoxila e 2 hidrogênios de ligação dupla com configuração cis. Estes dados permitiram propor que este metabólito secundário trata-se de uma cumarina dissubstituída, identificada como escopoletina20.

Na determinação estrutural de todos os compostos, foram também utilizadas técnicas de RMN 2D, como HMQC e HMBC, e suas estruturas foram corroboradas mediante comparação dos dados obtidos, inclusive ponto de fusão, com aqueles registrados na literatura.

Como parte do nosso programa de isolamento e caracterização de princípios ativos naturais de plantas, foi recentemente implantada a linha de pesquisa em biotecnologia, onde testes estão sendo realizados visando encontrar compostos neuroativos, úteis para o tratamento da doença de Alzheimer. Uma das terapias mais utilizadas envolve o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE). Embora os inibidores mais utilizados sejam os alcalóides, a resina e todos os constituintes químicos isolados de P. heptaphyllum foram testados. Destes, apenas a resina e a (-) catequina apresentaram inibição da acetilcolinesterase, nas concentrações de 0,5 mg/mL e 1,0 mg/mL, respectivamente.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os pontos de fusão (p.f.) foram determinados em equipamento Mettler com placa aquecedora, modelo FP52 e unidade de controle FP5. Os espectros na região do infravermelho (IV) foram obtidos em pastilhas de KBr utilizando espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 1000. As rotações ópticas foram medidas em espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 341. Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram obtidos em espectrômetro Bruker ARX-500, usando-se CD3OD ou CDCl3 como solvente e TMS como referência interna. Os espectros de massas foram obtidos em um espectrômetro VG-Auto Spec da FISONS INSTRUMENT, operando a 70 eV. Nas cromatografias em coluna utilizou-se sílica gel 60S.

Material vegetal

As partes botânicas da espécie em estudo foram coletadas na chapada do Araripe (Crato-CE), em setembro e novembro de 1998. A identificação da espécie foi realizada por botânicos do Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, onde se encontra depositada a exsicata sob o N° 28509.

Isolamento dos constituintes químicos

A seiva exsudada do caule (50 g), os frutos verdes (350 g) e os frutos maduros (500 g) foram submetidos ao processo de hidrodestilação, obtendo-se seus óleos essenciais nos teores de 11,0%, 3,0% e 1,5%, respectivamente. O decocto da resina foi evaporado sobre pressão reduzida obtendo-se 1,2 g de resíduo, enquanto os decoctos provenientes dos frutos verdes e maduros foram submetidos à partição utilizando AcOEt, para fornecer 0,8 g e 1,4 g de extratos, respectivamente. Do resíduo proveniente do decocto da resina foi isoladoatravés de coluna cromatográfica em gel de sílica e por eluição com AcOEt/MeOH 4:1, o monoterpeno 1. Da resina bruta foram obtidos os triterpenos a-amirina, b-amirina e breina. Os extratos AcOEt dos decoctos dos frutos verdes e maduros, após cromatografia em gel de sílica, forneceram os compostos (-) catequina e quercetina-3-O-ramnosil, respectivamente.

As folhas (1,2 kg) e caule (2 kg), após secos à temperatura ambiente e triturados, foram submetidos à extração com EtOH. A destilação das soluções sob pressão reduzida, forneceu 20 g de extrato das folhas e 24 g de extrato do caule. A cromatografia do extrato EtOH das folhas, em coluna aberta, utilizando-se gel de sílica e AcOEt como eluente, resultou no isolamento da quercetina. Do extrato EtOH do caule, seguindo-se o procedimento descrito acima, obteve-se a escopoletina.

p-Ment-3-eno-1,2,8-triol (1, 5,0 mg). p.f. 137-138 °C. [a]20D + 2° (c 0,2 CH3OH). IV(KBr) nmax cm-1: 3293, 2976, 1458, 1366, 1135. EM (70eV) m/z (intensidade relativa) 186 (M+•), 168 (4), 150 (5), 107 (34), 95 (100), 59 (46), 43 (65). RMN 1H (500 MHz, CD3OD) e 13C (125 MHz, CD3OD), Tabela 1.

Teste de inibição da AChE

A resina e os compostos isolados de P. heptaphyllum, foram individualmente dissolvidos em CHCl3. Cada amostra foi diluída até um fator de 1 mg/mL e aplicada em placa cromatográfica de alumina (5.0 mL). A placa foi borrifada com a solução de ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzóico] (reagente de Ellman, DTNB) e iodeto de acetiltiocolina (ACTI) 1 mM e, em seguida, com a enzima acetilcolinesterase (AChE) 3 U/mL. Após 10 min, observou-se as zonas onde houve inibição da enzima contrastando com a coloração amarela proveniente da reação da tiocolina com o reagente de Ellman. O teste, incluindo o preparo das soluções, foi realizado segundo metodologia desenvolvida por Rhee et al.21.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq, CAPES e FUNCAP pelos financiamentos e bolsas que permitiram a realização deste trabalho, e ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREM), Universidade Federal do Ceará, pela obtenção dos espectros.

 

REFERÊNCIAS

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