SPR: Uma nova ferramenta para biossensores

SPR: New tool for biosensors

surface plasmon ressonance-SPR; electrochemistry; biosensors and biomolecules interactions

DIVULGAÇÃO

SPR - Uma nova ferramenta para biossensores

SPR - New tool for biosensors

Rosangela M. de Carvalho; Susanne Rath; Lauro T. Kubota

Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas, SP

^{Endereço para correspondência}

ABSTRACT

This paper reviewed the development and theoretical aspects of surface plasmon ressonance (SPR) technique and discusses this powerful sensor technology in the development of biosensors, as well as for the investigation of biological interactions and clinical assays. The SPR has been proven to be a valuable tool to investigate dynamic processes, such as adsorption, degradation, determination of dieletric properties, association/dissociation kinetics, affinity constants of specific ligand-ligate interactions, allowing real-time analysis at almost any surface. The SPR as a complementary technique alongside electrochemical methods is also presented.

Keywords: surface plasmon ressonance-SPR; electrochemistry; biosensors and biomolecules interactions.

INTRODUÇÃO

Durante as duas últimas décadas houve um avanço significativo no desenvolvimento de sensores e biossensores ópticos para determinações de espécies de interesse químico e biológico. O primeiro sensor com transdução químico óptico foi baseado na medida de mudanças no espectro de absorção e foi desenvolvido para determinações de CO₂ e O₂. Desde então, uma variedade de sistemas ópticos de detecção estão sendo utilizados em sensores e biossensores, incluindo, entre outros, elipsometria, espectroscopia (luminescência, fosforescência, fluorescência, Raman), interferometria (interferometria de luz branca, interferometria modal) e, finalmente, a ressonância de plasma de superfície (SPR ¾ "surface plasmon resonance"). Nestes sensores, a quantificação da espécie de interesse é realizada por medidas do índice de refração, quantidade de luz absorvida, propriedades fluorescentes das moléculas analisadas ou um meio de transdução químico-óptico¹ .

O potencial da ressonância de plasma de superfície, para caracterização de filmes finos e monitoramento de processos em interfaces metálicas, foi reconhecido no final dos anos 70^2,3, logo após Nylander e Liedberg^4,5 terem demonstrado a viabilidade do emprego da SPR como sistema de detecção em sensores e biossensores para detecção de gases. Estes estudos contribuíram para o desenvolvimento do primeiro biossensor comercial em 1990. Desde então, a ressonância de plasma de superfície recebe contínua atenção da comunidade científica, o que se verifica pelo desenvolvimento de novas configurações, bem como nas aplicações de aparelhos utilizando a técnica de SPR para medidas físicas, químicas e biológicas. No entanto, o grande avanço da SPR relatado em vários artigos está na sua bio-sensibilidade, sendo que mais de 80% dos artigos publicados tem como objetivo o estudo de interações biomoleculares, Figura 1. Nesta área, a SPR acoplada aos métodos de superfície orientada mostra um grande potencial para desenvolvimento e preparação de biossensores de afinidade, permitindo análise em tempo real de interações bio-específicas sem uso de marcadores. Nos últimos anos, a técnica de ressonância de plasma de superfície está sendo acoplada às mais diferentes técnicas, dentre estas, em destaque, as eletroquímicas.

ASPECTOS TEÓRICOS

A técnica de ressonância de plasma de superfície baseia-se nas propriedades ópticas e pode ser empregada para estudos de fenômenos de superfície, monitorando a medida da mudança do índice de refração devido, por exemplo, a ligação de uma camada orgânica à superfície do metal^6-13. O efeito de ressonância de plasma de superfície é uma oscilação da densidade de carga longitudinal, ao longo da interface de dois meios com constantes dielétricas de sinais opostos, onde um é metal e outro, um dielétrico^14,15. A escolha do metal a ser usado é crítica, pois o metal deve exibir comportamento de elétrons livres. Os metais mais adequados são prata, ouro, cobre e alumínio, dentre os quais a prata e o ouro são os mais empregados^16,17. Para excitação do plasma de superfície dois diferentes sistemas experimentais foram desenvolvidos, um por Otto¹⁸ e outro por Kretschmann¹⁹, porém a configuração de refletância total atenuada, desenvolvida por Kretschmann, é normalmente usada na maior parte dos instrumentos de SPR^7,14.

A configuração de Kretschmann, Figura 2, baseia-se no fenômeno de reflexão interna total. Este fenômeno ocorre quando a luz polarizada atravessa um meio óptico denso (ex. vidro) e alcança uma interface entre este meio e um meio de densidade óptica menor (ex. ar), e é refletida de volta para o meio mais denso. Embora a luz incidente seja totalmente refletida internamente, uma componente desta radiação, onda ou campo evanescente, penetra na interface do meio menos denso, até a distância de um comprimento de onda, 1l. Em um determinado ângulo de incidência, quando o vetor de onda do plasma é igual ao vetor de onda do campo evanescente (K_sp = K_ev), parte da radiação acopla com os elétrons livres oscilantes (plasma) no filme metálico, ocorrendo a ressonância de plasma de superfície. Em conseqüência, ocorre uma perda de energia da luz incidente para o filme metálico, resultando na redução da intensidade da luz refletida, a qual pode ser detectada como um arranjo bidimensional de fotodiodos.

Os instrumentos de SPR empregam, geralmente, uma fonte de luz monocromática p-polarizada e a interface entre os dois meios opticamente densos é coberta com um filme metálico fino de espessura menor que um comprimento de onda da luz. O vetor de onda do campo evanescente (K_ev) é dado por:

onde, W₀ é a freqüência da luz incidente, h_g o índice de refração do meio denso (vidro), q o ângulo de incidência da luz e c a velocidade da luz no vácuo. O vetor de onda do plasma de superfície (K_sp) pode ser aproximado para:

onde, e_m é a constante dielétrica do filme metálico e h_s o índice de refração do meio dielétrico.

O vetor de onda do plasma de superfície K_sp é dependente do índice de refração (Eq. 2), do meio água/ar acima do filme metálico, o qual pode ser monitorado para a espessura de aproximadamente 300 nm acima da superfície do metal (dentro dos limites de detecção da SPR). Se o índice de refração imediatamente acima da superfície do metal sofre alguma alteração, pela adsorção de uma camada protéica, ou qualquer outra molécula, uma mudança no ângulo de incidência é requerida para que a excitação do plasma de superfície ocorra. Através do monitoramento deste ângulo no qual ocorre a ressonância, durante um processo de adsorção em função do tempo, um perfil de adsorção pode ser obtido pela técnica de SPR. Variações em torno de 0,5 miligraus, correspondente a uma resolução de aproximadamente 1 x 10^-5 de índice de refração (para l_i = 670 nm), podem ser detectadas^{6, 14}, porém a resolução depende do comprimento de onda da luz incidente (l_i).

Uma configuração esquemática de um instrumento típico de SPR é apresentada na Figura 3. A superfície do SPR (lâmina) pode ser modificada para monitorar processos de adsorção/interação para uma variedade de superfícies por ligação/acoplamento de camadas finas sobre o filme metálico. Estas camadas podem constituir-se de monocamadas agrupadas pela variação dos grupos funcionais e terminais, bicamadas lipídicas ou filmes poliméricos.

Um esquema de um perfil típico de adsorção de SPR durante a adsorção de uma monocamada protéica sobre uma superfície metálica coberta com polímero é mostrado na Figura 4. Inicialmente, a superfície é preparada com uma solução tampão adequada para gerar uma linha base sob a curva SPR. Uma vez que a proteína entra em contato com a superfície, ocorre uma adsorção rápida, a qual resulta em um aumento no ângulo de ressonância do SPR, seguido por um patamar no perfil de adsorção, devido à saturação da superfície com a proteína ou porque o processo atingiu o equilíbrio. Finalmente, a solução protéica é trocada pelo tampão, que remove somente o material fracamente ligado. A diferença entre o ângulo de ressonância inicial e o final fornece uma indicação sobre a extensão da adsorção. O gradiente positivo da curva de adsorção do SPR determina a velocidade de adsorção¹⁴. Além da avaliação de afinidades e interações moleculares, a técnica de SPR pode, ainda, ser utilizada para análises quantitativas, estudos de especificidade, análises cinéticas, avaliação de efeitos alostéricos e para comparação de modelos de ligação de diferentes espécies.

Mais de 80% dos artigos publicados utilizando a técnica de SPR destinam-se a aplicações nas áreas biológica e clínica para o estudo de interações biomoleculares e bioespecíficas⁶, embora a técnica também tenha sido aplicada no campo da física, principalmente envolvendo estudos de monocamadas, bicamadas orgânicas, bem como filmes poliméricos. Outro ponto de grande relevância, que é destacado neste trabalho é a associação da técnica de SPR com outras técnicas, em que se destaca a associação da técnica de SPR com a eletroquímica, como ferramenta para o desenvolvimento de sensores e biossensores.

Aplicações biológicas e clínicas

A espectrometria de ressonância de plasma de superfície pode ser utilizada para uma série de estudos, envolvendo cinéticas de adsorção¾dessorção, interações antígeno-anticorpo, proteína¾ligante, receptor¾ligante, proteína-DNA, DNA-DNA, RNA-RNA, etc^20-43.

No emprego da espectrometria de SPR como elemento de transdução dos biossensores e/ou imunossensores, o anticorpo ou antígeno pode ser imobilizado sobre a superfície do metal, por adsorção direta ou por um acoplamento indireto através de uma matriz de carboximetildextrana, ponte avidina-biotin, ou hidrogel à base de dextrana, sobre o metal^32,44-46. A camada hidrofílica aumenta a sensibilidade do SPR, protege o metal da adsorção de proteínas não específicas e permite a regeneração da superfície devido à ligação reversível do anticorpo ou antígeno à matriz. Quando um analito interage com a espécie imobilizada, o índice de refração da interface metal-solução sofre alteração^21,14.

O emprego da SPR como sistema de transdução em imunossensores destaca-se em investigações de modelos de interações de processos de reconhecimento molecular^22,47-50. Tsoi e colaboradores²² empregaram a SPR para estudar interações entre uma série de dupla hélice de DNA (dsDNA) e DNA de enzimas polimerases. As moléculas de DNA foram imobilizadas sobre a superfície de ouro por um procedimento controlado de monocamada de biotin, avidina e uma camada de fita dupla de DNA biotin. Os resultados deste estudo demonstraram a facilidade do uso da SPR para estudar eventos de reconhecimento molecular como uma base simples para discriminação, envolvendo interações proteína-DNA. Outros artigos desta natureza foram publicados, sendo que muitos destes fazem referência a medidas de hibridização de DNA e RNA^23,24. Alguns exemplos estão descritos na Tabela 1.

Dos estudos de interações antígeno-anticorpo, cita-se o realizado por Shaw e colaboradores⁵¹ que verificaram a interação entre antígeno (5T4) de diferentes carcinomas e anticorpos (mAB5T4). Estes estudos são de grande relevância, pois o uso de um anticorpo específico oferece a possibilidade de uma terapia específica com toxicidade reduzida aos tecidos normais, comparados com tratamentos convencionais. Destacam-se, também, estudos de interações antígeno-anticorpo, realizados por Otamiri e colaboradores⁴¹, pois estas interações possuem um papel importante em reações imunológicas durante um transplante, visto que a rejeição de órgãos transplantados muitas vezes está associada com interação de anticorpos com carboidratos incompatíveis.

Além da aplicação da técnica de SPR para caracterização de interações biomoleculares, a técnica também pode ser utilizada para quantificação dessas interações (alguns exemplos podem ser visualizados na Tabela 2). Cita-se o trabalho realizado por Gómara e colaboradores⁵², onde utiliza-se um biossensor comercial (BIACORE 1000, Biacore AB, Uppsala) para detecção do vírus da hepatite A (HAV), através da imobilização de peptídeos sintéticos (VP3) com carbodiimida. Os resultados demonstraram alta eficiência analítica e um potencial clínico no diagnóstico da hepatite A. Este dispositivo mostrou ser uma ferramenta poderosa para rastreamento clínico, de fácil uso, rápido e confiável. Outras aplicações dessa natureza podem ser encontradas na literatura^53-58.

A SPR também pode ser usada para monitorar interações proteína-proteína, ou proteína-ligante em tempo real e ainda permite a quantificação das espécies que estão interagindo. Para proteínas de 20 KDa (ex. interleucina e interferons), o limite de detecção da técnica é de 10^-8 mol L^-1. Logo, a aplicação de SPR em análises de fluídos biológicos é restrita para concentrações nesta ordem de grandeza. Entretanto, verifica-se a partir da literatura, esforços no sentido de melhorar esse limite de detecção da SPR^8,59,60.

Lahiri e colaboradores⁶¹ utilizaram SPR para quantificar a ligação da anidrase carbônica (CA) a grupos benzenosulfonamida de monocamadas auto-organizadas. Ainda em outro trabalho, os autores descrevem dois procedimentos para imobilização de 10 proteínas de baixo peso molecular sobre monocamadas auto-organizadas. Comparações de constantes cinéticas e termodinâmicas foram realizadas⁶². A importância de estudos nesta área é o conhecimento das cinéticas de ligações bioespecíficas de proteínas em superfícies.

Uma outra forma de caracterização das interações macromoleculares é através da análise das constantes cinéticas. A técnica de SPR é uma ferramenta poderosa para este fim, pois as análises podem ser feitas em tempo real. Análises cinéticas para avaliação e determinação de constantes de afinidades (associação, dissociação), ordem de reação, entre outros, foram apresentadas em diversos artigos^63-73.

Vários tipos de imunossensores, biossensores e sensores já foram desenvolvidos, utilizando SPR como elemento de transdução^74-80. Dentre as aplicações destacam-se a determinação de pesticidas, como antrazina^77,78, análise de interações entre albumia de soro humano e fármacos, entre outras, ácido salicílico, diazepam e cumarina⁷⁹, e monitoramento de mudanças conformacionais de proteínas imobilizadas⁸⁰. Os imunossensores, sensores e biossensores podem ser empregados em combinação com outras técnicas de detecção altamente sensíveis e seletivas, como espectrometria de massa, cromatografia e espectroscopia fotoeletrônica de raios-X, etc^81-86. Alguns exemplos podem ser visualizados na Tabela 3.

Aplicações físicas

Inicialmente a técnica de SPR era aplicada principalmente no estudo das propriedades dielétricas de filmes metálicos. Atualmente encontra-se aplicação em uma faixa extensa de materiais, para determinação de características de superfícies, incluindo propriedades dielétricas, processos de adsorção, degradação ou hidratação de superfícies. Estes estudos tornaram-se realidade a partir da deposição de filmes de Langmuir-Blodgett ou monocamadas auto-organizadas (SAMs ¾ "self-assembled monolayers") na superfície metálica^87,88. A espessura e as propriedades dielétricas de filmes orgânicos foram calculadas por análises de SPR para diversos sistemas, incluindo camadas finas de politetrafluoroetileno, filmes de ftalocianinas, filmes de Langmuir-Blodgett e filmes utilizando métodos de imobilização de monocamadas auto-organizadas⁸⁹.

A espectrometria de SPR como transdutor em sensores e biossensores

Nos últimos anos, o emprego de biossensores e de sensores está aumentando significativamente. As aplicações vão desde emprego no monitoramento e controle ambiental, agricultura até emprego em diferentes segmentos industriais, em especial, nas indústrias alimentícia e farmacêutica. Biossensores também podem satisfazer a necessidade do monitoramento contínuo, em tempo real in vivo para substituir a tecnologia analítica intermitente usada na indústria química e análises clínicas. Mais de 1000 publicações relevantes aparecem desde 1995, indicando a atividade de pesquisa devotada para este importante assunto⁹⁰.

A descrição sistemática de um biossensor deve incluir 5 pontos marcantes: (1) a detecção ou parâmetro de medida; (2) o princípio de funcionamento do transdutor; (3) o modelo físico e químico/bioquímico; (4) a aplicação e (5) a tecnologia e os materiais para fabricação do sensor. Muitos parâmetros indicam as características dos sensores e biossensores. Alguns são comumente usados para avaliar as propriedades funcionais e qualidade do sensor, como a sensibilidade, estabilidade e tempo de resposta, outros parâmetros são correlacionados com a aplicação⁹⁰.

Quando se deseja construir um novo sensor ou biossensor, uma questão fundamental que precisa ser respondida é qual o modelo físico e/ou químico/bioquímico que pode ser atribuído à resposta do sensor ou biossensor, ou seja, o mecanismo de resposta, desde que já se tenha estabelecido os outros parâmetros como material e forma de construção do mesmo. Para o entendimento do processo de interação analito/superfície sensora, seja interações a nível biológico (no caso dos biossensores e imunossenores, ex. enzima-substrato, anticorpo-antígeno), ou a nível não biológico (no caso de sensores para onde o elemento de reconhecimento não é uma biomolécula, ex. membrana-analito), faz-se necessário dois procedimentos básicos: análise estrutural e funcional. É neste sentido que a associação da técnica de SPR com a eletroquímica é muito vantajosa, pois o estudo de reações analito-receptor pode ser realizado em tempo real. A SPR é uma técnica que não requer marcadores radioativos ou bioquímicos, possui um planejamento experimental flexível e promove análises automáticas e rápidas¹. Em termos de análises fundamentais, a SPR é usada para investigar a formação e/ou redução de óxidos, adsorção de íons e adsorção induzida eletroquimicamente^91-89.

Muitas vezes faz-se necessário caracterizar as reações que ocorrem na superfície do biossensor na presença das limitações difusionais que estão inevitavelmente presentes nestes tipos de sistemas. É essencial caracterizar não somente as reações associativas ou de ligação (através dos coeficientes de ligação, K_lig ou K_ads), mas também as reações de dessorção ou dissociação (através dos coeficientes de dessorção, K_des ou K_diss). Isto auxilia significantemente no aumento dos parâmetros de desempenho do biossensor. A razão de K_diss e K_lig (igual a K) pode ser usada para auxiliar a caracterizar o sistema receptor-analito-biosensor/sensor. Os detalhes de associação/dissociação do analito para o receptor, imobilizado sob uma superfície é de grande significado no desenvolvimento de sistemas destinados ao imunodiagnóstico, bem como para sensores e biossensores^93-95. Muitos estudos foram realizados neste âmbito, porém somente a associação e ligação do analito ao receptor é analisada^96-101. Aparentemente, até agora, as cinéticas de dissociação (do complexo analito-receptor sob a superfície) não foram discutidas ou apresentadas com grandes detalhes. Estas caracterizações necessitam de técnicas que monitorem estas interações em tempo real, e a SPR é uma técnica que pode ser perfeitamente utilizada nestes casos, ainda mais quando associada à eletroquímica.

Associação da espectrometria de SPR e Eletroquímica

O fenômeno de SPR, quando estudado in-situ durante um experimento eletroquímico, fornece informações muito úteis para o desenvolvimento de biossensores, eletrodos modificados, processos de eletropolimerização, etc. Há um número razoável de modificações estáveis nas superfícies de eletrodos que podem exibir mudanças no índice de refração concomitantemente com eventos redox¹⁰². Esta combinação de técnicas vem sendo descrita por um grande número de diferentes grupos^102-120. As investigações iniciais fazem referência a estudos da dupla camada elétrica^109-113. Mais recentemente a técnica de SPR foi empregada com associação à voltametria de redissolução anódica para detectar íons metálicos^114,115, bem como para estudar as mudanças de um filme orgânico sob a influência de um campo eletrostático (ou potencial do eletrodo)^102,103.

A combinação da técnica de SPR com a eletroquímica para modificação de superfícies, já tem mostrado resultados promissores, um exemplo é a eletropolimerização de um fenol com peptídeo modificado para uso em interações entre ligante-receptor, realizada por Kienle e colaboradores¹²¹. Outros exemplos que podem ser citados são os estudos de monocamadas auto-organizadas⁸⁹, como mostrado anteriormente e filmes com mono e multicamadas^122-124. A grande importância destes estudos é o desenvolvimento de novos suportes para materiais biológicos que podem ser utilizados para o desenvolvimento de biossensores. Além disso, a dimensão do campo eletrostático dentro da região interfacial do eletrodo quimicamente modificado é um parâmetro fundamental que controla a reatividade eletroquímica de qualquer espécie incorporada dentro do filme. Hanken e colaboradores^122,123 demonstraram que uma extensão da técnica de SPR, chamada ressonância de plasma de superfície eletroquimicamente modulada (EM-SPR ¾ "electrochemically modulated surface plasmon resonance"), pode ser empregada para monitorar campos eletrostáticos dentro de monocamadas orgânicas e filmes de multicamadas na superfície de eletrodos. Estes experimentos monitoram as mudanças no índice de refração de um filme que ocorre sob a modulação do potencial do eletrodo.

A técnica de SPR acoplada à eletroquímica (ESPR ¾ "electrochemistry surface plasmon resonance") pode ser utilizada juntamente com as diversas técnicas eletroquímicas existentes, como voltametria cíclica, voltametria de redissolução anódica, etc. Os experimentos podem ser realizados medindo-se a velocidade de reação no eletrodo (através das medidas de corrente), observando o efeito físico acumulativo das reações no eletrodo (por meio das medidas de SPR). Os dados obtidos com SPR podem ser exibidos das seguintes formas: espectro de transmissão sem refinamento, espectro de transmissão normalizado, uma série de tempo ou de comprimento de onda de acoplamento. O espectro não normalizado é um registro em tempo real da intensidade de radiação transmitida (reflexibilidade). A razão deste espectro pelo espectro de transmissão de referência (tipicamente feito em ar, onde não ocorre excitação do plasma ressonante, sob um determinado comprimento de onda) resulta no espectro de transmissão normalizado. O comprimento de onda de acoplamento corresponde ao mínimo de um espectro normalizado, e seu gráfico é denominado de gráfico de tendências. Estes dados, quando obtidos concomitantemente com técnicas eletroquímicas, podem ser graficados, entre outros, em função da corrente e potencial¹¹⁹.

Nas reações envolvendo difusão e/ou adsorção, a superfície ou as concentrações das espécies eletroquimicamente ativas na camada de difusão são moduladas como resultados destes processos sobre uma escala de tempo para cada condição voltamétrica. A técnica de SPR será sensível a ambas espécies adsorvidas e a razão de concentração de moléculas redox dissolvidas, alterada eletroquimicamente. A corrente faradaica é proporcional ao gradiente de concentração na superfície do eletrodo, enquanto os dados da SPR fornecem a concentração na superfície¹¹⁹.

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

Durante a última década a técnica de SPR foi desenvolvida dentro de uma tecnologia viável visando numerosas aplicações. Suas capacidades permitem realizar, com importante impacto, as análises de superfícies e interações moleculares sobre estas. A técnica de SPR é uma ferramenta valiosa para investigar um número grande de eventos dinâmicos, e sua diversidade permite realizar análises interfaciais em muitas superfícies. Além disso, é possível por meio desta técnica determinar propriedades dielétricas (índice de refração ou espessura do filme), bem como monitorar processos interfaciais in situ envolvendo adsorção/dessorção, hidratação e desidratação. Estes, por sua vez, são parâmetros muito importantes que precisam ser conhecidos e determinados quando se deseja desenvolver um novo biossensor ou sensor. Além do mais, a flexibilidade das configurações de células em fluxo permite estudar estes processos em condições relevantes, como temperatura, velocidade de fluxo, pH e força iônica. O uso técnica de SPR combinada à eletroquímica (ESPR), embora ainda pouco utilizada, mostra-se muito promissora.

É de fundamental importância para quem deseja desenvolver um novo sensor ou biossensor, conhecer e avaliar constantes de afinidades, constantes de equilíbrios, fenômenos de interface (sólido/líquido) associados com interações enzima/substrato, etc. Isto permitirá o desenvolvimento de sensores e biossensores mais sensíveis, seletivos e principalmente mais estáveis que, desta forma, terão um maior potencial para produção comercial. Contudo, espera-se que as combinações das medidas voltamétricas e SPR possam fornecer informações sobre processos eletroquímicos no campo da eletroquímica, principalmente no desenvolvimento de biossensores.

Recebido em 4/1/02; aceito em 27/6/02

• 1. Brecht, A.; Gauglitz, G.; Biosens. Bioelectron. 1995, 10 , 923.
• 2. Pockrand, I.; Swalen, J. D.; Gordon, J. G.; Philpott, M. R.; Surf. Sci.1978, 74, 237.
• 3. Gordon, J. G.; Ernst, S.; Surf. Sci. 1980, 101, 499.
• 4. Nylander, C.; Liedberg, B.; Lind, T.; Sens. Actuators, B 1982, 3, 79.
• 5. Liedberg, B.; Nylander C.; Lundström, I.; Biosens. Bioelectron. 1995, 10, R1-R9.
• 6. Jonssson, U.; Fagerstam, L.; Ivarsson, B.; Karlsson, R.; Lundh, K.; Lofas, S.; Persson, B.; Roos, H.; Ronnberg, I.; Jonsson, B.; Slojander, S.; Stenberg, E.; Stahlberg, R.; Urbaniczik, Y.; Ostlin, H.; Malmqvist, M.; BioTechniques 1991, 11, 620.
• 7. Homola, J.; Yee, S. S.; Gauglitz, G.; Sens. Actuators, B 1999, 54, 3.
• 8. O'Brien, M. J.; Pérez-Luma, V. H.; Brueck, S. R. J.; López, G. P.; Biosens. Bioelectron. 2001, 16, 97.
• 9. Akimoto, T.; Sasaki, S.; Ikebukuro, K.; Karube, I.; Biosens. Bioelectron. 2000, 15, 355.
• 10. Rich, R. L.; Myszka, D. G.; J. Mol. Recognit. 2000, 13, 388.
• 11. Lechuga, L.M.; Calle, A.; Prieto, F.; Quim. Anal. 2000, 19, 54.
• 12. Myszka, D. G.; J. Mol. Recognit. 1999, 12, 390.
• 13. Vadgama, P.; Grump, P. W.; Analyst 1992, 117, 1657.
• 14. Green, R. J.; Frazier, R. A.; Shakesheff, K. M.; Davies, M. C.; Roberts, C. J.; Tendler, S. J. B.; Biomaterials 2000, 21, 1823.
• 15. Pisarchick, M. L.; Gesty, D.; Thompson, N. L.; Biophys. J. 1992, 63, 215.
• 16. Rich, L. R.; Myszka, D. G.; Curr. Opin. Biotechnol. 2000, 11, 54.
• 17. Steiner, G.; Sablinskas, V.; Hübner, A.; Kuhne, C.; Salzer, R.; J Mol. Struct. 1999, 509, 265.
• 18. Otto, A.; Z. Phys. 1967, 185, 232.
• 19. Kretschmann, E.; Kroger, E.; J. Opt. Soc. Am. 1975, 65, 150
• 20. Nyholm, T.; Andäng, M.; Bandholtz, A.; Maijgren, C.; Persson, B.; Hotchkiss, G.; Fehniger, T. E.; Larsson, S.; Ährlund-Richter, L. J.; Biochem. Biophys. Methods 2000, 44, 41.
• 21. Sparreboom, A.; Rongen, H. A. H.; van Bennekom, W. P.; Anal. Chim. Acta 1994, 295, 1.
• 22. Tsoi, P. Y.; Yang, J.; Sun, Y.-T.; Sui, S.-F.; Yang, M.; Langmuir 2000, 16, 6590.
• 23. Nelson, B. P.; Grimsrud, T. E.; Liles, M. R.; Goodman, R. M.; Corn, R. M.; Anal. Chem. 2001, 73, 1.
• 24. Wink, T.; Beer, J.; Hennink, W. E.; Bult, A.; van Bennekom, W.P.; Anal. Chem. 1999, 71, 801.
• 25. Baerga-Ortiz, A.; Rezaie, A. R.; Komives, E.A.; J. Mol. Biol. 2000, 296, 651.
• 26. Adamczyk, M.; Moore, J. A.; Yu, Z. G.; Methods 2000, 20, 319.
• 27. Silin, V.; Plant, A.; Trends Biotechnol. 1997, 15, 353.
• 28. Pei, R.; Cui, X.; Yang, X.; Wang, E.; Talanta 2000, 53, 481.
• 29. Dyr, J. E.; Rysavá, J.; Suttnar, J.; Homola, J.;Tobiska, P.; Sens. Actuators, B 2001, 74, 69.
• 30. Okumura, S.; Akao, T.; Mizuki, E.; Ohba, M.;Inouye, K.; J. Biochem. Biophys. Methods 2001, 47, 177.
• 31. Sonezaki, S.; Yagi, S.; Ogawa, E.; Kondo, A.; J. Immunol. Methods 2000, 238, 99.
• 32. Sévin-Landais, A.; Rigler, P.; Tzartos, S.; Hucho, F.; Hovius, R.; Vogel, H.; Biophys. Chem. 2000, 85, 141.
• 33. Quinn, J. G.; O'Neill, S.; Doyle, A.; McAtammey, C.; Diamond, D.; MacCraith, B. D.; O'Kennedy, R.; Anal. Biochem. 2000, 281, 135.
• 34. Ivanov, Y. D.; Kanaeva, I. P.; Gnedenko, O. V.; Pozdnev, V. F.; Shumyantseva, V. V.; Samenkova, N. F.; Kuznetsova, G. P.; Tereza, A. M.; Shimid, R. D.; Archakov, A. I.; J. Mol. Recognit. 2001, 14, 185.
• 35. Hatta, T.; Konishi, H.; Katoh, E.; Natsume, T.; Ueno, N.; Kobayashi, Y.; Yamazaki, T.; Biopolymers 2000, 55, 399.
• 36. RichaletSecordel, P. M.; Poisson, F.; van Regenmortel, M. H. V.; Clin. Diagn. Virol. 1996, 5, 111.
• 37. Liparoto, S. F.; Ciardelli, T. L.; J. Mol. Recognit. 1999, 12, 316.
• 38. Toth, A.; Kiss, E.; Herberg, F. W.; Gergely, P.; Hartshone, D. J.; Erdodi, F.; Eur. J. Biochem. 2000, 267, 1687.
• 39. Alterman, M.; Sjobom, H.; Safsten, P.; Markgren, P. O.; Danielson, U. H.; Hamalainen, M.; Lofas, S.; Hulten, J.; Classon, B.; Samuelsson, B.; Hallberg, A.; Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 13, 203.
• 40. Webster, C. I.; Cooper, M. A.; Packman, L. C.; Williams, D. H.; Gray, J. C.; Nucleic Acids Res. 2000, 28, 1618.
• 41. Otamiri, M.; Nilsson, K. G. I.; Int. J. Biol. Macromol. 1999, 26, 263.
• 42. Munakata, H.; Takagaki, K.; Majima, M.; Endo, M.; Glycobiology 1999, 9, 1023.
• 43. Adamczyk, M.; Mattingly, P.G.; Shreder, K.; Yu, Z. G.; Bioconjugate Chem. 1999, 10, 1032.
• 44. O'Shannessy, J. D.; Brigham-Burke, M.; Peck, K.; Anal. Biochem. 1992, 205, 132.
• 45. Brockaman, J. M.; Frutos, A. G.; Corn, R. M.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 8044.
• 46. Adamczyk, M.; Chen, Y.-Y.; Gebler, J. C.; Johnson, D. D.; Mattingly, P. G.; Moore, J. A.; Reddy , R. E.; Wu, J.; Yu, Z.; Steroids 2000, 65, 295.
• 47. Deckert, F.; Legay, F.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 23, 403.
• 48. Kaiser, T.; Gudat, P.; Stock, W.; Pappert, G.; Grol, M.; Neumeier, D.; Luppa, P. B.; Anal. Biochem. 2000, 282, 173.
• 49. Mu, Y.; Zhang, H.; Zhao, X.; Wang, Z.; Cao, Y.; Liang, F.; Jin, Q.; Quim. Anal. 1999, 18, 277.
• 50. Kukanski, K.; Elkind, J.; Melendez, J.; Murphy, T.; Miller, G.; Garner, H.; Anal. Biochem. 1999, 274, 7.
• 51. Shaw, D. M.; Embleton, M. J.; Westwater, C.; Ryan, M. G.; Myers, K. A.; Kingsman, S. M.; Carroll, M. W.; Stern, P. L.; Biochem. Biophys. Acta 2000, 1524, 238.
• 52. Gómara, M. J.; Ercilla, G.; Alsina, M. A.; Haro, I.; J. Immunol. Methods 2000, 246, 13.
• 53. Gomes, P.; Giralt, E.; Andreu, D.; Vaccine 1999, 18, 362.
• 54. van Regenmotel, M. H. V.; Altschub, D.; Chatellier, J.; Immunol. Invest. 1997, 26, 67.
• 55. Vikinge, T. P.; Askendal, A.; Liedberg, B.; Lindahl, T.; Tengvall, P.; Biosens. Bioelectron. 1998, 13, 1257.
• 56. Mozsolits, H.; Wirth, H.-J.; Werkmeister, J.; Aguilar, M.-I.; Biochim. Biophys. Acta 2001, 1512, 64.
• 57. Osinaga, E.; Bay, S.; Tello, D.; Babino, A.; Pristsch, O.; Assemat, K.; Cantacuzene, D.; Hakada, H.; Alzari, P.; FEBS Lett. 2000, 469, 24.
• 58. Akkoyun, A.; Kohen, V. F.; Bilitewski, U.; Sens. Actuators, B 2000, 70, 12.
• 59. Perkins, E. A.; Squirrell, D. J.; Biosens. Bioelectron 2000, 14, 853.
• 60. Rasooly, L.; Rasooly, A.; Int. J. Food Microbiol. 1999, 49, 119.
• 61. Lahiri, J.; Isaacs, L.; Grzybowski, B.; Garbeck, D. J.; Whitesides, G. M.; Langmuir 1999, 15, 7186.
• 62. Lahiri, J.; Isaacs, L.; Tien, J.; Whitesides, G. M.; Anal. Chem. 1999, 71, 777.
• 63. De Mol, N. J.; Plomp, E.; Fischer, M. J. E.; Ruijtenbeek, R.; Anal. Biochem. 2000, 279, 61.
• 64. Nedelkov, D.; Nelson, R.W.; J. Mol. Recognit. 2000, 13, 140.
• 65. Sadana, A.; Anal. Biochem. 2001, 291, 34.
• 66. Markgren, P. O.; Lindgren, M. T.; Gertow, K.; Karlsson, R.; Hamalainen, M.; Danielson, U. H.; Anal. Biochem. 2001, 291, 207.
• 67. Markgren, P. O.; Hamalainen, M.; Danielson, U. H.; Anal. Biochem. 2001, 279, 71.
• 68. Domagala, T.; Konstantopoulos, N.; Smyth, F.; Jorissen, R. N.; Fabri, L.; Geleick, D.; Lax, I.; Schlessinger, J.; Sawyer, W.; Howlett, G. J.; Burgess, A. W.; Nice, E.C.; Growth Factors 2000, 18, 11.
• 69. Jung, L. S.; Shumaker-Parry, J. S.; Campbell, C. T.; Yee, S. S.; Gelb, M.H.; J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 4177.
• 70. Oshannessy, D. J.; Winzor, D. J.; Anal. Biochem. 1996, 236, 275.
• 71. Visser, N. V.; Smit-Kingma, I. E.; Spectrochim. Acta, Part A 1999, 55, 2271.
• 72. Fivash, M.; Towler, E. M.; Fisher, R. J.; Curr. Opin. Biotechnol. 1998, 9, 97.
• 73. Hall, D.; Anal. Biochem. 2001, 288, 109.
• 74. Hassan, A. K; Ray, A. K.; Nabok, A. V.; Davis, F.; Sens. Actuators, B 2001, 77, 638.
• 75. Gaus, K.; Hall, E. A. H.; Biosens. Bioelectron 1998, 13, 1307.
• 76. Caselunghe, M. B.; Lindeberg, J.; Food Chem. 2000, 70, 523.
• 77. Bilitewski, U.; Anal. Chem. 2000, 1, 682A.
• 78. Skládal, P.; Deng, A.; Kolár, V.; Anal. Chim. Acta 1999, 399, 29.
• 79. Frostell-Karlsson, A.; Remaeus, A.; Andersson, K.; Borg, P.; Hämäläinen, M.; Karlsson, R.; J. Med. Chem 2000, 43, 1986.
• 80. Zako, T.; Harada, K.; Mannen, T.; Yamaguchi, S.; Kitayama, A.; Ueda, H.; Nagamune, T.; J. Biochem. 2001, 129, 1.
• 81. Nedelkov, D.; Nelson, R. W.; Anal. Chim. Acta 2000, 423, 1.
• 82. Lu, H.B.; Campbell, C. T.; Castner, D. G.; Langmuir 2000, 16, 1711.
• 83. Nelson, R. W.; Nedelkov, D.; Tubbs, K. A.; Anal. Chem. 2000, 1, 404A.
• 84. Catimel, B.; Weinstock, J.; Nerrie, M.; Domagala, T.; Nice, E. C.; J. Chromatogr., A 2000, 869, 261.
• 85. Shank-Retzalff, M. L.; Sligar, S. G.; Anal. Chem. 2000, 72, 4212.
• 86. Jungar, C.; Strandh, M.; Ohlson, S.; Mandenius, C. F.; Anal. Biochem. 2000, 281, 151.
• 87. Friggeri, A.; van Veggel, F. C. J. M.; Reinhoudt, D. N.; Langmuir 1998, 14, 5457.
• 88. Terrettaz, S.; Stora, T.; Duschl, C.; Vogel, H.; Langmuir 1993, 9, 1361.
• 89. Georgiadis, R.; Peterlinz, K. A.; Ahn, J. R.; Peterson, A. W.; Grassi, J. H.; Langmuir 2000, 16, 6759.
• 90. Zhang, S.; Wright, G.; Yang, Y.; Biosens. Bioelectron 2000, 15, 273.
• 91. Lavers, C. R.; Harris, R. D.; Hao, S.; Wilkinson, J. S.; Odwyer, K.; Brust, M.; Schiffrin, D. J.; J. Electroanal. Chem. 1995, 387, 22.
• 92. Chinowsky, T. M.; Saan, S. B.; Yee, S. S.; Sens. Actuators, B 1996, 35, 37.
• 93. Sadana, A.; Vo-Dinh, T.; Biotechnol. Appl. Biochem. 2001, 33, 17.
• 94. Ramakrishman, A.; Sadana, A.; J. Colloid Interface Sci. 2000, 229, 628.
• 95. Ramakrishman, A.; Sadana, A.; Biosens. Bioelectron 2000, 15, 651.
• 96. Sadana, A.; Madagula, A.; Biosens. Bioelectron 1994, 9, 45.
• 97. Sadana, A.; Sii, D.; Biosens. Bioelectron 1992, 7, 559.
• 98. Sadana, A.; Sii, D.; J. Colloid Interface Sci. 1992, 151, 166.
• 99. Glaser , R. W.; Anal. Biochem. 1993, 213, 152.
• 100. Sadana, A.; Beelaram, A. M.; Biosens. Bioelectron 1995, 10, 301.
• 101. Morton, T. A.; Myszka, D. G.; Chaiken, I. M.; Anal. Biochem. 1995, 227, 176.
• 102. Brennan, C. B.; Sun, L. F.; Weber, S. G.; Sens. Actuators, B 2001, 72, 1.
• 103. Dijksma, M.; Kamp, B.; Hoogvliet, J. C.; van Bennekom, W.P.; Langmuir 2000, 16, 3852.
• 104. Beulen, M. W. J.; Bugler, J.; de Jong, M. R.; Lammerink, B.; Huskens, J.; Schonherr, H.; Vancso, G. J.; Boukamp, B. A.; Wieder, H.; Offenhauser, A.; Knoll, W.; van Veggel, F. C. J. M.; Reinhoudt, D. N.; Chem. - -Eur. J. 2000, 6, 1176.
• 105. Yang, J. S.; Lee, C. C.; Yau, S. L.; Chang, C. C.; Lee, C. C.; Leu, J. M.; J. Org. Chem. 2000, 65, 871.
• 106. Friggeri, A.; van Veggel, F. C. J. M.; Reinhoudt, D. N.; Chem. - -Eur. J. 1999, 5, 359.
• 107. Iwasaki, Y.; Horiuchi, T.; Morita, M.; Niwa, O.; Surf. Sci. 1999, 428, 195.
• 108. Kajikawa, K.; Hara, M.; Sasabe, H.; Knoll, W.; Jpn. J. Appl. Phys., Part 2 1997, 2, L1116.
• 109. Jory, M. J.; Bradberry, G.W.; Cann, P.S.; Sambles, J.R.; Sens. Actuators, B 1996, 35, 197.
• 110. Tadjeddine, A.; Electrochim. Acta 1989, 34, 29.
• 111. Kotz, R.; Kolb, D. M.; Sass, J. K.; Surf. Sci. 1977, 69, 359.
• 112. Gordon, J. G.; Ernst, S.; Surf. Sci. 1980, 101, 499.
• 113. Tadjeddine, A.; Rahmani, A.; Costa, M.; Chem. Phys 1990, 141, 15.
• 114. Jung, C. C.; Saban, S. B.; Yee, S. S.; Darling, R. B.; Sens. Actuators, B 1996, 32, 143.
• 115. Chinowsky, T. M.; Saban, S. B.; Yee, S. S.; Sens. Actuators, B 1996, 35-36, 37.
• 116. Salamon, Z.; Meyer, T. E.; Tollin, G.; Biophys. J. 1995, 68, 648.
• 117. Salamon, Z.; Wang, Y.; Tollin, G.; Macleod, H. A.; Biochim. Biophys. Acta 1994, 1195, 267.
• 118. Salamon, Z.; Wang, Y.; Brown, M. F.; Macleod, H. A.; Tollin, G.; Biochemistry 1994, 33, 13706.
• 119. Iwasaki, Y.; Horiuchi, T.; Morita, M.; Niwa, O.; Sens. Actuators, B 1998, 50, 145.
• 120. Myszka, D. G.; Morton, T. A.; Doyle, M. L.; Chaiken, I. M.; Biophys. Chem. 1997, 64, 127.
• 121. Kienle, S.; Lingler, S.; Kraas, W.; Offenhäusser, A.; Knoll, W.; Jung, G.; Biosens. Bioelectron. 1997, 12, 779.
• 122. Hanken, D. G.; Naujok, R. R.; Gray, J. M.; Corn, R. M.; Anal. Chem 1997, 69, 240.
• 123. Hanken, D. G.; Corn, R. M.; Anal. Chem 1997, 69, 3665.
• 124. Lang, H.; Duschl, C.; Vogel, H.; Langumuir 1994, 10, 197.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Mar 2003
• Data do Fascículo
  Jan 2003

Histórico

• Recebido
  04 Jan 2002
• Aceito
  27 Jun 2002