Acetogeninas de anonáceas isoladas de folhas de Rollinia laurifolia

Annonaceous acetogenins from leaves of Rollinia laurifolia

acetogenins; antitumoral agents; Rollinia laurifolia

ARTIGO

Acetogeninas de anonáceas isoladas de folhas de Rollinia laurifolia

Annonaceous acetogenins from leaves of Rollinia laurifolia

Francisco das Chagas do Nascimento^I; Maria Amélia Diamantino Boaventura^II; Angela Cristina S. Assunção^II; Lúcia Pinheiro Santos Pimenta^II

^IDepartamento de Química, Centro de Ciências e Tecnologia, Universidade Federal de Roraima, 69310-270 Boa Vista - RO

^IIDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, 31270-970 Belo Horizonte - MG

^{Endereço para correspondência}

ABSTRACT

Phytochemical investigation of hexanic extract of leaves of Rollinia laurifolia afforded three known acetogenins, uvariamicin-I (1), solamin(2) and gonionenin(3), for the first time isolated from Rollinia genus. The structures of 1, 2 and 3 were elucidated by spectroscopic methods.

Keywords: acetogenins; antitumoral agents; Rollinia laurifolia.

INTRODUÇÃO

A família Annonaceae é constituída por cerca de 120 gêneros e aproximadamente 2.300 espécies. No Brasil, estão registrados 29 gêneros, compreendendo cerca de 260 espécies¹.

A partir da década de 80, um novo estímulo surgiu para o estudo fitoquímico desta família, devido ao isolamento de uma nova classe de substâncias naturais bioativas, conhecidas como "acetogeninas de anonáceas"² que apresentaram uma gama de importantes atividades biológicas tais como: citotóxica, antitumoral, pesticida, vermicida, abortiva, antimicrobiana, imunossupressora, antiemética, inibidora do apetite e antimalárica^2,3.

O gênero Rollinia é constituído por 65 espécies, que ocorrem principalmente na América do Sul e com poucas espécies no México, Caribe e América Central⁴. Existem relativamente poucos relatos de investigações fitoquímicas sobre este gênero⁵ quando comparado com outros gêneros da família (Annona, por exemplo), o que torna o seu estudo altamente relevante.

Este artigo descreve os resultados parciais obtidos do estudo químico do extrato hexânico das folhas de Rollinia laurifolia, que levou ao isolamento de três acetogeninas já descritas em outros gêneros de Annonaceae, a uvariamicina-I^3,6 (1), a solamina^7,8 (2) e a gonionenina⁹ (3), mas relatadas pela primeira vez em Rollinia.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fracionamento cromatográfico do extrato hexânico das folhas de Rollinia laurifolia e a análise espectrométrica das substâncias puras obtidas das frações permitiu a identificação das acetogeninas uvariamicina-I (1), solamina (2) e gonionenina (3).

O EMBAR da substância 1 mostrou o pico [M + Na]⁺ de m/z 615, indicando M⁺ de m/z 592 (cal. 592,94), consistente com a fórmula C₃₇H₆₈O₅.

A parte da g-lactona a,b-insaturada apresentou sinais característicos no espectro de RMN de ¹H em d 6,98 (H-35); 4,99 (H-36) e 1,40 (H-37) e no espectro de RMN de ¹³C em d 173,8 (C-1); 148,8 (C-35); 134,4 (C-2); 77,2 (C-36) e 19,2 (C-37).

A presença de anel mono-tetra-hidrofurânico com duas hidroxilas em carbonos adjacentes foi confirmada pelo mapa de contornos HMQC: os sinais dos hidrogênios H-16 e H-19 (d 3,80), H-15 e H-20 (d 3,40) estão correlacionados com os carbonos em d 82,6 (C-16 e C-19) e d 74,0 (C-15 e C-20), respectivamente. Também neste mapa observam-se as correlações dos sinais dos hidrogênios em d 6,98 (H-35); 4,99 (H-36) e 1,40 (H-37) com aqueles dos carbonos em d 148,8; 77,2 e 19,2, respectivamente. A análise do mapa de contornos HH-COSY mostrou as correlações vicinais, na subunidade lactônica, dos hidrogênios em d 6,98 (H-35) com d 4,99 (H-36) e d 4,99 com d 1,40 (H-37). Os deslocamentos químicos dos carbonos, no espectro de RMN de ¹³C, da parte não funcionalizada, estão de acordo com os dados da literatura⁶ (C-3 a C-13: d 25,2-29,7; C-17 a C-18: d 28,1-28,7; C-22 a C-33: d 22,7-31,9). No espectro de RMN de ¹H os sinais correspondentes a esses hidrogênios aparecem entre d 1,25-1,29; d 1,77-1,95; d 1,25-1,29, respectivamente. A posição do anel tetra-hidrofurânico foi estabelecida através da análise do EMIE-AR: o pico base em m/z 295 (100%, C₁₈H₃₁O₃ ; calc. 295,44) indica sua localização entre C-16/C-19. Os íons em m/z 267 (23%, C₁₇H₃₁0₂, C₁₈H₃₁0₃ – CO; calc. 267,49) e m/z 347 (C₂₂H₃₅O₃, C₂₂H₃₇O₄ – H₂O; cal. 347,51) correspondem às fissões entre C-15/C-16 e C-19/C-20, respectivamente, e confirmam as hidroxilas adjacentes ao anel tetra-hidrofurânico (Figura 1). Os dados espectrais são semelhantes àqueles observados para uvariamicina-I, já isolada de Uvaria narum⁶, Uvaria hookeri³ e Annona bulata³, mas inédita no gênero Rollinia.

A massa molecular de 2, determinada pelo EMBAR, foi deduzida através do íon [M + Na]⁺ de m/z 587, correspondente à fórmula molecular C₃₅H₆₄O₅. O pico base em m/z 295 (100%, C₁₈H₃₁0₃ ; calc. 295,44) permitiu localizar o anel tetra-hidrofurânico entre C-16/C-19, como em 1. Esta subunidade com as duas hidroxilas adjacentes, foi evidenciada pelos sinais em d 82,7 (C-16 e C-19) e 74,4 (C-15 e C-20), no espectro de RMN de ¹³C, e em d 3,82 e 3,41, no espectro de RMN de ¹H, respectivamente. O mapa de contornos HH-COSY confirma as correlações entre os hidrogênios, citadas acima. Os deslocamentos químicos da parte não funcionalizada da cadeia, nos espectros de RMN de ¹H e de ¹³C estão de acordo com os dados da literatura e são análogos àqueles de 1 (Tabela 1), assim como a maioria das fragmentações no EMIE, sendo o comprimento da cadeia carbônica a única diferença observada (Figura 1). Comparação com dados da literatura permitiu relacionar 2 com a solamina, já isolada de Annona muricata^7,8, Annona glabra e Annona reticulata³, mas inédita no gênero Rollinia.

A fórmula molecular C₃₇H₆₆0₇ de 3 foi determinada pelo EMBAR, que forneceu um íon [ M + Na ]⁺ em m/z 645. Foram observados, no espectro de RMN de ¹³C, seis sinais de carbonos oxigenados na faixa de d 82,6 a 69,9. O sinal em d 82,6 foi atribuído aos dois carbonos de uma subunidade tetra-hidrofurânica e aqueles em d 74,3 e 73,5 foram associados aos carbonos hidroxilados adjacentes a esse anel. Os sinais em d 69,9 e d 71,5 foram atribuídos a carbono hidroxilado em C-4 (sinal característico para esta substituição), e a carbono carbinólico ao longo da cadeia carbônica, respectivamente. O mapa de contornos HMQC apresentou as correlações entre esses carbonos e os hidrogênios em d 3,45 (2H); 3,63(1H) e 3,82 (3H). Os sinais em d 2,40 e 2,54 são característicos de H-3a e H-3b, quando C-4 está hidroxilado⁹. A presença dessa hidroxila (cujo sinal do hidrogênio carbinólico pode ser observado em d 3,82, juntamente com aqueles do anel tetra-hidrofurânico) foi também confirmada pelas pequenas diferenças observadas nos deslocamentos químicos para a porção da g-lactona a,b-insaturada (em relação a 1 e 2), no espectro de RMN de ¹H em d 7,19 (H-35); 5,06 (H-36); e 1,44 (H-37) e no espectro de RMN de ¹³C em d 174,6 (C-1); 131,1 (C-2); 151,8 (C-35); 78,0 (C-36) e 19,1(C-37)⁹. Também uma ligação dupla foi detectada em 3 pelos sinais, no espectro de RMN de ¹H, em d 5,34 e 5,37 e em d 128,9 e 130,8, no espectro de RMN de ¹³C e foi localizada entre C-21-C-22, de acordo com dados da literatura⁹. No mapa de contornos HH-COSY observou-se as correlações entre os hidrogênios olefínicos em d 5,34 e 5,37 com dois hidrogênios metilênicos em d 2,19 (H-20) e 2,04 (H-23), respectivamente. Observou-se ainda, neste mapa, a correlação entre os hidrogênios metínicos do anel tetra-hidrofurânico em d 3,82 (H-14 e H-17) com aqueles em a a este anel em d 3,45 (H-13 e H-18). A cadeia hidrocarbônica não funcionalizada foi evidenciada pelo sinal largo centrado a d 1,25, no espectro de RMN de ¹H e pelos sinais entre d 22,7-31,9 (C-23 a C-33), no espectro de RMN de ¹³C, estando de acordo com os dados da literatura⁹.

A determinação da posição do anel tetra-hidrofurânico e a da hidroxila isolada foi feita através da análise do EMIE-AR: o íon em m/z 281 (100%, C₁₆H₂₅O₄, C₁₆H₂₇O₅ – H₂O ; calc. 281,37) indicou a clivagem entre C-13 e C-14; aquele em m/z 351 (30%, C₂₀H₃₁0₅, C₂₀H₃₃0₆- H₂O ; calc. 351,46), a quebra da ligação entre C-17 e C-18; e o íon em m/z 223 (30%, C₁₃H₁₉O₃, C₁₃H₂₁O₄ – H₂O ; calc. 223,29), indicou a clivagem entre C-10 e C-11 (Figura 1). Assim, o sinal em d 3,63, no espectro de RMN de ¹H, relativo a hidrogênio carbinólico, pode ser localizado em C-10 graças a essa fragmentação (m/z 223), de maneira análoga àquele observado na gonionenina, isolada de Goniotalamus giganteus⁹ . Comparação dos outros dados de RMN de ¹H e de ¹³C e de fragmentação da EMIE confirmaram ser 3 idêntica à gonionenina, pela primeira vez isolada no gênero Rollinia.

A estereoquímica relativa do anel tetra-hidrofurânico para as 3 acetogeninas foi determinada por comparação com dados de deslocamentos químicos nos espectros de RMN de ¹³C e de ¹H de modelos sintéticos de anéis tetra-hidrofurânicos quirais, relatados por Harmange e colaboradores^{10, 11} (Figura 2). Assim, a estereoquímica relativa para cada sub-unidade a,a'-di-hidroxilada do anel tetra-hidrofurânico presente nas 3 acetogeninas foi determinada como sendo treo/trans/treo.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros na região do infravermelho (IV) foram registrados em espectrômetro Shimadzu/IR-408, usando pastilhas de KBr. As freqüências de absorção foram medidas em unidades de número de onda (cm^-1). Os espectros de RMN de ¹H a 400 MHz e de¹³C a 100 MHz (1 e 2D) foram obtidos em Espectrômetro Bruker Advance DRX 400, em soluções de CDCl₃ e TMS como referência interna. Os Espectros de Massas EMIE-AR (Espectro de Massas por Impacto Eletrônico de Alta Resolução) e EMBAR (Espectro de Massas por Bombardeamento de Átomos Rápidos) foram registrados em espectrômetro marca Micromass, modelo AUTOSPEC Q. A rotação ótica das substâncias foi medida em um polarímetro Perkin-Elmer modelo 341 usando-se CHCl₃ e CH₃OH como solvente. Os pontos de fusão foram determinados em aparelho Kofler e não foram corrigidos. As análises das frações por Cromatografia Líquida de Média Pressão (MPLC) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), foram feitas respectivamente em Cromatógrafo Buchi, bombas modelo 681 e Cromatógrafo Waters, bombas modelo 501. As colunas cromatográficas foram desenvolvidas em sílica gel 60 (35-70 mesh) e sílica gel 230-400 mesh, da Merck. A detecção das placas de cromatografia em camada delgada analítica foi feita por borrifamento com reagente de Dragendorff.

Material vegetal

A espécie de Rollinia laurifolia utilizada neste trabalho foi coletada no campus da Universidade Federal de Minas Gerais e a exsicata (BHCB 22740) encontra-se depositada no Departamento de Botânica do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.

Isolamentos das acetogeninas

As folhas de Rollinia laurifolia (3,0 kg) após secagem à temperatura ambiente foram moídas e extraídas com hexano. A destilação do hexano, feita sob pressão reduzida, forneceu 68 g de resíduo. Este material foi submetido à cromatografia em coluna de sílica gel, utilizando-se como eluentes hexano/CH₂Cl₂/AcOEt/MeOH com gradiente de polaridade crescente, sendo obtidas 320 frações que foram reunidas em 14 grupos, com base em seu perfil por cromatografia em camada delgada de sílica.

O grupo IX (frações 246𤫵 8,03 g) indicou, por revelação com Dragendorff e pelo espectro no IV, a presença de acetogeninas; foi então submetido à partição com hexano/metanol aquoso (10%) na proporção de 1:1, fornecendo as frações hidroalcóolica (1,03 g) e hexânica (4,82 g). A primeira, por cromatografia em Sephadex LH-20, eluída com MeOH, forneceu 16 frações que foram combinadas em 6 grupos. O grupo 3 (625 mg), foi submetido à MPLC (coluna Lobar Merck-RP-18, 250 x 10 mm) usando-se como eluentes MeOH/ H₂O (gradiente 50:50; 60:40; 70:30; 80:20 e 95:5), tendo sido obtidas 36 frações. A fração 18-30 foi então submetida à CLAE preparativa (coluna Econosphere C-18, 5 mm, 250 x 22 mm), eluída com MeOH/H₂O (isocrático, 85:15), fornecendo a substância 3 (8,0 mg).

O grupo XIII (frações 305𤬭 4,19 g), proveniente do extrato hexânico, também mostrou a presença de acetogeninas por IV e Dragendorff, sendo também submetido à partição com metanol aquoso e hexano. A fração hidroalcóolica (1,03 g) foi cromatografada em Sephadex LH-20, eluída com MeOH, obtendo-se 19 frações que foram reunidas em 9 grupos. O grupo 5 (72,6 mg) e o grupo 6 (106,0 mg) foram submetidos à CLAE preparativa (coluna Merck – PREP-ODS, 5 mm, 250 x 10 mm), eluídas com MeOH/H₂O/THF (isocrático, 90:0,5:0,5) e forneceram 1 (4,6 mg) , e 2 (4,8 mg), respectivamente.

Uvariamicina-I (1) p.f . 54,6-57,0 ^oC (lit.^3,6 sem dados); [a]_D²⁵ = +8,12^o (CHCl₃, c = 0,31), [lit⁷ = +18^o (CH₃OH c = 0,40)]; IV n_max (KBr) cm^-1 3400, 2930, 2820, 1750, 1675, 1460, 1380, 1075, 720; RMN de ¹H (400 MHz , CDCl₃ ) d 6,98 q, J=1,5 Hz, H-35); 4,99 (1H, qd, J= 6,8 e 1,5 Hz, H-36); 3,80 (2H, m, H-16, H-19); 3,40 (2H, m, H-15, H-20); 2,26 (2H, m, H-3); 1,42-1,54 (4H, m, H-14, H-21); 1,77-1,95 ( 2H, m, H-17, H-18); 1,40 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-37); 1,25-1,29 (46H, m, H-3 a H-13, H-22 a H-33); 0,88 (3H, t, J=7,0 Hz, H-34); RMN de ¹³C (100 MHz , CDCl₃ ): Tabela 1; EMBAR m/z 615 [ M +Na]⁺ ; EMIE 70 eV, m/z (ab. rel. %) 365 (8,4), 359 (3,0), 347 (22,2), 329 (7,2), 295(100), 269 (6,2), 267 (23,8), 247 (7,3), 209 (5,0).

Solamina (2) : p.f . 54-56,8 ^oC (lit.⁷ 62-65^o C); [a]_D²⁵ = +12,1^o (CH₃OH , c = 0,26), [lit⁷ = +23^o (CH₃OH c = 0,15)]; IV n_max (KBr) cm^-1 3400, 2800, 1750, 1460, 720; RMN de ¹H (400 MHz , CDCl₃ ) d 6,97 (1H, d, J= 1,2 Hz, H-33); 4,99 (1H, dq, J= 6,7 e 1,2 Hz, H-34); 3,82 (2H, m, H-16, H-19); 3,41 (2H, m, H-15, H-20); 2,26 (2H, t, J= 7,3 Hz, H-3); 1,95 – 1,75 (4H, m, H-17, H-18); 1,46-1,54 (6H, m, H-4, H-14, H-21); 1,40 (3H, d, J= 6,7 Hz, H-35); 1,25 (38H, m, H-5 a H-13, H-22 a H-31); 0,88 (3H, t, J= 6,9 Hz, H-32); RMN de ¹³C (100 MHz , CDCl₃ ): Tabela 1; EMBAR m/z 587 [M + Na]⁺; EMIE 70 eV, m/z (ab. rel. %) 347 (8,4), 319 (10,0), 295 (100), 269 (8,0), 267 (23,0), 251(7,0).

Gonionenina (3) : Cera branca (lit.⁹ 87-88 ^oC); [a]_D²⁵ = +20,20^o (CH₃OH, c= 0,26), [lit⁹ = +19,5^o (CH₃OH c= 0,22)]; IV n_max (KBr) cm^-1 3460, 2910, 2850, 1740, 1650, 1420, 1320, 1070; RMN de ¹H (400 MHz , CDCl₃)d 7,19 (1H, q, J= 1,5 Hz, H-35); 5,06 (1H, qq, J= 6,8 e 1,5 Hz, H-36); 5,37 (1H, dddd, J= 12,5, 10,2 e 6,9 Hz, H-22); 5,34 (1H, dddd, J= 12,5, 10,2 e 6,9 Hz, H-21); 3,82 (2H, m, H-4, H-14 e H-17); 3,63 (1H, m, H-10); 3,45 (2H, m, H-13, H-18); 2,54 (1H, dqn, J= 15,8, 4,5, 2,0 e 1,9 Hz, H-3a); 2,40 (1H, dtd, J= 15,8, 8,9, 2,0 e 1,9 Hz, H-3b); 2,19 (2H, m, H-20); 2,03-1,68 (4H, m, H-15, H-16); 1,48 (2H, m, H-12, H-19); 1,44 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-37);1,20-1,30 (22H, m, H-24 a H-33); 0,88 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-34); RMN de ¹³C (100 MHz , CDCl₃). Tabela 2; EMBAR m/z 645 [M + Na]⁺; EMIE 70 eV, m/z (ab. rel. %) 369 (5), 351 (9), 281 (100), 243 ( 8,5), 241 (22 ), 223 ( 30).

AGRADECIMENTOS

FAPEMIG, CAPES e CNPq pelo auxílio financeiro e bolsas concedidas.

2. Ruprecht, J. K.; Hui, Y. –H.; McLaughlin, J. L.; J. Nat. Prod. 1990, 53, 237.

Recebido em 21/3/02

aceito em 11/9/02

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Maio 2003
• Data do Fascículo
  Maio 2003

Histórico

• Aceito
  11 Set 2002
• Recebido
  21 Mar 2002