Emprego de compostos organometálicos mononucleares de paládio(II) na ativação de macrófagos peritoneais de camundongos

Activation of mice peritoneal macrophages by palladium(II) organometallic mononuclear compounds

palladium(II) complexes; macrophages; hydrogen peroxide

ARTIGO

Emprego de compostos organometálicos mononucleares de paládio(II) na ativação de macrófagos peritoneais de camundongos

Activation of mice peritoneal macrophages by palladium(II) organometallic mononuclear compounds

Eduardo Tonon de Almeida^#, I; Antonio Eduardo Mauro^*, I; Anderson Martinez Santana^I; Adelino Vieira de Godoy Netto^I; Iracilda Zeppone Carlos^II

^IDepartamento de Química Geral e Inorgânica, Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14800-900 Araraquara - SP

^IIDepartamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, CP 502, 14801-902 Araraquara - SP

ABSTRACT

The immune responses are mediated by a variety of cells that, when activated, produce a number of molecules. Macrophages are the first cells to take part in the immune response releasing many compounds in the extracellular environment such as H₂O₂. Taking into account this aspect we evaluated the activation of an immunological system, in vitro, by determining the H₂O₂ released in cultures of peritoneal macrophage cells from Swiss mice in the presence of organopalladated compounds of the type [Pd(dmba)(X)(dppp)], dmba = N,N-dimethylbenzylamine, dppp = 1,3-bis(diphenylphosphine)propane, X = Cl, N₃, NCO, NCS. An excellent activation of macrophages by the [Pd(dmba)(X)(dppp)] compounds was observed and the influence of the X ligand on the immune response could be verified.

Keywords: palladium(II) complexes; macrophages; hydrogen peroxide.

INTRODUÇÃO

Os complexos organometálicos de paládio(II) são extensivamente investigados há décadas e têm encontrado diversas aplicações como em catálise homogênea¹, química supramolecular², na área tecnológica como materiais líquido-cristalinos³, na área médica como agentes anti-tumorais⁴, entre outras. Estes compostos também apresentam uma grande reatividade frente a ligantes orgânicos e inorgânicos originando, assim, espécies com uma rica variedade estrutural. Na química medicinal, destacam-se nos últimos anos os derivados do Pd(II), sobre os quais há muitas citações contemplando espécies organopaladadas⁵ mono, bi e polinucleares com propriedades biológicas⁶. Por ex., o organopaladado contendo o ligante derivado da tiosemicarbazona⁶, [Pd(C₉H₁₁N₃S)Cl₂], apresentou atividade citotóxica in vitro frente a certos tipos de células cancerosas, sendo a mesma superior àquela do análogo com platina(II).

Recentemente, organometálicos de paládio(II) contendo as difosfinas 1,3-bis(difenilfosfina)propano (dppp)⁷ e 1,4-bis(difenilfosfina)butano (dppb), Figura 1, mostraram uma atividade biológica promissora frente à células cancerosas cultivadas in vitro⁸.

Embora seja constatada, atualmente, uma forte tendência na investigação da atividade biológica envolvendo interações entre complexos inorgânicos com DNA e RNA, verifica-se, por outro lado, serem escassos os estudos tratando da estimulação de macrófagos do sistema imunológico por estas espécies químicas.

Os macrófagos constituem um dos principais componentes do sistema imunológico e são as primeiras células a serem ativadas para participar de uma resposta imunológica, propriamente dita, quando o organismo é exposto a fatores exógenos, como por exemplo bactérias, vírus, fungos, venenos, dentre outros. Os macrófagos podem ser ativados, portanto, por uma variedade de estímulos e suas principais funções incluem fagocitose das partículas estranhas, produção de citocinas e de mediadores químicos⁹, como o H₂O₂ e o NO. Após exposição a um estímulo adequado, como à bactérias, os fagócitos polimorfonucleares e mononucleares sofrem uma mudança em seu metabolismo. Nesse caso ocorre um aumento no consumo de oxigênio, que chega a atingir níveis 50 vezes maiores que os observados quando as células estão em repouso. Concomitantemente nota-se substancial aumento na oxidação da glicose, via hexose monofosfato, com produção de NADPH. A NADPH (adenina-difosfato-nicotinamida) oxidase atua como doadora de um elétron, promovendo a redução do O₂ a O₂¯ e este, por dismutação espontânea ou através da enzima superóxido dismutase (SOD), é transformado em H₂O₂¹⁰, conforme mostram as equações 1 e 2.

A geração de H₂O₂ é um processo celular natural, resultante de várias reações específicas essenciais à atividade celular. No entanto, a liberação de quantidades consideráveis de H₂O₂ induz a quebra de fita de DNA e/ou perturbação no citoesqueleto da membrana, levando à morte celular^11,12.

Compostos capazes de provocar a liberação de H₂O₂ por macrófagos, em pequenas concentrações, são importantes, pois auxiliam na resposta imunológica como organo-comunicadores. Um método eficiente para se quantificar o peróxido de hidrogênio liberado por células cultivadas in vitro é baseado na ação da enzima denominada peroxidase de raiz forte ("horseradish peroxidase - HRPO"), que catalisa a oxidação do vermelho de fenol pelo H₂O₂. Esta reação origina um composto amarelo que, com a elevação do pH do meio a 12,5, adquire uma coloração violeta, absorvendo em 620 nm e permitindo, então, determinar a concentração de H₂O₂ produzida por macrófagos ativados em cultura de células.

Considerando o exposto, o presente trabalho teve como objetivo investigar a influência da série de complexos do tipo [Pd(dmba)X(dppp)], X= Cl (1), N₃ (2), NCO (3) e NCS (4), na liberação de peróxido de hidrogênio por macrófagos em cultura de células peritoneais de camundongos in vitro, empregando-se o método espectrofotométrico¹¹ na sua determinação. Foi constatada a influência dos substituintes X = Cl, N₃, NCO e NCS na concentração de H₂O₂ liberada, e os dados são promissores quanto ao futuro emprego destes compostos de Pd(II) como organo-comunicadores, auxiliando numa resposta biológica.

PARTE EXPERIMENTAL

Preparação dos compostos

Os compostos [Pd(dmba)(Cl)(dppp)] (1)¹³, [Pd(dmba)(N₃) (dppp)] (2)⁸ foram preparados como descrito na literatura.

Sínteses dos compostos [Pd(dmba)(X)(dppp)] {X = NCO (3), NCS (4)}

Em um erlenmeyer contendo 0,35 mmol dos precursores [Pd(dmba)(µ-X)]₂ {0,20 g (X = NCO); 0,21 g (X = NCS)}, suspensos em 30 mL de acetona e sob agitação magnética, foram adicionados 0,60 g (0,70 mmol) de 1,3-bis(difenilfosfina)propano. Manteve-se a mistura reacional sob agitação constante, à temperatura ambiente, por 1 h. Evaporou-se lentamente o solvente da solução formada, sem aquecimento, até quase a completa secura. Adicionou-se então, 10 mL de diclorometano, filtraram-se as impurezas e à solução final adicionou-se pentano, resultando na precipitação de um sólido claro. Este sólido foi lavado com pentano e seco sob vácuo.

Composto 3, Análise elementar: % calc. para C₃₇H₃₈N₂OP₂ Pd (% enc.): C: 63,94(63,81); H: 5,51(5,40); N: 4,03(3,98). Temperatura de fusão: 145,7 °C. Rendimento: 85%.

Composto 4, Análise elementar: % calc. para C₃₇H₃₈N₂SP₂ Pd (% enc.): C: 62,49(62,28); H: 5,39(5,27); N: 3,94(4,09). Temperatura de fusão: 140,3 °C. Rendimento: 90%.

Técnicas experimentais

Todos os complexos sintetizados e seus respectivos precursores¹⁴ foram caracterizados por técnicas de IV, RMN de ¹H e ¹³C{¹H}, análise elementar de C, H, N e S e ponto de fusão.

No que concerne aos novos compostos [Pd(dmba)(NCO)(dppp)] (3)e [Pd(dmba)(NCS)(dppp)] (4), as análises quantitativas dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio foram efetuadas no analisador automático EA 1110 CHNS-O, da CE-Instruments.

Os espectros de absorção na região do IV foram obtidos em um espectrofotômetro Nicolet FT-IR Impact 400, no intervalo de 4000 a 400 cm^-1, com resolução de 4 cm^-1, em pastilhas de KBr.

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C{¹H} foram obtidos em um espectrofotômetro Varian modelo Inova 500 MHz, empregando-se as frequências de 500 MHz para hidrogênio e 125 MHz para carbono, respectivamente. Foram empregados como solvente clorofórmio deuterado (CDCl₃-d) e como padrão interno o tetrametilsilano (TMS).

As temperaturas de fusão foram medidas utilizando-se um aparelho Mettler modelo PF-2.

Ensaios biológicos

Liberação de H₂O₂ por macrófagos

Animais – Foram utilizados camundongos machos, tipo Swiss, com peso variando entre 18 a 25 g, todos fornecidos pelo Biotério da FCF – Unesp.

Obtenção de macrófagos e determinação de H₂O₂ – Foi empregado um método de cultura in vitro para se quantificar o composto resultante da oxidação do vermelho de fenol pelo peróxido de hidrogênio, devido à liberação do oxigênio radicalar do H₂O₂. Este método, conforme descrito na literatura^10,15-17, consiste na avaliação do "burst" respiratório, quantificando-se o peróxido de hidrogênio liberado por macrófagos, quando em contato com substâncias consideradas estranhas ao organismo.

Procedimentos - Os animais foram previamente inoculados por via intraperitonial, com 3,0 mL de tioglicolato de sódio a 3%. Após decorridos 3 - 4 dias de estímulo, eles foram sacrificados por deslocamento cervical e, posteriormente à morte e exposição do peritônio, abriu-se a pele do animal, inoculou-se 5,0 mL de solução salina tamponada de fosfato pH 7,2 estéril, realizando-se leve massagem manual no mesmo.

As células foram colhidas do peritônio com a mesma seringa e dispensadas em tubo cônico estéril para o preparo da suspensão celular. Esta suspensão foi centrifugada de 3 a 4 vezes a 2000 rpm durante 5 min, separando assim, as células do exsudato peritoneal. Em seguida, as mesmas foram contadas em câmara hemocitométrica tipo Neubauer, ajustando assim, sua concentração a 2.10⁶ células por mL em 9,6 mL de solução tampão fosfato pH 7,0 (contendo NaCl com concentração 140 mM, tampão fosfato de potássio pH 7,0 com concentração 10 mM e dextrose com concentração 5,5 mM), 0,2 mL de vermelho de fenol com concentração igual a 0,56 mM e 0,1 mL de peroxidase de raiz forte, tipo II, concentração 0,01 mg/mL. Foram transferidas, então, alíquotas de 100 µL para microplacas de 96 cavidades. Em algumas cavidades da placa foram adicionados 50 µL de uma solução 5 mg/mL de zimosan, que consiste na parede celular de Saccharomyces cerevisiae e, em outras cavidades, as soluções dos organopaladados em estudo, na concentração de 5 mg/mL, também em solução tampão de fosfato pH 7,0. Em outras cavidades foram feitos controles de células contendo somente a suspensão celular em solução tampão de fosfato pH 7,0 e, noutras, foram feitos controles dos reagentes (contendo somente solução de vermelho de fenol e zimosan).

As placas foram incubadas por 60 min em estufa a 37 °C, sob atmosfera constante de CO₂ igual a 5%. Após a incubação, a reação foi interrompida com a adição de 50 µL/cavidade de NaOH 5 M e, a seguir, foram feitas leituras de absorbância a 620 nm. Os resultados foram expressos em nanomol (nmol) de H₂O₂ /2.10⁵ células, a partir de uma curva padrão previamente estabelecida, constituída de concentrações molares conhecidas de H₂O₂ em tampão vermelho de fenol.

Leituras de absorbância - Os dados de absorbância foram obtidos no Espectrofotômetro Multiscan Ascent da Labsystems.

Análise estatística - Foi realizada através do teste-t de Student para amostras não paramétricas de acordo com o programa estatístico Microcal^TM Origin^TM versão 5,0¹⁸. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Conforme já colocado anteriormente, os compostos do tipo [Pd(dmba)(X)(dppp)], X = Cl (1), N₃ (2), NCO (3) e NCS (4), resultaram da clivagem dos dímeros [Pd(dmba)(µ-X)]₂, em reações com a 1,3-bis(difenilfosfina)propano (dppp). A escolha dos complexos 1-4, para a realização destes testes, foi motivada pelos ótimos resultados obtidos⁸ quando se avaliou a atividade citotóxica do complexo [Pd(dmba)(N₃)(dppp)] (2), em células tumorais, cultivadas in vitro, referentes às linhagens HeLa (cólon do útero), Hep-2 (orofaringe) e C6 (glioma cerebral).

O diagnóstico da forma de coordenação terminal dos pseudohaletos foi proposto com base na posição espectral¹⁹ das bandas atribuídas aos modos de estiramentos assimétrico e simétrico exibidos pelos mesmos nos espectros de absorção na região do IV.

O espectro no IV do composto [Pd(dmba)(NCO)(dppp)] (3) mostra bandas em 3041, 2934 e 2868 cm^-1, referentes aos modos n(CH)_aromático, n(CH) [-N(CH₃)₂] e n(CH) [-N(CH₂)], respectivamente, do ligante dmba. A presença das bandas em 2209, 1314, 680 e 510 cm^-1, atribuídas aos modos n(CN), n(CO) e d(NCO), respectivamente, elucida claramente a presença do grupo NCO coordenado de forma terminal ao centro metálico via átomo de nitrogênio. Além destas, as bandas em 1095 e 693 cm^-1, associadas aos modos vibracionais n(PC) e d(C-P-C) da dppp, confirmam a presença da mesma coordenada ao metal.

De maneira semelhante, o espectro no IV do [Pd(dmba)(NCS) (dppp)] (4) apresenta bandas em 3039, 2900 e 2859 cm^-1, correspondentes aos modos n(CH)_aromático, n(CH) [-N(CH₃)₂] e n(CH) [-N(CH₂)], respectivamente, do ligante dmba. A presença das bandas em 2048, 840, 440 cm^-1, atribuídas aos modos n(CN), n(CS) e d(NCS), respectivamente, comprovam a coordenação do grupo NCS terminal via átomo de nitrogênio. Cabe mencionar que a coordenação do grupo SCN pelo átomo de nitrogênio no complexo 4 está associada à competição entre os ligantes dppp e o tiocianato pela formação de uma ligação p com os orbitais d do paládio. O ligante dppp realiza ligações p mais eficientes que o S-tiocianato e, conseqüentemente, tende a monopolizar os orbitais p-ligantes do paládio. Dessa forma, a estabilidade da ligação p envolvendo o átomo de enxofre do grupo tiocianato e o paládio é reduzida, favorecendo então a coordenação do pseudo-haleto via átomo de nitrogênio.

Foram também medidos os espectros de RMN de ¹H e ¹³C{¹H} e os sinais observados foram atribuídos como se segue: RMN de ¹H, d em ppm: [-N(CH₃)₂], (1), 2,27[s,6H], (2), 2,64[s,6H], (3), 2,26[s,6H], (4), 2,24[s,6H]; (-N-CH₂-), (1), 4,05[s,2H], (2), 4,84[s,2H], (3), 3,48[s,2H], (4), 3,87[s,2H]; hidrogênios aromáticos, (1), 7,20-7,80 [m,5H], (2), 7,20-7,60 [m,5H], (3), 7,20-7,46 [m,5H], (4), 7,20-7,60 [m,5H]; (RMN de ¹³C), d em ppm, [-N(CH₃)₂], (2), 49,74, (3), 47,88, (4), 50,07; (-N-CH₂-), (2), 72,25, (3), 69,89, (4), 72,05, Pd-C, (2), 148,31, (3), 135,96, (4), 137,37. Não foi medido o espectro de ¹³C{¹H} do composto 1 devido a sua baixa solubilidade em CDCl₃-d.

Sugere-se para todos os complexos sintetizados uma estrutura monomérica, com o átomo de paládio apresentando uma geometria de coordenação essencialmente quadrado-planar, ao qual estão coordenados os grupos dmba através de uma ligação sigma Pd-C, os ligante cloro ou pseudohaletos de forma terminal, e a difosfina dppp formando um quelato, conforme mostrado no Esquema 1.

Os compostos 1-4 foram, então, empregados na ativação dos macrófagos in vitro. Conforme já explicitado, foram realizadas medidas de concentração de H₂O₂ liberadas pelos macrófagos, empregando-se o método espectrofotométrico e o zimosan como padrão positivo.

Na Figura 2 são mostrados os resultados para os complexos 1-4; cada barra representa o valor médio obtido em 3 animais e os testes foram realizados em quadruplicata, sendo que cada pequeno traço acima das barras representa o desvio padrão. O zimosan, parede celular de S. cerevisiae, foi utilizado como padrão positivo por provocar uma liberação de H₂O₂ da ordem de 300 nmol para cada 2.10⁵ macrófagos, em média.

Todos os complexos testados estimularam os macrófagos a liberar H₂O₂, sendo a dose resposta inferior àquela provocada pelo zimosan, segundo os dados da Figura 2. Sugere-se que este fato decorra quer pela decomposição de H₂O₂ mediada pelo paládio, como por possíveis reações entre H₂O₂ e os anéis aromáticos presentes na molécula dos organopaladados empregados²⁰.

Considerando que os complexos são estruturalmente similares, ou seja, tratam-se de espécies quadrado-planares mononucleares de Pd(II), nas quais se variou apenas a presença do pseudo-haleto coordenado ao centro metálico, foi possível verificar a influência destes ligantes na quantidade de H₂O₂ liberada e detectada. Assim, a partir dos dados da Figura 2 resulta a seguinte ordem decrescente:

[Pd(dmba)(NCS)(dppp)] (4) < [Pd(dmba)(NCO)(dppp)] (3)

< [Pd(dmba)(N₃)(dppp)] (2) < [Pd(dmba)(Cl)(dppp)] (1)

Portanto, o composto 4 contendo o pseudo-haleto NCS coordenado de forma monodentada, via átomo de nitrogênio, provocou a menor liberação de peróxido de hidrogênio. As concentrações de peróxido de hidrogênio liberadas por todos os compostos se constituem em resultados excelentes, sendo seus valores de 4 a 7 vezes menores que aquele liberado pelo padrão zimosan. Este fato é de grande importância, pois quaisquer valores de concentração de H₂O₂ próximos àqueles produzidos pelo zimosan devem ser tratados como concentrações tóxicas e sua aplicação deve ser avaliada com atenção, em função da aplicação desejada, pois sabe-se que H₂O₂ em excesso no organismo pode destruir estruturas biológicas e provocar lesões irreversíveis¹¹.

Os resultados mostram que os referidos compostos podem auxiliar o organismo hospedeiro na resposta imunológica, atuando como organo-comunicadores.

Uma conseqüência importante advinda deste trabalho reside na possibilidade de se modular a atividade de macrófagos, potentes células imunológicas, mediante variações tanto em X quanto no fragmento orgânico coordenado ao átomo de paládio.

Finalmente, uma vez determinado que os níveis de concentração de peróxido de hidrogênio liberados no "burst" respiratório não atingem valores considerados tóxicos, há um grande estímulo na continuidade das investigações de outras potencialidades biológicas destes compostos, bem como de outras séries de organopaladados. As investigações que correlacionam a estrutura dos complexos com a ativação dos macrófagos ainda estão em andamento, visando estabelecer os prováveis mecanismos envolvidos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq, CAPES e FAPESP pelo suporte financeiro e à Sra. M. C. P. Placeres pelo auxílio nos ensaios biológicos.

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Recebido em 3/3/04; aceito em 26/10/04; publicado na web em 17/2/05

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Endereço atual: Curso de Química, Universidade Católica de Brasília, CP 5490, 71966-700 Brasília - DF

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Jun 2005
• Data do Fascículo
  Jun 2005

Histórico

• Aceito
  24 Out 2004
• Recebido
  03 Mar 2004