SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.28 issue4Geochemistry of the waters of the Descoberto River hydrographic basin, Brasília/DF - BrazilDetermination of arsenic in contaminated waters using energy dispersive X-ray fluorescence author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

  • Portuguese (pdf)
  • Article in xml format
  • How to cite this article
  • SciELO Analytics
  • Curriculum ScienTI
  • Automatic translation

Indicators

Related links

Share


Química Nova

Print version ISSN 0100-4042On-line version ISSN 1678-7064

Quím. Nova vol.28 no.4 São Paulo July/Aug. 2005

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422005000400003 

ARTIGO

 

Estudo fitoquímico e avaliação da atividade moluscicida do Calophyllum brasiliense Camb (Clusiaceae)

 

Phytochemical study and evaluation of the molluscicidal activity of Calophyllum brasiliense Camb (Clusiaceae)

 

 

Arquimedes Gasparotto Jr.I; Mislaine Adriana BrenzanI; Izabel Cristina PilotoI; Diógenes Aparício Garcia Cortez*, I; Celso Vataru NakamuraII; Benedito Prado Dias FilhoII; Edson Rodrigues FilhoIII; Antonio Gilberto FerreiraIII

IDepartamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá - PR
IIDepartamento de Análises Clínicas, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá - PR
IIIDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13560-970 São Carlos - SP

 

 


ABSTRACT

The bioassay-guided fractionation against Biomphalaria glabrata of hydroalcoholic extracts of Calophyllum brasiliense aerial parts led to the isolation of the coumarin, named (-) mammea A/BB. The compound had its structure determined by both spectroscopic techniques (NMR 1H, NMR 13C, gHSQC, gHMBC and MS) and some literature comparison data. The probit analysis of (-) mammea A/BB showed LD50 = 0.67 ppm and LD90 = 1.47 ppm. In addition, the dichloromethane extract obtained from C. brasiliense leaves with significant molluscicidal activity against Biomphalaria glabrata was analyzed by HPLC-UV.

Keywords: Calophyllum brasiliense; molluscicidal activity; coumarin.


 

 

INTRODUÇÃO

O Calophyllum brasiliense Camb. é uma árvore de grande porte, que cresce principalmente em regiões de floresta da Mata Atlântica no Brasil. Regionalmente conhecido como guanandi, o chá de suas cascas obtido por infusão é um remédio popular utilizado para tratamento de reumatismo, varicoses, hemorróidas e úlceras crônicas1. Em 1992, um grupo de pesquisadores do Instituto Nacional do Câncer reportou uma cumarina, o (+) calanolideo A, isolada de espécies de Calophyllum, como uma das substâncias químicas mais ativas frente ao vírus HIV-12. Estudos fitoquímicos do caule e da resina do Calophyllum brasiliense revelaram a presença de diversas substâncias químicas, tais como xantonas, sitosterol e triterpenos3. Algumas cumarinas isoladas desta espécie apresentaram atividade anticancerígena e antimicrobiana2,4. O extrato em diclorometano do caule C. brasiliense apresentou um efeito gastroprotetor em ratos5.

Extratos brutos obtidos de diversas partes de espécies da família Clusiaceae, como Calophyllum verticillatum, C. inophyllum e C. Recedens, apresentaram atividade moluscicida na concentração de 100 ppm para a primeira espécie e 10 ppm para as outras duas6. A cumarina (±) mammea A/BB, isolada das sementes do C. Verticillatum, apresentou atividade moluscicida na concentração de 10 ppm, com 20% de mortalidade dos moluscos B. glabrata7. O extrato metanólico do caule de Kielmeyera variabilis apresentou forte atividade moluscicida em 12,5 ppm8.

As substâncias moluscicidas são um fator crucial para o controle da esquistossomose. No momento, apenas uma substância sintética, a niclosamida, é recomendada pela ONU como moluscicida9. Em países do terceiro mundo, o uso de moluscicidas sintéticos tem causado problemas de toxicidade, contaminação do meio ambiente e resistência dos caramujos (Biomphalaria glabrata) transmissores da esquistossomose. Em contraste, o uso de plantas com atividade moluscicida pode representar uma alternativa barata, além de evitar a poluição do meio ambiente, pelo fato de elas serem biodegradáveis10.

Assim, o presente trabalho tem como objetivo isolar o(s) princípio(s) ativo(s) das partes aéreas do Calophyllum brasiliense Camb., responsável pela atividade moluscicida.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os extratos brutos obtidos das folhas e galhos de C. brasiliense foram submetidos ao bioensaio de atividade moluscicida com Biomphalaria glabrata, sendo que o extrato RF foi ativo na concentração de 25 ppm, com 100% de mortalidade. Esse extrato foi refracionado e apenas a fração F1 apresentou atividade em 1,20 ppm, com 100% de mortalidade (Tabela 1). A fração F1 resultou no isolamento de uma cumariana denominada de (-) mammea A/BB (1). A substância 1 apresentou após 24 h uma DL50 de 0,67 ppm e DL90 de 1,47 ppm (Tabela 2). Por meio dos dados parciais apresentados, pode-se concluir que a substância 1 tem potencial moluscicida, quando comparada com a niclosamida (DL50 de 0,77 ppm e DL90 de 1,75 ppm)11, podendo ser um substituto em potencial desta substância que é utilizada atualmente. Estes resultados diferem dos obtidos pela literatura para a (±) mammea A/BB isolada das sementes do C. verticillatum, que apresentaram atividade em 10 ppm, com 20% de mortalidade dos caramujos B. glabrata7. A substância 1 isolada das folhas do C. brasiliense, com uma rotação óptica [a]D = -10 (c 0,14, CHCl3), apresentou maior atividade que sua forma racêmica, isolada do C. verticillatum, podendo-se supor que o enantiômero levógiro é mais ativo que a mistura racêmica.

Para confirmar a fórmula molecular C25H26O5 e a massa molecular de 406 u.m.a. da estrutura proposta para 1, foi obtido o espectro de massas dessa substância, utilizando a ionização por "electrospray" (ESI-MS), em que foram observados o íon quasi molecular [M-H]-em m/z 405 (24%), compatível com a estrutura proposta. O espectro de RMN 1H mostrou sinais de quatro metilas H-4´´: dH 1,70 sl; H-5´´: dH 1,65 d, J=1,2 Hz; H-3´´´: dH 1,28 d, J=6,9 Hz e H-5´´´: dH 0,99 t=6,6 Hz), dois hidrogênios olefínicos, um multipleto em dH 5,07-5,12 (m) e um singleto em dH 6,00, representantes dos hidrogênios H-2´´ e H-3, respectivamente, e dois sinais de hidrogênios metilênicos H-1´´: dH 3,29 d, J=6,9 Hz e HA-4´´´: dH 1.81-2,00 m; HB-4´´´: dH 1,42-1,52 m. A presença de um anel fenila foi reconhecida pela presença de dois multipletos em dH 7,41-7,44 e dH 7,53-7,58 com uma integral para cinco hidrogênios. No espectro de RMN 1H, foi observado na região desblindada um singleto em dH 14,57 referente a uma hidroxila quelatogênica. A posição do grupamento prenila no carbono C-6 foi determinada através das interações heteronucleares de átomos de carbono e hidrogênio observados nos espectros gHSQC (1JCH) gHMBC (2,3JCH), permitindo também identificar os sinais dos carbonos hidrogenados e quaternários da unidade aromática (Tabela 3). Os dados espectroscópicos da substância isolada foram comparados aos da literatura para a (±) mammea A/BB4,12. Com base nesta comparação, a substância isolada foi caracterizada como (-) mammea A/BB (1).

 

 

No cromatograma típico do extrato em diclorometano (RF) das folhas de C. brasiliense, apresentado na Figura 1, foi possível identificar a substância 1 com o tempo de retenção de 28,84 min, por meio da comparação dos dados da literatura de ultravioleta obtidos pelo detector de arranjo de fotodiodo e por comparação com o cromatograma da amostra pura, realizados nas mesmas condições. O perfil cromatográfico obtido do extrato RF permite sua padronização, para fins de controle de qualidade, contribuindo para a futura utilização desse extrato bruto no controle da esquistossomose como alternativa à utilização da substância 1.

 

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros no infravermelho foram registrados em espectrômetro Bomen – MV 100, Hartmann & Braun- Michelson. Os espectros de RMN de 1H (400,13 MHz) e de 13C (100,6 MHz) foram obtidos em espectrômetro Bruker Avance e Varian, modelos Gemini 2000 BB, 300 MHz (300,06 MHz para 1H e 75,45 MHz para 13C), utilizando-se CDCl3 como solvente e TMS como referência interna. Para obtenção de espectro no ultravioleta foi utilizado o aparelho Varian Cary 1E. Os espectros de massa por "electrospray" foram obtidos em espectrômetro Micromass Quattro LC. O espectro de CD foi obtido no equipamento Jasco 810.

As separações cromatográficas em coluna por adsorção foram realizadas utilizando-se a técnica de cromatografia no modo "flash" com sílica-gel 60 (230-400 mesh ASTM, Merck). Para as cromatografias em camada delgada analítica utilizou-se sílica-gel GF254 Merck, e as placas foram reveladas sob luz ultravioleta, nos comprimentos de onda de 254 a 366 nm, e pela utilização de reveladores com vanilina-ácido sulfúrico e vapores de iodo. Foram também utilizadas CC em gel de SEPHADEX® LH-20 para a purificação de substâncias.

Material vegetal

As partes aéreas foram coletadas na Ilha do Cardoso no estado de São Paulo, e uma exsicata foi depositada no herbário do Instituto de Botânica de São Paulo (SP 363818).

Obtenção dos extratos

As folhas e galhos, depois de secos em temperatura ambiente, foram triturados em moinho de facas e martelo, obtendo-se as massas do pó de 985 e 446 g, respectivamente O pó dos galhos e das folhas foi extraído pelo processo de maceração com etanol:água (9:1) até o esgotamento total dos princípios ativos. Os extratos hidroalcoólicos das folhas e galhos foram filtrados e evaporados em rotaevaporador a vácuo em temperatura de 45 °C, até a eliminação total do solvente orgânico. Do concentrado, em forma de xarope viscoso das folhas e caules, foram separados os resíduos e solubilizados em diclorometano e denominados RF = resíduo das folhas e RG = resíduo dos galhos. O solvente orgânico foi eliminado em rotaevaporador à vácuo, a 45 °C. Os filtrados das folhas e caules foram liofilizados e armazenados em freezer e denominados LF = liofilizado das folhas e LG = liofilizado dos galhos. Foram obtidos os extratos brutos das folhas RF = 30,87 g e LF = 150 g e dos galhos RG = 2,94 g e LG = 41,5 g.

Extração e fracionamento

O extrato bruto das folhas em diclorometano (RF = 23,54 g) foi cromatografado em coluna empacotada com sílica-gel à vácuo, utilizando-se como fase móvel solventes orgânicos de polaridade crescente: hexano; hexano:diclorometano (1:1); diclorometano; diclorometano:acetato de etila (9:1); diclorometano:acetato de etila (4:1); diclorometano:acetato de etila (1:1); acetato de etila; metanol, e metanol:água (9:1). Foram obtidas 9 frações após a evaporação do solvente orgânico: (F1 = 8,73 g), (F2 = 1,82 g), (F3 = 0,63 g), (F4 = 0,88g), (F5 = 0,61 g), (F6 = 1,12 g), (F7 = 2,26 g), (F8 = 5,47 g) e (F9 = 0,09 g). As frações obtidas foram submetidas a ensaio da atividade moluscicida, utilizando-se caramujos da espécie Biomphalaria glabrata (Tabela 1). A fração bioativa F1 (5,0 g) foi cromatografada em coluna de sílica-gel, utilizando-se como eluentes: hexano; hexano:diclorometano (98:2, 95:5, 90:10, 80:20 e 50:50); diclorometano; diclorometano:acetato de etila (98:2, 95:5, 90:10, 80:20 e 50:50); acetato de etila, e metanol, sendo obtidas 122 frações. As frações F9 a F12 e F73 a F77 com identidade cromatográfica foram reunidas, obtendo-se as subfrações F1.12 (58,2 mg) e F1.77 (278 mg), as quais foram submetidas à atividade moluscicida (Tabela 1). A subfração F1.12 foi identificada como uma cumarina, a (-) mammea A/BB (1) e a subfração F1.77 como uma mistura de três xantonas, por meio da análise dos espectros de UV, IV, EM. Foi feita aplicação de técnicas bidimensionais de RMN (gCOSY, gHSQC, gHMBC), comparando-se com os dados registrados na literatura4,12.

Mammea A/BB (1). Cristal branco, ponto de fusão 124-125 ºC (lit.:124-125 ºC, hexano) 13; [a]D = -10 (CHCl3, c 0,14), CDlmax nm (De): 287(+3,69), 316 (-3,23), UV (CHCl3) lmax/nm (log e): 226 (4,42), 295 (4,28), 333 (4,24). IV: nmáx.NaCl cm-1: 3439, 2926, 1733, 1596, 1441, 1391, 1229, 1185, 1095, 774. RMN de 1H (Tabela 2). RMN de 13C (Tabela 2). ESI-MS: m/z (int. rel.): 405 [M-H]- (100). ESI-MS/MS: m/z (int. rel.): 405 [M-H]- (24), 277(100), 305 (51), 333 (36).

Ensaio biológico

Avaliação da atividade moluscicida14

O ensaio moluscicida foi realizado com os extratos RF, LF, RG e LG, frações F1 a F8, subfração F1.77 e substância química 1. Para cada concentração foram utilizados três caramujos da espécie Biomphalaria glabrata de tamanho uniforme. As amostras foram diluídas em água filtrada do aquário, sem cloro, com o auxílio de 100 µl de DMSO nas concentrações de 100; 50; 25; 10; 5,0; 2,5; 1,2; 0,6 e 0,3 ppm em temperatura ambiente. Cada caramujo ficou separadamente, em contato com 50 ml dessa solução. Foi utilizada uma prova em branco apenas com o DMSO e como controle positivo a niclosamida. Foram realizadas leituras em 6 e 24 h e após esse tempo, foram observados os batimentos cardíacos por meio de uma lupa para verificar a mortalidade deles.

Para a obtenção de DL50 e DL90 da substância pura, foram utilizados dez caramujos adultos da espécie B. glabrata para cada concentração da amostra, de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde15 para a análise de plantas moluscicidas.

Os dados obtidos foram analisados pelo Programa Probit Versão 1.516.

 

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq e CAPES pelas bolsas e apoio financeiro aos Profs. D. A. G. Cortez e B. P. Dias Filho; a aluna de Iniciação Científica M. A. Brenzan; à Profª. M. C. M. Young do Instituto de Botânica de São Paulo, pela coleta e identificação botânica do espécimen utilizado e ao Prof. R. J. Ward, do Departamento de Química da FFCLRP-USP, pela obtenção do espectro de CD.

 

REFERÊNCIAS

1. Correa, M. P.; Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas, Imprensa Nacional: Rio de Janeiro, 1984, vol. III, p. 388.        [ Links ]

2. Ito, C.; Itoigawa, M.; Mishina, Y.; Cechinel-Filho, V.; Enjo, E.; Tokuda, H.; Nishino, H.; Furukawa.; J. Nat. Prod. 2003, 66, 368.        [ Links ]

3. Da Silva, K. L.; Dos Santos, A. R.; Mattos, P. E.; Yunes, R. A.; Delle-Manache, F.; Cechiinel-Filho, V.; Therapie 2001, 56, 431.        [ Links ]

4. Chilpa, R. R.; Muñiz, E. E.; Apan, T. R.; Amekraz, B.; Aumelas, A.; Jankowski. K.; Torrez, M. V.; Life Sci. 2004, 75, 1635.        [ Links ]

5. Sartori, N. T.; Canepelle, D.; Sousa Jr, P. T.; Martins, D. T. O.; J. Ethnopharmacol. 1999, 67, 149.        [ Links ]

6. Ravelonjato, B.; Kunesch, N.; Poisson, J. E.; Phytochemistry 1987, 26, 2973.        [ Links ]

7. Ravelonjato, B.; Libot, F.; Ramiandrasoa, F.; Kunesch, N.; Cayral, P.; Poisson, J.; Planta Med. 1992, 58, 51.        [ Links ]

8. Pinheiro, L.; Vidotti, G. J.; Young, M. C. M.; Ferreia, A. G.; Cortez, D. A. G.; Quim. Nova 2003, 26, 157.        [ Links ]

9. D'Arcy, P.; Harron, D. W. G.; Pharm. Int. 1983, 4, 16.        [ Links ]

10. Marston, A.; Hostettmann, K.; Phytochemistry 1985, 24, 639.        [ Links ]

11. Giovanelli, A.; Silva, C. L. P. A.; Medeiros, L.; Vasconcellos, M. C.; Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2002, 97, 743.        [ Links ]

12. Morel, C.; Guilet, D.; Oger, J. M.; Séraphin, D.; Sévenet, T.; Wiart, C.; Hamid, A. H. A.; Richomme, P.; Bruneton, J.; Phytochmeistry 1999, 50, 1243.        [ Links ]

13. Combrie, L.; Games, D. E.; J. Chem. Soc. (C) 1967, 2553.        [ Links ]

14. Hostettmann, H.; Kizu, H.; Tomimori, T.; Planta Med. 1982, 44, 34.        [ Links ]

15. WHO-World Health Organization; Bull. Wld. Hlth. Org. 1984, 33, 567.        [ Links ]

16. http://www.epa.gov/nerleerd/stat2.htm#probit, acessada em Agosto 2004.        [ Links ]

 

 

Recebido em 5/1/04; aceito em 17/12/04; publicado na web em 28/2/05

 

 

* e-mail: dagcortez@uem.br

Creative Commons License All the contents of this journal, except where otherwise noted, is licensed under a Creative Commons Attribution License