Estudo fitoquímico e avaliação da atividade moluscicida do Calophyllum brasiliense Camb (Clusiaceae)

Phytochemical study and evaluation of the molluscicidal activity of Calophyllum brasiliense Camb (Clusiaceae)

Resumo

The bioassay-guided fractionation against Biomphalaria glabrata of hydroalcoholic extracts of Calophyllum brasiliense aerial parts led to the isolation of the coumarin, named (-) mammea A/BB. The compound had its structure determined by both spectroscopic techniques (NMR ¹H, NMR 13C, gHSQC, gHMBC and MS) and some literature comparison data. The probit analysis of (-) mammea A/BB showed LD50 = 0.67 ppm and LD90 = 1.47 ppm. In addition, the dichloromethane extract obtained from C. brasiliense leaves with significant molluscicidal activity against Biomphalaria glabrata was analyzed by HPLC-UV.

Calophyllum brasiliense; molluscicidal activity; coumarin

Calophyllum brasiliense; molluscicidal activity; coumarin

ARTIGO

Estudo fitoquímico e avaliação da atividade moluscicida do Calophyllum brasiliense Camb (Clusiaceae)

Phytochemical study and evaluation of the molluscicidal activity of Calophyllum brasiliense Camb (Clusiaceae)

Arquimedes Gasparotto Jr.^I; Mislaine Adriana Brenzan^I; Izabel Cristina Piloto^I; Diógenes Aparício Garcia Cortez^{*, I}; Celso Vataru Nakamura^II; Benedito Prado Dias Filho^II; Edson Rodrigues Filho^III; Antonio Gilberto Ferreira^III

^IDepartamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá - PR

^IIDepartamento de Análises Clínicas, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá - PR

^IIIDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13560-970 São Carlos - SP

ABSTRACT

The bioassay-guided fractionation against Biomphalaria glabrata of hydroalcoholic extracts of Calophyllum brasiliense aerial parts led to the isolation of the coumarin, named (-) mammea A/BB. The compound had its structure determined by both spectroscopic techniques (NMR ¹H, NMR ¹³C, gHSQC, gHMBC and MS) and some literature comparison data. The probit analysis of (-) mammea A/BB showed LD₅₀ = 0.67 ppm and LD₉₀ = 1.47 ppm. In addition, the dichloromethane extract obtained from C. brasiliense leaves with significant molluscicidal activity against Biomphalaria glabrata was analyzed by HPLC-UV.

Keywords:Calophyllum brasiliense; molluscicidal activity; coumarin.

INTRODUÇÃO

O Calophyllum brasiliense Camb. é uma árvore de grande porte, que cresce principalmente em regiões de floresta da Mata Atlântica no Brasil. Regionalmente conhecido como guanandi, o chá de suas cascas obtido por infusão é um remédio popular utilizado para tratamento de reumatismo, varicoses, hemorróidas e úlceras crônicas¹. Em 1992, um grupo de pesquisadores do Instituto Nacional do Câncer reportou uma cumarina, o (+) calanolideo A, isolada de espécies de Calophyllum, como uma das substâncias químicas mais ativas frente ao vírus HIV-1². Estudos fitoquímicos do caule e da resina do Calophyllum brasiliense revelaram a presença de diversas substâncias químicas, tais como xantonas, sitosterol e triterpenos³. Algumas cumarinas isoladas desta espécie apresentaram atividade anticancerígena e antimicrobiana^2,4. O extrato em diclorometano do caule C. brasiliense apresentou um efeito gastroprotetor em ratos⁵.

Extratos brutos obtidos de diversas partes de espécies da família Clusiaceae, como Calophyllum verticillatum, C. inophyllum e C. Recedens, apresentaram atividade moluscicida na concentração de 100 ppm para a primeira espécie e 10 ppm para as outras duas⁶. A cumarina (±) mammea A/BB, isolada das sementes do C. Verticillatum, apresentou atividade moluscicida na concentração de 10 ppm, com 20% de mortalidade dos moluscos B. glabrata⁷. O extrato metanólico do caule de Kielmeyera variabilis apresentou forte atividade moluscicida em 12,5 ppm⁸.

As substâncias moluscicidas são um fator crucial para o controle da esquistossomose. No momento, apenas uma substância sintética, a niclosamida, é recomendada pela ONU como moluscicida⁹. Em países do terceiro mundo, o uso de moluscicidas sintéticos tem causado problemas de toxicidade, contaminação do meio ambiente e resistência dos caramujos (Biomphalaria glabrata) transmissores da esquistossomose. Em contraste, o uso de plantas com atividade moluscicida pode representar uma alternativa barata, além de evitar a poluição do meio ambiente, pelo fato de elas serem biodegradáveis¹⁰.

Assim, o presente trabalho tem como objetivo isolar o(s) princípio(s) ativo(s) das partes aéreas do Calophyllum brasiliense Camb., responsável pela atividade moluscicida.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os extratos brutos obtidos das folhas e galhos de C. brasiliense foram submetidos ao bioensaio de atividade moluscicida com Biomphalaria glabrata, sendo que o extrato RF foi ativo na concentração de 25 ppm, com 100% de mortalidade. Esse extrato foi refracionado e apenas a fração F1 apresentou atividade em 1,20 ppm, com 100% de mortalidade (Tabela 1). A fração F1 resultou no isolamento de uma cumariana denominada de (-) mammea A/BB (1). A substância 1 apresentou após 24 h uma DL₅₀ de 0,67 ppm e DL₉₀ de 1,47 ppm (Tabela 2). Por meio dos dados parciais apresentados, pode-se concluir que a substância 1 tem potencial moluscicida, quando comparada com a niclosamida (DL₅₀ de 0,77 ppm e DL₉₀ de 1,75 ppm)¹¹, podendo ser um substituto em potencial desta substância que é utilizada atualmente. Estes resultados diferem dos obtidos pela literatura para a (±) mammea A/BB isolada das sementes do C. verticillatum, que apresentaram atividade em 10 ppm, com 20% de mortalidade dos caramujos B. glabrata⁷. A substância 1 isolada das folhas do C. brasiliense, com uma rotação óptica [a]_D = -10 (c 0,14, CHCl₃), apresentou maior atividade que sua forma racêmica, isolada do C. verticillatum, podendo-se supor que o enantiômero levógiro é mais ativo que a mistura racêmica.

Para confirmar a fórmula molecular C₂₅H₂₆O₅ e a massa molecular de 406 u.m.a. da estrutura proposta para 1, foi obtido o espectro de massas dessa substância, utilizando a ionização por "electrospray" (ESI-MS), em que foram observados o íon quasi molecular [M-H]^-em m/z 405 (24%), compatível com a estrutura proposta. O espectro de RMN ¹H mostrou sinais de quatro metilas H-4´´: d_H 1,70 sl; H-5´´: d_H 1,65 d, J=1,2 Hz; H-3´´´: d_H 1,28 d, J=6,9 Hz e H-5´´´: d_H 0,99 t=6,6 Hz), dois hidrogênios olefínicos, um multipleto em d_H 5,07-5,12 (m) e um singleto em d_H 6,00, representantes dos hidrogênios H-2´´ e H-3, respectivamente, e dois sinais de hidrogênios metilênicos H-1´´: d_H 3,29 d, J=6,9 Hz e H_A-4´´´: d_H 1.81-2,00 m; H_B-4´´´: d_H 1,42-1,52 m. A presença de um anel fenila foi reconhecida pela presença de dois multipletos em d_H 7,41-7,44 e d_H 7,53-7,58 com uma integral para cinco hidrogênios. No espectro de RMN ¹H, foi observado na região desblindada um singleto em d_H 14,57 referente a uma hidroxila quelatogênica. A posição do grupamento prenila no carbono C-6 foi determinada através das interações heteronucleares de átomos de carbono e hidrogênio observados nos espectros gHSQC (¹J_CH) gHMBC (^2,3J_CH), permitindo também identificar os sinais dos carbonos hidrogenados e quaternários da unidade aromática (Tabela 3). Os dados espectroscópicos da substância isolada foram comparados aos da literatura para a (±) mammea A/BB^4,12. Com base nesta comparação, a substância isolada foi caracterizada como (-) mammea A/BB (1).

No cromatograma típico do extrato em diclorometano (RF) das folhas de C. brasiliense, apresentado na Figura 1, foi possível identificar a substância 1 com o tempo de retenção de 28,84 min, por meio da comparação dos dados da literatura de ultravioleta obtidos pelo detector de arranjo de fotodiodo e por comparação com o cromatograma da amostra pura, realizados nas mesmas condições. O perfil cromatográfico obtido do extrato RF permite sua padronização, para fins de controle de qualidade, contribuindo para a futura utilização desse extrato bruto no controle da esquistossomose como alternativa à utilização da substância 1.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros no infravermelho foram registrados em espectrômetro Bomen – MV 100, Hartmann & Braun- Michelson. Os espectros de RMN de ¹H (400,13 MHz) e de ¹³C (100,6 MHz) foram obtidos em espectrômetro Bruker Avance e Varian, modelos Gemini 2000 BB, 300 MHz (300,06 MHz para ¹H e 75,45 MHz para ¹³C), utilizando-se CDCl₃ como solvente e TMS como referência interna. Para obtenção de espectro no ultravioleta foi utilizado o aparelho Varian Cary 1E. Os espectros de massa por "electrospray" foram obtidos em espectrômetro Micromass Quattro LC. O espectro de CD foi obtido no equipamento Jasco 810.

As separações cromatográficas em coluna por adsorção foram realizadas utilizando-se a técnica de cromatografia no modo "flash" com sílica-gel 60 (230-400 mesh ASTM, Merck). Para as cromatografias em camada delgada analítica utilizou-se sílica-gel GF₂₅₄ Merck, e as placas foram reveladas sob luz ultravioleta, nos comprimentos de onda de 254 a 366 nm, e pela utilização de reveladores com vanilina-ácido sulfúrico e vapores de iodo. Foram também utilizadas CC em gel de SEPHADEX^® LH-20 para a purificação de substâncias.

Material vegetal

As partes aéreas foram coletadas na Ilha do Cardoso no estado de São Paulo, e uma exsicata foi depositada no herbário do Instituto de Botânica de São Paulo (SP 363818).

Obtenção dos extratos

As folhas e galhos, depois de secos em temperatura ambiente, foram triturados em moinho de facas e martelo, obtendo-se as massas do pó de 985 e 446 g, respectivamente O pó dos galhos e das folhas foi extraído pelo processo de maceração com etanol:água (9:1) até o esgotamento total dos princípios ativos. Os extratos hidroalcoólicos das folhas e galhos foram filtrados e evaporados em rotaevaporador a vácuo em temperatura de 45 °C, até a eliminação total do solvente orgânico. Do concentrado, em forma de xarope viscoso das folhas e caules, foram separados os resíduos e solubilizados em diclorometano e denominados RF = resíduo das folhas e RG = resíduo dos galhos. O solvente orgânico foi eliminado em rotaevaporador à vácuo, a 45 °C. Os filtrados das folhas e caules foram liofilizados e armazenados em freezer e denominados LF = liofilizado das folhas e LG = liofilizado dos galhos. Foram obtidos os extratos brutos das folhas RF = 30,87 g e LF = 150 g e dos galhos RG = 2,94 g e LG = 41,5 g.

Extração e fracionamento

O extrato bruto das folhas em diclorometano (RF = 23,54 g) foi cromatografado em coluna empacotada com sílica-gel à vácuo, utilizando-se como fase móvel solventes orgânicos de polaridade crescente: hexano; hexano:diclorometano (1:1); diclorometano; diclorometano:acetato de etila (9:1); diclorometano:acetato de etila (4:1); diclorometano:acetato de etila (1:1); acetato de etila; metanol, e metanol:água (9:1). Foram obtidas 9 frações após a evaporação do solvente orgânico: (F1 = 8,73 g), (F2 = 1,82 g), (F3 = 0,63 g), (F4 = 0,88g), (F5 = 0,61 g), (F6 = 1,12 g), (F7 = 2,26 g), (F8 = 5,47 g) e (F9 = 0,09 g). As frações obtidas foram submetidas a ensaio da atividade moluscicida, utilizando-se caramujos da espécie Biomphalaria glabrata (Tabela 1). A fração bioativa F1 (5,0 g) foi cromatografada em coluna de sílica-gel, utilizando-se como eluentes: hexano; hexano:diclorometano (98:2, 95:5, 90:10, 80:20 e 50:50); diclorometano; diclorometano:acetato de etila (98:2, 95:5, 90:10, 80:20 e 50:50); acetato de etila, e metanol, sendo obtidas 122 frações. As frações F9 a F12 e F73 a F77 com identidade cromatográfica foram reunidas, obtendo-se as subfrações F1.12 (58,2 mg) e F1.77 (278 mg), as quais foram submetidas à atividade moluscicida (Tabela 1). A subfração F1.12 foi identificada como uma cumarina, a (-) mammea A/BB (1) e a subfração F1.77 como uma mistura de três xantonas, por meio da análise dos espectros de UV, IV, EM. Foi feita aplicação de técnicas bidimensionais de RMN (gCOSY, gHSQC, gHMBC), comparando-se com os dados registrados na literatura^4,12.

Mammea A/BB (1). Cristal branco, ponto de fusão 124-125 ºC (lit.:124-125 ºC, hexano) ¹³; [a]_D = -10 (CHCl₃, c 0,14), CD_lmax nm (De): 287(+3,69), 316 (-3,23), UV (CHCl₃) l_max/nm (log e): 226 (4,42), 295 (4,28), 333 (4,24). IV: nmáx.^NaCl cm^-1: 3439, 2926, 1733, 1596, 1441, 1391, 1229, 1185, 1095, 774. RMN de ¹H (Tabela 2). RMN de ¹³C (Tabela 2). ESI-MS: m/z (int. rel.): 405 [M-H]^- (100). ESI-MS/MS: m/z (int. rel.): 405 [M-H]^- (24), 277(100), 305 (51), 333 (36).

Ensaio biológico

Avaliação da atividade moluscicida ¹⁴

O ensaio moluscicida foi realizado com os extratos RF, LF, RG e LG, frações F1 a F8, subfração F1.77 e substância química 1. Para cada concentração foram utilizados três caramujos da espécie Biomphalaria glabrata de tamanho uniforme. As amostras foram diluídas em água filtrada do aquário, sem cloro, com o auxílio de 100 µl de DMSO nas concentrações de 100; 50; 25; 10; 5,0; 2,5; 1,2; 0,6 e 0,3 ppm em temperatura ambiente. Cada caramujo ficou separadamente, em contato com 50 ml dessa solução. Foi utilizada uma prova em branco apenas com o DMSO e como controle positivo a niclosamida. Foram realizadas leituras em 6 e 24 h e após esse tempo, foram observados os batimentos cardíacos por meio de uma lupa para verificar a mortalidade deles.

Para a obtenção de DL₅₀ e DL₉₀ da substância pura, foram utilizados dez caramujos adultos da espécie B. glabrata para cada concentração da amostra, de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde¹⁵ para a análise de plantas moluscicidas.

Os dados obtidos foram analisados pelo Programa Probit Versão 1.5¹⁶.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq e CAPES pelas bolsas e apoio financeiro aos Profs. D. A. G. Cortez e B. P. Dias Filho; a aluna de Iniciação Científica M. A. Brenzan; à Profª. M. C. M. Young do Instituto de Botânica de São Paulo, pela coleta e identificação botânica do espécimen utilizado e ao Prof. R. J. Ward, do Departamento de Química da FFCLRP-USP, pela obtenção do espectro de CD.

Recebido em 5/1/04; aceito em 17/12/04; publicado na web em 28/2/05

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  http://www.epa.gov/nerleerd/stat2.htm#probit, acessada em Agosto 2004.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Ago 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Aceito
  17 Dez 2004
• Recebido
  05 Jan 2004