Resumo
Phytochemical investigation of the hexane, ethyl acetate and methanolic extracts of roots and leaf stalks of Euterpe precatoria Mart. ("açaí"), afforded stigmast-4-en-6beta-ol-3-one (3); p-hydroxy benzoic acid (4); 3beta-O-D-glucopyranosyl-sitosterol (5); beta-sitosterol palmitate (6); mixtures of beta-sitosterol and stigmasterol (1 and 2), alpha-, beta-amirin and lupeol (7, 8 and 9), friedelin-3-one and 28-hydroxy-friedelin-3-one (10 and 11) and alpha-, beta-D-glucose (12, 13). Except for 1, 2 and 4, the other isolated constituents are described in the genus for the first time. Compounds 3 and 5 gave good results in the brine shrimp bioassay, which detects compounds with potential uses as antitumor agents, pesticides, etc..
steroids; triterpenoids; açaí
steroids; triterpenoids; açaí
ARTIGO
Constituintes químicos da raiz e do talo da folha do açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae)
Chemical constituents from roots and leaf stalks of açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae)
Ana Lúcia Queiroz de Assis GalottaI; Maria Amélia Diamantino Boaventura* * e-mail: dianadb@dedalus.lcc.ufmg.br , II
IDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 3000, Campus Universitário, 69000-000 Manaus - AM
IIDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, 31270-970 Belo Horizonte - MG
ABSTRACT
Phytochemical investigation of the hexane, ethyl acetate and methanolic extracts of roots and leaf stalks of Euterpe precatoria Mart. ("açaí"), afforded stigmast-4-en-6b-ol-3-one (3); p-hydroxy benzoic acid (4); 3b-O-D-glucopyranosyl-sitosterol (5); b-sitosterol palmitate (6); mixtures of b-sitosterol and stigmasterol (1 and 2), a-, b-amirin and lupeol (7, 8 and 9), friedelin-3-one and 28-hydroxy-friedelin-3-one (10 and 11) and a-, b-D-glucose (12, 13). Except for 1, 2 and 4, the other isolated constituents are described in the genus for the first time. Compounds 3 and 5 gave good results in the brine shrimp bioassay, which detects compounds with potential uses as antitumor agents, pesticides, etc..
Keywords: steroids; triterpenoids; açaí.
INTRODUÇÃO
A família das palmeiras (Arecaceae), conhecida anteriormente como Palmae, é uma das maiores famílias vegetais do mundo e, pela forma e aspecto, é a mais característica da flora tropical1. As palmeiras dividem-se em 6 subfamílias, que apresentam 200 gêneros e 1500 espécies2,3.
O gênero Euterpe, que congrega cerca de 28 espécies e ocorre nas Américas Central e do Sul, está distribuído por toda bacia Amazônica. As três espécies que ocorrem com maior freqüência são oleraceae, edulis e precatoria4.
Euterpe precatoria, de ocorrência natural apenas no estado do Amazonas, é conhecida popularmente como açaí, açaí de terra firme, açaí solitário5,6. Esta espécie tem alto potencial econômico, principalmente pelo seu fruto que é utilizado na preparação de sorvetes e sucos, e pelo palmito extraído de seus caules. As folhas são empregadas na cobertura de barracas provisórias e fechamento de paredes. Na etnomedicina, a raiz e o talo da folha são usados contra dores musculares e picadas de cobra e a folha, para aliviar dores no peito6,7. A raiz também é utilizada no tratamento da malária e contra infecções hepáticas e renais3,8. A semente fornece um óleo verde escuro, usado popularmente como antidiarréico8.
Estudos fitoquímicos e farmacológicos são bastante limitados neste gênero, sendo que dos frutos de E. oleraceae e E. edulis já foram isolados ácidos graxos, esteróides e antocianinas9,10. Da raiz de E. precatoria foi descrito recentemente o isolamento do ácido p-hidroxibenzóico e da lignana, diidrodiconiferil dibenzoato, tendo esta última, apresentado uma acentuada atividade anti-malárica11.
Tendo em vista que a espécie originária do estado do Amazonas possui grande importância econômica, e é muito pouco descrita na literatura, foi proposto seu estudo para o trabalho de tese de Doutorado da Profa. A. L. Q. de A. Galotta.
Este trabalho descreve os resultados parciais do estudo fitoquímico de frações obtidas a partir dos extratos hexânicos e acetato de etila da raiz e do talo da folha e do extrato metanólico da raiz de E. precatoria Mart., em que foram identificados uma substância fenólica, cinco esteróides, cinco triterpenos e dois açúcares.
PARTE EXPERIMENTAL
Procedimentos experimentais gerais
Os espectros na região do infravermelho foram obtidos com uso de pastilhas de KBr a 1% em aparelho modelo Spectrun 2000 FT-IR, da Perkin Elmer. Os espectros de RMN 1H, RMN 13C, DEPT 135, HMQC, HMBC e 1H-1H COSY foram obtidos em espectrômetros da Bruker Advance DX-200 e DRX-400. Os deslocamentos químicos foram registrados em unidade d e as constantes de acoplamento dadas em Hz. O tetrametilsilano, TMS, foi usado como referência interna e como solventes, clorofórmio, metanol, piridina e água deuterados. Os pontos de fusão foram determinados em um bloco Kofler adaptado a microscópio. Os valores, obtidos em graus centígrados, não foram corrigidos. A detecção das placas de cromatografia em camada delgada analítica de sílica foram feitas por borrifamento com reagente de Lieberman-Bouchard e vanilina/ácido sulfúrico 20%.
Material vegetal
O material botânico foi coletado no Mini Campus da Universidade Federal do Amazonas em 09/09/2000 às 9 h. A exsicata foi depositada no Herbário da mesma Instituição (nº. 7297).
Isolamento dos constituintes
A partir do pó da raiz (1,8 kg) e do talo da folha (2,7 kg), secos, por sucessivas e exaustivas extrações, foram obtidos os extratos hexânicos (1,6 e 3,3 g, respectivamente), em acetato de etila (5,6 e 13,9 g, respectivamente) e metanólicos (106,3 e 26,5 g, respectivamente). Estes extratos foram submetidos a uma coluna de sílica gel, utilizando-se hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, em polaridades crescentes.
Misturas de b-sitosterol (1) e estigmasterol (2) foram isoladas por cromatografia em coluna de sílica gel, a partir de todos os extratos estudados, utilizando-se misturas de hexano/acetato de etila, como eluentes: extratos hexânicos da raiz (32,2 mg/1,6 g de extrato) e do talo da folha (29,3 mg/3,3 g de extrato); extratos em acetato de etila da raiz (30,3 mg/5,6 g de extrato) e do talo da folha (15,2 mg/13,9 g de extrato) e extrato metanólico da raiz (10,3 mg/5,0 g de extrato).
O estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3) foi isolado por cromatografia em coluna de sílica gel, a partir dos extratos hexânicos da raiz (11,9 mg/1,6 g de extrato) e do talo da folha (9,3 mg/3,3 g de extrato), utilizando-se mistura de hexano/acetato de etila 7:3, como eluentes. As frações da raiz, eluídas com hexano/acetato de etila 6:4, foram novamente fracionadas em sílica gel, obtendo-se o ácido p-hidroxibenzóico (4, 9,8 mg) e o 3b-O-b-D- glicopiranosil sitosterol (5, 35,4 mg). Estas duas substâncias foram também isoladas, por cromatografia em coluna de sílica gel, a partir do extrato em acetato de etila da raiz (4, 9,0 mg e 5, 31,5 mg/5,6 g de extrato). Do extrato em acetato de etila da raiz também foram isolados o palmitato de b-sitosterila (6, 21,3 mg/5,6 g de extrato) e uma mistura (12,3 mg) de a- e b-amirina (7 e 8) e lupeol (9).
As frações, obtidas a partir de primeira coluna do extrato em acetato de etila do talo da folha, foram submetidas a uma coluna de sílica gel empregando-se como eluentes diclorometano/acetato de etila 9:1. Deste procedimento foram isolados o palmitato de b-sitosterila (6, 12,1 mg/13,9 g de extrato) e uma mistura (36,0 mg) de friedelan-3-ona (10) e 28-hidroxi-friedelan-3-ona (11).
Parte do extrato metanólico da raiz (85,0 g) foi dissolvido em 350 mL de metanol e a esta solução foram adicionados 350 mL de clorofórmio. O filtrado (31,8 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel. A partir das frações eluídas com acetato de etila/metanol (7:3) foi obtida uma mistura (22,7 mg) de a-D-glicose (12) e b-D-glicose (13).
Estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3). Sólido branco. Recristalização em acetona. P.F. 210-212 °C (lit12 208-210 ºC).
3b-O-b-D-glicopiranosil sitosterol (5) Sólido branco amorfo. P.F. 289-291 °C (lit.13 295-300 ºC).
Palmitato de b-sitosterila (6) Sólido branco. P.F. 85-88 °C (lit.14 85-86 ºC).
Teste de atividade citotóxica
O teste de atividade citotóxica foi realizado utilizando-se Artemia salina e foi feito de acordo com a metodologia descrita por Meyer et al.15.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir dos extratos hexânicos da raiz e do talo da folha, dos extratos em acetato de etila da raiz e do talo da folha e do extrato metanólico da raiz foram isoladas, pela utilização de técnicas cromatográficas, substâncias na forma pura ou de misturas. Com exceção do b-sitosterol (1), estigmasterol (2) e ácido p-hidroxibenzóico (4), todas as substâncias isoladas, apesar de conhecidas, estão sendo descritas pela primeira vez no gênero Euterpe. A presença de triterpenos em Arecaceae é relativamente rara; os esteróides são mais freqüentes, principalmente b-sitosterol e estigmasterol10.
A identificação estrutural dessas substâncias foi baseada na análise dos dados espectrais e pela comparação destes com dados de RMN 1H, 13C e técnicas correlatas descritos na literatura.
A relação entre o b-sitosterol (1) e o estigmasterol (2) nas misturas isoladas a partir dos extratos da raiz e do talo da folha de E. precatoria foi obtida através dos espectros de RMN 1H; as percentagens dos dois constituintes foram calculadas com base na integração dos sinais correspondentes aos hidrogênios H-6 (b-sitosterol + estigmasterol) e H-22 e H-23 do estigmasterol (Tabela 1)16. Em levantamento bibliográfico17 pode ser verificado que o b-sitosterol apresenta-se, em geral, distribuído em todas as partes das plantas e, quando isolado em mistura com o estigmasterol, está praticamente sempre em maior proporção. Em E. precatoria, esta mistura foi encontrada em todas as partes da planta estudadas até agora, mas o interessante é que se observou um aumento progressivo da proporção de estigmasterol em relação ao b-sitosterol a partir da raiz em direção ao talo. O grau de incidência de luz na bioconversão do b-sitosterol em estigmasterol poderia ser considerado, neste caso, como o fator determinante. Infelizmente, a maioria dos trabalhos obtidos da literatura não descrevem análises quantitativas sobre a proporção entre as duas substâncias, nos extratos estudados.
O espectro no Infravermelho de estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3) apresentou banda larga com absorção em 3400 cm-1, característica de estiramento de grupo hidroxila. A absorção intensa centrada em 1690 cm1 foi atribuída à presença de grupo cetona de sistema a,b-insaturado12. O espectro de RMN 1H apresentou sinais múltiplos na região entre d 0,74-2,55, que foram atribuídos a hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos compatíveis com a estrutura de esteróides. Além disso, foram observados sinais relativos a um hidrogênio vinílico (d 5,81, 1H, s) e a um hidrogênio geminal a um grupo hidroxila em (d 4,35, 1H, t, J= 2,70 Hz). Análise comparativa dos espectros de RMN 13C e DEPT-135 foi usada para caracterizar a presença de seis grupos metila, dez metilênicos, nove metínicos e quatro carbonos quaternários. A presença do grupo carbonila a,b-insaturado foi confirmada pelos sinais de carbono em d 200,5, 126,3 e 168,6. Estes dados, bem como a confirmação do sistema metínico carbinólico pelo sinal em d 73,2, sugeriram a estrutura de um ceto-álcool.
A análise das seções expandidas dos mapas de contornos HMBC, HMQC e H-H COSY permitiu determinar a posição da carbonila em C-3, conjugado com D(4-5) e o grupo metínico carbinólico em C-6. A determinação da configuração relativa da hidroxila em b e, conseqüentemente, a posição a equatorial para H-6 foram estabelecidas com base na ausência de sinal de octeto, no espectro de RMN 1H, referente aos acoplamentos entre (H-6/H-7a, H-6/H-7b, (axial-axial e axial-equatorial, respectivamente) e H-6/H-4, alílico, aliadas à presença do sinal de H-6 (d 4,35, 1H, t, J= 2,7 Hz), cuja multiplicidade caracteriza o acoplamento com H-7 (d 2,01, 2H, m)18. A comparação desses dados com valores de RMN 1H e 13C encontrados na literatura permitiram a identificação de 3 como estigmast-4-en-6b-ol-3-ona12. O espectro de RMN 1H de 5 apresentou, além de sinais referentes aos hidrogênios de sistema esteroidal entre d 0,67-2,40, sinais entre d 3,49-4,14, característicos de hidrogênios de natureza glicosídica. A atribuição da configuração b da glicose foi baseada na observação de um dupleto em d 4,61 com constante de acoplamento de 7,4 Hz, diaxial entre H-1'e H-2'. Estes dados, além de sinal em d 5,32 (relativo a hidrogênio olefínico), compatíveis com sinais observados no espectro de RMN 13C e DEPT-135 em d 140,7 e 121,7 estão de acordo com aqueles da literatura para o 3b-O-b-D-glicopiranosil sitosterol13.
O espectro no infravermelho do palmitato de b-sitosterila (6) apresentou bandas em 1712 cm-1, compatível com estiramento de carbonila de éster, em 1585 cm-1 relativa a estiramento C-H de sistema olefínico e em 721 cm-1 de deformação de ligação (CH2)n para n > 7.Os espectros de RMN 1H, RMN 13C e DEPT-135 permitiram propor para 6 a estrutura do carboxilato de b-sitosterila [CH3(CH2)nCOOC29H 49]. O comprimento da cadeia alifática de 6 foi determinado como n=14, com base na integração do espectro de RMN 1H e RMN de 13C quantitativo (além de ser confirmado por dados da literatura14).
A identificação de 4 e das misturas de esteróides e triterpenos (1 e 2; 7, 8 e 9; 10 e 11) e dos açúcares 12 e 13 foi feita por análise dos espectros de RMN e por comparação desses dados com aqueles da literatura16,19-23.
O espectro de RMN 13C da mistura de 3 triterpenos 7, 8 e 9 apresentou sinais relativos a carbonos olefínicos em d 124,40 e 139,57; d 121,70 e 144,50; d 109,31 e 150,96, característicos de a- e b-amirina e lupeol, respectivamente20,22.
A análise combinada dos espectros de RMN 13C e DEPT135 da mistura constituída por 10 e 11 permitiu identificar a friedelan-3-ona (10) como componente principal da mistura21 e a 28-hidróxi-friedelan-3-ona (11) como o componente minoritário.
O ácido 4 e a mistura de açúcares 12 e 13 foram identificados através da comparação dos seus dados dos espectros de RMN 13C e 1H com aqueles da literatura19,23.
Teste de citotoxicidade sobre a Artemia salina
Um método simples, barato e eficiente de determinação de toxicidade aguda de substâncias é o ensaio sobre a Artemia salina Leach, um micro crustáceo utilizado no estágio larval, muito dependente do meio onde se encontra e, portanto, sensível a bioensaios. A técnica e sua utilização sistemática, como meio de se obterem substâncias ativas de extratos vegetais, é descrita por Meyer e colaboradores15. Extratos com DL50<1000 µg/mL são apropriados para biomonitoramento utilizando-se este teste24. Substâncias cuja DL50 estiverem na faixa de 80 µg/mL<DL50>250 µg/mL podem apresentar atividade tripanomicida, por outro lado, substâncias com toxicidade DL50<145 µg/mL podem apresentar atividade anti-tumoral25.
Estudo anterior da raiz de E. precatoria indicou atividade anti-malárica11, nada mais tendo sido encontrado na literatura quanto a atividades biológicas detectadas na espécie. Como é usual em nossos laboratórios de fitoquímica, uma triagem foi realizada sobre os extratos obtidos, utilizando o teste de A. salina, visando a detecção de atividade citotóxica, que pode ser correlacionada com atividade anti-malárica, além de outras.
O extrato em acetato de etila do talo da folha, bem como o extrato metanólico da raiz não apresentaram atividade citotóxica (DL50>1000 µg/mL). Os extratos hexânicos do talo da folha e da raiz responderam positivamente ao teste de toxicidade frente à A. salina com DL50<150 µg/mL e DL50<500 µg/mL, respectivamente.
A estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3) apresentou excelente atividade citotóxica com uma DL50= 39 µg/mL, pela primeira vez, em nosso conhecimento, descrita na literatura.
O 3b-O-b-D-glicopiranosil sitosterol (5) também mostrou forte atividade citotóxica (DL50= 67 µg/mL), fato já observado por Ratnayake et al.26.
É interessante observar que apenas os extratos de onde se isolou a substância 3 foram ativos; com relação a 5, isolado a partir dos extratos hexânico e em acetato de etila da raiz, a grande diferença de concentração da substância nos extratos (2,21 e 0,56%, respectivamente) poderia explicar a ausência de atividade do segundo, mostrando a confiabilidade do teste.
O palmitato de b-sitosterila (6) apresentou fraca atividade, com DL50= 617 µg/mL (Tabela 2).
As misturas não foram testadas, mas o b-sitosterol é inativo, de acordo com dados da literatura27,28; a- e b-amirina apresentaram DL50= 200 µg/ml29 e DL50= 23 µg/ml28, respectivamente; o lupeol é descrito como possuindo DL50 > 30028 e o ácido p-hidroxibenzóico, DL50= 260 µg/ml30.
Apesar de as substâncias isoladas, descritas neste trabalho serem todas já conhecidas, é preciso se levar em conta que a espécie, de grande importância econômica, além de apresentar inúmeras atividades na medicina popular, foi muito pouco estudada; estas são novas informações, pois este é o primeiro relato da presença dessas substâncias na espécie. Além disso, o teste de citotoxicidade sobre A. salina mostrou resultado positivo inédito para uma substância conhecida, mas ainda não testada. Testes mais específicos (atividades anti-tumoral, anti-malárica e pesticida) serão realizados sobre 3.
Recentemente, Mors e colaboradores31 testaram várias substâncias naturais de diferentes classes, com histórico de neutralizar efeitos dos venenos de cobra. O teste realizado foi aquele do efeito antiletal sobre o veneno da Bothrops. Os autores observaram que substâncias amplamente difundidas no reino vegetal como o b-sitosterol, estigmasterol e 3b-glicopiranosídeo de b-sitosterila, dentre outras, apresentaram 70% de proteção contra o efeito antiletal deste veneno. A abundância de esteróides nos extratos de E. precatoria pode justificar a ação anti-ofídica atribuída à espécie na medicina popular.
AGRADECIMENTOS
À CAPES, ao CNPq e à FAPEMIG por bolsas e por suporte financeiro.
Recebido em 29/4/04; aceito em 19/11/04; publicado na web em 13/4/05
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
11 Ago 2005 -
Data do Fascículo
Ago 2005
Histórico
-
Recebido
29 Abr 2004 -
Aceito
19 Nov 2004