Oxidação de proteínas por oxigênio singlete: mecanismos de dano, estratégias para detecção e implicações biológicas

Singlet oxygen-mediated protein oxidation: damage mechanisms, detection techniques and biological implication

Resumo

Proteins are potential targets for singlet molecular oxygen (¹O2) oxidation. Damages occur only at tryptophan, tyrosine, histidine, methionine, and cysteine residues at physiological pH, generating oxidized compounds such as hydroperoxides. Therefore, it is important to understand the mechanisms by which ¹O2, hydroperoxides and other oxidized products can trigger further damage. The improvement and development of new tools, such as clean sources of ¹O2 and isotopic labeling approaches in association with HPLC/mass spectrometry detection will allow one to elucidate mechanistic features involving ¹O2-mediated protein oxidation.

singlet oxygen; protein oxidation; protein peroxide

singlet oxygen; protein oxidation; protein peroxide

DIVULGAÇÃO

Oxidação de proteínas por oxigênio singlete: mecanismos de dano, estratégias para detecção e implicações biológicas

Singlet oxygen-mediated protein oxidation: damage mechanisms, detection techniques and biological implication

Graziella E. Ronsein^I; Sayuri Miyamoto^I; Etelvino Bechara^I; Paolo Di Mascio^{*, I}; Glaucia R. Martinez^II

^IDepartamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 748, 05508-900 São Paulo - SP, Brasil

^IIDepartamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Centro Politécnico, CP 19046, 81531-990, Curitiba - PR, Brasil

ABSTRACT

Proteins are potential targets for singlet molecular oxygen (¹O₂) oxidation. Damages occur only at tryptophan, tyrosine, histidine, methionine, and cysteine residues at physiological pH, generating oxidized compounds such as hydroperoxides. Therefore, it is important to understand the mechanisms by which ¹O₂, hydroperoxides and other oxidized products can trigger further damage. The improvement and development of new tools, such as clean sources of ¹O₂ and isotopic labeling approaches in association with HPLC/mass spectrometry detection will allow one to elucidate mechanistic features involving ¹O₂-mediated protein oxidation.

Keywords: singlet oxygen; protein oxidation; protein peroxide.

INTRODUÇÃO

Oxigênio singlete

O oxigênio molecular, no estado fundamental, possui dois elétrons com spins paralelos ocupando dois orbitais p de mesma energia, chamados de degenerados, caracterizando, portanto, um estado triplete (³å_g^-). Conseqüentemente, a redução direta do oxigênio por dois elétrons é proibida pela regra de conservação do spin. Uma forma mais reativa do oxigênio, conhecida como oxigênio singlete, pode ser gerada por um acréscimo de energia. Nela, a restrição da regra de conservação do spin é removida. Sendo assim, o oxigênio singlete é muito mais oxidante que o oxigênio molecular no seu estado fundamental. Existem dois estados singlete do oxigênio: o primeiro estado excitado, ¹D_g, tem dois elétrons com spins opostos no mesmo orbital, possui uma energia de 22,5 kcal acima do estado fundamental e tempo de meia vida em solvente aquoso de aproximadamente 10^-6 s; o segundo estado excitado, ¹å_g^-, tem um elétron em cada orbital p degenerado, com spins opostos, e possui uma energia de 37,5 kcal acima do estado fundamental. O estado ¹å_g^- tem um tempo de vida muito curto (10^-11 s) em meio aquoso, sendo rapidamente desativado para o estado ¹D_g. Portanto, apenas o primeiro estado apresenta interesse em sistemas biológicos e será denotado por ¹O₂ (Tabela 1) ¹.

Por se tratar de uma espécie eletronicamente excitada, o ¹O₂ decai para o estado fundamental emitindo luz. A investigação espectroscópica da luminescência vermelha que acompanha a decomposição de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) na presença de hipoclorito (OCl^-) (Equação 1), realizada por Khan e Kasha², revelou a existência de duas bandas de emissão centradas em 634 e 703 nm, atribuídas ao decaimento para o estado fundamental do ¹O₂ gerado na reação.

Atualmente, está bem estabelecido que essas bandas correspondem à transição simultânea de duas moléculas de ¹O₂ ao estado fundamental triplete, também conhecida como emissão bimolecular (Equação 2). Esta emissão pode ser monitorada por meio de uma fotomultiplicadora sensível à região do vermelho do espectro visível, termoeletricamente resfriada, conectada a um sistema discriminador e amplificador³ .

Além do decaimento bimolecular do ¹O₂, também existe a transição monomolecular do ¹O₂, que ocorre na região do infravermelho próximo (Equação 3). A luminescência desta transição pode ser detectada por um espectrômetro acoplado a um fotodetector constituído de um fotodiodo de germânio resfriado com nitrogênio líquido⁴. Recentemente, nosso laboratório desenvolveu um sistema de detecção composto por uma fotomultiplicadora sensível na região do infravermelho (800 a 1700 nm), que é refrigerada a -80 ºC por meio de nitrogênio líquido. Este sistema está conectado a uma fonte de alta tensão e a um monocromador capaz de varrer as regiões do ultravioleta, visível e infravermelho. Para o infravermelho, utiliza-se uma grade capaz de varrer entre 800 e 2700 nm (Figura 1). A intensidade da emissão monomolecular é diretamente proporcional à concentração do ¹O₂ e, portanto, fornece uma medida direta da quantidade produzida⁵.

Emissão bimolecular:

Emissão monomolecular:

Fontes de ¹O₂

Em laboratório, o ¹O₂ é geralmente gerado por reações de fotossensibilização. Nestas reações, são utilizadas moléculas conhecidas como fotossensibilizadores (tais como azul de metileno e rosa bengala)¹. Quando estes fotossensibilizadores são irradiados com luz ultravioleta ou visível em determinados comprimentos de onda, absorvem energia e passam a um estado excitado singlete (¹S^*). Este estado ¹S^* pode decair para o estado fundamental singlete (⁰S) com emissão de fluorescência, ou cruzar para um estado triplete excitado (³S^*) por inversão espontânea do spin do elétron excitado. Uma vez formado o ³S^*, esta espécie pode participar em várias reações: pode decair ao estado ⁰S com emissão de fosforescência, ou reagir por mecanismos fotoquímicos do tipo I ou II. Na reação do tipo I, o ³S^* pode reagir com um substrato orgânico ou uma segunda molécula fotossensibilizadora, por transferência de elétrons ou hidrogênio. No tipo II, o fotossensibilizador ³S^* pode transferir energia para o oxigênio molecular, gerando ⁰S e ¹O₂. Estes processos podem ocorrer simultaneamente e a importância de cada um depende da molécula alvo, da eficiência da transferência de energia do sensibilizador para o O₂, do solvente e da concentração de O₂^6-8 (Figura 2).

O ¹O₂ pode ainda ser formado na termodecomposição de dioxetanos⁹ ou endoperóxidos de compostos policíclicos aromáticos^10,11, na reação de H₂O₂ com OCl^- ou peroxinitrito (ONOO^-)^12-14 (Figura 3).

A geração de ¹O₂ também tem sido evidenciada em meio biológico por reações que envolvem enzimas como as peroxidases, tais como lactoperoxidase¹⁵, mieloperoxidase^16,17, cloroperoxidase¹⁸ e peroxidase de raiz forte¹⁹. Também foram relatadas evidências da geração de ¹O₂ na fagocitose²⁰, na reação de ozônio (O₃) com biomoléculas²¹ e no processo de lipoperoxidação^22-24 (Figura 3). A formação de ¹O₂ na lipoperoxidação ocorre principalmente por meio do mecanismo discutido por Russell²², no qual radicais peroxila interagem entre si, gerando um tetraóxido intermediário que se decompõe gerando como produtos um álcool, uma cetona e ¹O₂.

Alvos biológicos do ¹O₂

O ¹O₂ pode interagir com outras moléculas de duas maneiras: através de reações químicas ou transferindo sua energia de excitação para estas moléculas e retornando ao estado fundamental. O último processo é conhecido como supressão física do ¹O₂ e pode ser realizado por carotenóides, bilirrubina, tocoferóis, fenóis e azida¹.

Algumas reações químicas do ¹O₂ podem ser destacadas: adição a dienos conjugados (cicloadição do tipo Diels-Alder, 2 + 4) geralmente resultando na formação de endoperóxidos²⁵; adição 1,3 a uma dupla ligação, formando "ene" hidroperóxidos²⁶ e, com alcenos substituídos por grupos contendo átomos de nitrogênio ou enxofre, formando 1,2-dioxetanos²⁷ (Figura 3). O ¹O₂ pode ainda reagir com compostos fenólicos para formar hidroperoxidienonas²⁸ e com sulfetos, formando sulfóxidos²⁹. Muitos estudos in vitro têm demonstrado que o ¹O₂ oxida biomoléculas incluindo lipídios, proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos, carboidratos e tióis através dos mecanismos acima citados. Cabe ressaltar, entretanto, que as proteínas estão presentes em altas concentrações nos sistemas biológicos e as cadeias laterais de seus aminoácidos possuem constantes elevadas de desativação total do ¹O₂ (constante total de desativação, k_t, ~10⁷ M^-1s^-1)^30-32, quando comparadas a outras biomoléculas, tais como, lipídios (k_t, ~10⁴ M^-1s^-1)³³ e bases do DNA (k_t, ~10⁴ - 10⁶ M^-1s^-1)³⁴ (Tabela 2). Desta forma, pode-se esperar que as proteínas sejam alvos importantes para o ¹O₂³⁵.

Aminoácidos e peptídeos como alvos para o ¹O₂

A maioria das interações do ¹O₂ com aminoácidos, peptídeos e proteínas ocorre via rotas químicas e não através de supressão física, sendo que ambos os mecanismos concorrem significativamente somente no caso do triptofano³⁶. As constantes para a reação química do ¹O₂ com as cadeias laterais dos aminoácidos livres variam dramaticamente, resultando em um dano seletivo a certos resíduos. Dos aminoácidos comuns, apenas triptofano, histidina, tirosina, metionina, cisteína e cistina reagem significativamente com ¹O₂ em pH fisiológico^31,32 .

Reação com resíduos de triptofano

A reação do ¹O₂ com o triptofano produz um hidroperoxipirroloindol isolável, entretanto, o precursor deste composto ainda não foi identificado³⁷. Postula-se que ele seja um dioxetano formado com a dupla ligação dos carbonos C₂ – C₃ do anel indólico, ou ainda um hidroperóxido no carbono C₃. A decomposição subseqüente destes intermediários via quebra da ligação entre os carbonos C₂–C₃ origina N-formilquinurenina, 3a-hidroperoxipirroloindol e 3a-hidroxipirroloindol. A decomposição do 3a-hidroperoxipirroloindol e do 3a-hidroxipirroloindol também gera N-formilquinurenina^38-40 (Esquema 1). Os produtos finais da oxidação - N-formilquinurenina e quinurenina - têm sido detectados tanto em resíduos livres do aminoácido quanto em resíduos de triptofano de peptídios e proteínas³⁵. Cabe ressaltar que a oxidação do triptofano em dipeptídios leva preferencialmente à formação do hidroperoxipirroloindol e seu álcool correspondente e, em menores quantidades, quinurenina⁴¹.

Reação com resíduos de tirosina

Com o aminoácido livre, demonstrou-se a formação de 3a-hidroxi-6-oxo-2,3,3a,6,7,7a-hexaidro-1H-indol-2-ácido carboxilíco (HOHICA) na reação com o ¹O₂. Acredita-se que este produto seja gerado via um intermediário endoperóxido instável, pela cicloadição [4 + 2] do ¹O₂. A subseqüente abertura do anel forma um hidroperóxido no carbono C₁, o qual via uma reação do tipo de Michael sofre ciclização, resultando em um peróxido cíclico. Tem sido proposto que a decomposição do endoperóxido também gera 3,4-diidroxifenilalanina (DOPA)^42-44 (Esquema 2).

A reação do ¹O₂ com resíduos de tirosina em peptídeos gera como produto principal um hidroperóxido no carbono C₁, que, em baixas temperaturas, decai lentamente para seu álcool correspondente. A 37 ºC e, particularmente, na presença de luz UV ou íons metálicos este hidroperóxido pode dar origem a oxi-radicais, que podem promover danos a outros alvos biológicos⁴⁴.

Reação com resíduos de histidina

A oxidação de histidina livre pelo ¹O₂ parece envolver a formação inicial de um ou mais endoperóxidos instáveis, através da 1,4 cicloadição do ¹O₂ aos carbonos 2,4 e/ou 2,5 do anel imidazólico. Recentemente, evidências desta formação foram obtidas quando endoperóxidos de derivados imidazólicos foram identificados em temperaturas extremamente baixas⁴⁵. Estes endoperóxidos sofrem rearranjo para um hidroperóxido. A decomposição deste hidroperóxido intermediário a um derivado carbonilado é seguida pela adição de uma molécula de água, produzindo uma imidazolona hidroxilada⁴⁶. Os produtos finais desta oxidação incluem derivados do ácido aspártico, asparagina, uréia e outros produtos ainda não identificados⁴⁷ (Esquema 3).

Reação com resíduos de metionina

A fotooxidação de resíduos de metionina é dependente do pH: em pH < 6, propõe-se que a oxidação ocorre via formação de uma espécie zwitterionica, que reage com uma segunda molécula de metionina resultando em duas moléculas de sulfóxido; com o aumento do pH, outras reações podem concorrer: em pH > 9 íons hidróxido podem levar a uma substituição no átomo de enxofre da espécie zwitterionica, resultando em um mol de peróxido de hidrogênio para cada mol de sulfóxido formado. Além dessas reações, quando 7 < pH < 12 também pode ser formado um intermediário cíclico estável, chamado deidrometionina, e um mol de peróxido de hidrogênio^8,29,48.

Reação com resíduos de cisteína

Resíduos de cisteína livres reagem rapidamente com o ¹O₂, produzindo o dissulfeto correspondente, de um modo não quantitativo. Além disso, oxiácidos como o ácido cistéico também podem ser formados em algumas condições. Outros produtos precisam ainda ser identificados. Em proteínas, espera-se que a razão entre a formação de dissulfeto e oxiácidos varie dependendo da estrutura da proteína, devido às barreiras estérica e eletrônica na formação do dímero^8,29,37.

Oxidação de proteínas pelo ¹O₂

Existem poucos trabalhos que estudam a oxidação de proteínas por ¹O_2. Um destes trabalhos envolveu as ligações cruzadas de colágeno, existentes naturalmente na pele. Neste estudo, foi demonstrado que o ¹O₂ oxida seletivamente os resíduos de histidina deste agregado protéico, podendo levar à destruição do mesmo, com formação de novas ligações cruzadas aberrantes e perturbação da função do colágeno na derme⁴⁶. Em outro estudo, foi demonstrado que o ¹O₂ pode reagir com proteínas do cristalino do olho, resultando em modificação estrutural que pode ser importante no desenvolvimento de catarata⁴⁹. Da mesma forma, peróxidos protéicos têm sido detectados em células expostas ao ¹O₂ gerado por fotossensibilização. Pesquisas evidenciaram que estes peróxidos têm remoção reduzida por enzimas celulares, tais como, catalase, peroxidase de raiz forte e Cu/Zn superóxido dismutase, sendo que apenas tióis e ácido ascórbico são efetivos em removê-los⁵⁰. Estes peróxidos protéicos podem reagir com outras biomoléculas, gerando um dano adicional. Por exemplo, já foi demonstrado que peróxidos protéicos foram capazes de causar a inibição de enzimas^51,52 e induzir danos ao DNA⁵³.

Propagação do dano e conseqüências biológicas da oxidação de proteínas

Os hidroperóxidos de proteínas gerados a partir do ¹O₂ podem sofrer decomposição térmica ou catalisada por íons metálicos, gerando radicais peroxila⁵⁴ (Equação 4)

Os hidroperóxidos de proteínas também podem sofrer redução por um elétron, gerando radicais alcoxila (reação de Fenton)⁵⁴ (Equação 5)

Deste modo, a formação de peróxidos em uma proteína a partir do ¹O₂ pode resultar em danos subseqüentes a outras proteínas. Estes danos incluem inativação enzimática, como a que foi demonstrada quando caspases, cisteíno-proteases que desempenham um papel central na apoptose, foram expostas a hidroperóxidos de triptofano e tirosina⁵⁵. Outro exemplo de inativação enzimática é o da enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Peróxidos de proteínas demonstraram reagir com o grupo tiol do sítio ativo desta enzima, inativando-a⁵¹. Por sua vez, a oxidação da lisozima pelo ¹O₂ gerado por fotossensibilização causou a inativação parcial desta enzima⁵².

A remoção de H₂O₂ das células pela catalase é de vital importância, já que este peróxido pode dar origem a espécies mais reativas, tais como ¹O₂ e radical hidroxila (^•OH). Vários estudos mostraram que a oxidação da catalase pelo ¹O₂ gera espécies enzimáticas com pontos isoelétricos mais ácidos^56-58. Esta oxidação foi detectada inclusive em um estudo com a catalase em cultura de células humanas⁵⁹. A modificação parece ocorrer no grupo heme da enzima. A presença deste grupo heme modificado foi sugerida como indicadora da geração de ¹O₂in vivo. Contrastando com as modificações causadas ao grupo heme da catalase, verificou-se que o ¹O₂ promove a oxidação de resíduos de metionina e tirosina do citocromo c. O citocromo c é uma hemeproteína mitocondrial fundamental no processo respiratório. Esta hemeproteína também é envolvida na cascata apoptótica, pois a liberação do citocromo c da mitocôndria para o citosol promove a ativação das caspases, desencadeando a apoptose celular. Contudo, os efeitos desta oxidação na apoptose celular ainda precisam ser detalhados⁶⁰.

Outra conseqüência da produção de peróxidos derivados de proteínas é a formação de ligações cruzadas e agregados protéicos, que podem resultar de reações secundárias independentes da produção contínua de ¹O₂. Dentro deste contexto, cabe ressaltar a importância da formação de derivados oxidados do triptofano, em especial N-formilquinurenina e quinurenina. É bem conhecido que o acúmulo gradual de quinureninas nos tecidos humanos pode resultar em um aumento do dano por fotossensibilização, já que estes compostos são agentes fotossensibilizantes eficientes. Este ponto é particularmente significante em órgãos humanos expostos à radiação solar⁴¹. Como exemplo, pode-se citar o cristalino do olho humano, que desempenha um papel fundamental na visão. O cristalino contém compostos de baixo peso molecular (formados principalmente de quinureninas) que atuam como filtros intra-oculares, absorvendo a luz UV na região situada entre 300 – 400 nm, e prevenindo o dano induzido à retina por esta luz. Muitos pesquisadores têm investigado a possibilidade de estes filtros modificarem covalentemente o cristalino. Em pessoas jovens, as moléculas de filtros UV existem primariamente na forma livre. Entretanto, com o passar do tempo, o nível de quinureninas ligadas covalentemente às proteínas do cristalino do olho aumenta exponencialmente⁶¹. Parker e colaboradores⁶² demonstraram que a fotoexposição de agregados quinurenina-proteína pode iniciar um dano oxidativo mediado pelo ¹O₂ às proteínas do cristalino do olho. Esta foto-oxidação resulta em formação de H₂O₂ e outros peróxidos protéicos. Também foi evidenciada a formação de produtos de oxidação de tirosina, tais como DOPA e ditirosina, neste processo. Não é claro o mecanismo pelo qual estes produtos são formados, contudo, é possível que estas reações ocorram via decomposição dos peróxidos iniciais a espécies reativas que, posteriormente, oxidariam resíduos de tirosina.

Oxidantes em geral produzem modificações em proteínas levando à perda de função e aumentando a taxa de degradação destas proteínas oxidadas. A via do proteossomo ubiquitina-26S é o principal mecanismo pelo qual células eucarióticas marcam proteínas para degradação⁶³. Uma oxidação moderada das proteínas aumenta sua suscetibilidade à proteólise e as torna substrato para o proteossomo. Contudo, proteínas severamente oxidadas parecem ser substratos de difícil ubiquitinação, primeiro agregando-se e então formando ligações cruzadas que as tornam altamente resistentes à proteólise. A incapacidade de degradar proteínas extensivamente oxidadas pode contribuir para o acúmulo de agregados protéicos que ocorre em algumas doenças e durante o processo de envelhecimento⁶⁴.

Uma importante conseqüência biológica da oxidação de proteínas é a oxidação posterior do DNA pelos peróxidos formados. Peróxidos de triptofano e tirosina gerados por fotossensibilização com um agente intercalante de DNA são capazes de clivá-lo em experimentos realizados com plasmídio⁶⁵. A oxidação do DNA também já foi demonstrada com peróxidos de histonas gerados por radiação gama. Desta forma, a geração inicial de peróxidos nas proteínas nucleares, tais como as histonas, pode promover um dano subseqüente ao DNA, incluindo ligações cruzadas DNA-proteína e mutações⁵³.

Estratégias para análise e detecção do ¹O₂ e de moléculas por ele oxidadas

Para avaliar possíveis danos a biomoléculas, causados pelo ¹O₂ e por moléculas por ele oxidadas, faz-se necessária à utilização de ferramentas analíticas, tais como seqüestradores químicos do ¹O₂, termólise de endoperóxidos como fonte de ¹O₂ e marcação isotópica de produtos. Seqüestradores químicos de ¹O₂ são moléculas que reagem com o ¹O₂ gerado e o produto pode então ser identificado. Por ex., pode-se utilizar a reação de ¹O₂ com o 9,10-difenilantraceno (DPA)⁶⁶ ou com derivados de antraceno solúveis em água, como o 9,10-dietilantraceno disulfonato (EAS)^11,67 (Esquema 5). Ambas as reações formam endoperóxidos estáveis, que podem ser detectados por HPLC ou outras técnicas. A termólise de endoperóxidos é outro exemplo importante, desenvolvido com o objetivo de se obter "fontes limpas" de ¹O_2, compatíveis com as condições presentes em meios biológicos (meio aquoso, pH neutro, temperaturas moderadas). Merece destaque a decomposição térmica de endoperóxidos hidrossolúveis de derivados de naftaleno, a qual não gera subprodutos, não necessita de condições drásticas de trabalho e produz ¹O₂ em uma velocidade e quantidade conhecidas⁶⁸. Exemplos destes endoperóxidos incluem o endoperóxido do 3,3'-(1,4-naftilideno)dipropanoato de sódio (NDPO₂) e o endoperóxido da N,N'-di(2,3-diidroxipropil)-3,3'-(1,4-naftilideno)dipropanamida (DHPNO₂)^67,69 (Esquema 6). A utilização do isótopo [¹⁸O] do oxigênio também é de particular interesse, já que desta forma é possível demonstrar como o ¹O₂ ou seus produtos de oxidação podem reagir com alvos biológicos. Os produtos de oxidação que contêm o oxigênio marcado podem ser detectados usando-se métodos adequados, tais como HPLC acoplado à espectrometria de massas.

Recentemente, a marcação isotópica de hidroperóxidos de lipídios com [¹⁸O] foi utilizada a fim de esclarecer o mecanismo da geração de ¹O₂ a partir destes hidroperóxidos. Neste mesmo trabalho, utilizou-se o DPA para seqüestrar o [¹⁸(¹O₂)] gerado. O DPA¹⁸O¹⁸O detectado por HPLC acoplado ao espectrômetro de massas constituiu uma prova inequívoca da geração de ¹O₂ a partir de hidroperóxidos de lipídios^24,70,71. De modo similar, o endoperóxido DHPNO₂ marcado com [¹⁸O] ⁷² foi utilizado para evidenciar que o ¹O₂, quando liberado em células, é capaz de oxidar diretamente o DNA celular. A reação foi demonstrada através da detecção de 8-oxo-7,8-diidro-2'-deoxiguanosina, um produto de oxidação do DNA, isotopicamente marcado com [¹⁸O] por HPLC acoplado ao espectrômetro de massas⁷³.

Contrastando com pesquisas envolvendo lipídios e DNA, existem poucos estudos descrevendo as interações de ¹O₂ com proteínas e as conseqüências biológicas destas interações. As interações de hidroperóxidos de proteínas previamente formados pela reação com ¹O₂ e alvos biológicos também precisam ser esclarecidas. As estratégias de análise e detecção de produtos estáveis, tais como as acima descritas para lipídios e DNA, podem ser de grande utilidade na elucidação do destino celular de proteínas oxidadas.

O estudo do papel dos produtos de oxidação de proteínas pelo ¹O₂ e outros oxidantes em sistemas biológicos pode levar a respostas importantes sobre as implicações destas espécies nos processos celulares, uma vez que já começam a surgir evidências da participação destas espécies na indução de dano ao DNA e nos processos de sinalização celular.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Programa de Apoio aos Núcleos de Excelência (PRONEX/FINEP). P. D. Mascio e G. E. Ronsein são bolsistas da John Simon Guggenheim Memorial Foundation e da FAPESP, respectivamente.

25. Bloodworth, A.; Eggelte, H. Em ref. 8, vol. II, p. 93.

27. Baumstark, A.. Em ref. 8, vol. II, p. 1.

29. Ando, W.; Takata, T.. Em ref. 8, vol. III, p. 1.

32. Monroe, B.. Em ref. 8, vol. I, p. 177.

Recebido em 4/4/05; aceito em 26/7/05; publicado na web em 16/2/06

• 1. Hallliwell, B.; Gutteridge, J. M. C.; Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford, 1999.
• 2. Khan, A.; Kasha, M.; J. Chem. Phys. 1963, 39, 2105.
• 3. Boveris, A.; Cadenas, E.; Chance, B.; Fed. Proc. 1981, 40, 195.
• 4. Browne, R.; Ogryzlo, E.; P. Chem. Soc. London 1964, 117.
• 5. Khan, A.; J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 6516.
• 6. Foote, C. S.; Science 1968, 162, 963.
• 7. Foote, C. S.; Photochem. Photobiol. 1991, 54, 659.
• 8. Straight, R. C.; Spikes, J. D. Em Singlet O₂; Frimer, A. A., ed.; CRC Press: Boca Raton, 1985, vol. IV, p. 91.
• 9. Briviba, K.; Saha-Moller, C.; Adam, W.; Sies, H.; Biochem. Mol. Biol. Int. 1996, 38, 647.
• 10. Aubry, J. M. Em Membrane Lipid Oxidation; Vigo-Pelfrey, C., ed.; CRC Press, 1991, vol. II, p. 65.
• 11. Di Mascio, P.; Sies, H.; J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 2909.
• 12. Di Mascio, P.; Bechara, E.; Medeiros, M.; Briviba, K.; Sies, H.; FEBS Lett. 1994, 355, 287.
• 13. Martinez, G. R.; Di Mascio, P.; Bonini, M. G.; Augusto, O.; Briviba, K.; Sies, H.; Maurer, P.; Rothlisberger, U.; Herold, S.; Koppenol, W. H.; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97, 10307.
• 14. Held, A. M.; Halko, D. J.; Hurst, J. K.; J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 5732.
• 15. Kanofsky, J.; J. Biol. Chem. 1983, 258, 5991.
• 16. Kanofsky, J.; Wright, J.; Tauber, A.; FEBS Lett. 1985, 187, 299.
• 17. Kanofsky, J.; Wright, J.; Miles-Richardson, G.; Tauber, A.; J. Clin. Invest. 1984, 74, 1489.
• 18. Kanofsky, J.; J. Biol. Chem. 1984, 259, 5596.
• 19. Kanofsky, J.; J. Biol. Chem. 1988, 263, 14171.
• 20. Steinbeck, M.; Khan, A.; Karnovsky, M.; J. Biol. Chem. 1992, 267, 13425.
• 21. Kanofsky, J.; Sima, P.; J. Biol. Chem. 1991, 266, 9039.
• 22. Russell, G. A.; J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 3871.
• 23. Howard, J.; Ingold, K.; J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 1057.
• 24. Miyamoto, S.; Martinez, G.; Medeiros, M.; Di Mascio, P.; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 6172.
• 26. Foote, C. S.; Denny, R. W.; J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 5162.
• 28. Foote, C. S.; Thomas, M.; Ching, T.-Y.; J. Photochem. 1976, 5, 172.
• 30. Michaeli, A.; Feitelson, J.; Photochem. Photobiol. 1994, 59, 284.
• 31. Wilkinson, F.; Helman, W. P.; Ross, A. B.; J. Phys. Chem. Ref. Data 1995, 24, 663.
• 33. Vever-Bizet, C.; Dellinger, M.; Brault, D.; Rougee, M.; Bensasson, R.; Photochem. Photobiol. 1989, 50, 321.
• 34. Prat, F.; Hou, C.-C.; Foote, C. S.; J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 5051.
• 35. Davies, M.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, 761.
• 36. Matheson, I.; Etheridge, R.; Kratowich, N.; Lee, J.; Photochem. Photobiol. 1975, 21, 165.
• 37. Davies, M.; Photochem. Photobiol. Sci. 2004, 3, 17.
• 38. Nakagawa, M.; Yoshikawa, K.; Hino, T.; J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 6496.
• 39. Nakagawa, M.; Watanabe, H.; Kodato, S.; Okajima, H.; Hino, T.; Flippen, J. L.; Witkop, B.; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977, 74, 4730.
• 40. Langlois, R.; Ali, H.; Brasseur, N.; Wagner, J.; van Lier, J.; Photochem. Photobiol. 1986, 44, 117.
• 41. Posadaz, A.; Biasutti, A.; Casale, C.; Sanz, J.; Amat-Guerri, F.; Garcia, N.; Photochem. Photobiol. 2004, 80, 132.
• 42. Jin, F.; Leitich, J.; von Sonntag, C.; J. Photochem. Photobiol., A 1995, 92, 147.
• 43. Criado, S.; Soltermann, A. T.; Marioli, J. M.; Garcia, N. A.; Photochem. Photobiol. 1998, 68, 453.
• 44. Wright, A.; Bubb, W. A.; Hawkins, C. L.; Davies, M. J.; Photochem. Photobiol. 2002, 76, 35.
• 45. Kang, P.; Foote, C. S.; Tetrahedron Lett. 2000, 41, 9623.
• 46. Au, V.; Madison, S.; Arch. Biochem. Biophys. 2000, 384, 133.
• 47. Tomita, M.; Irie, M.; Ukita, T.; Biochemistry 1969, 8, 5149.
• 48. Sysak, P.; Foote, C.; Ching, T.-Y.; Photochem. Photobiol. 1977, 26, 19.
• 49. Balasubramanian, D.; Du, X.; Zigler, J. S.; Photochem. Photobiol. 1990, 52, 761.
• 50. Morgan, P. E.; Dean, R. T.; Davies, M. J.; Free Radical Biol. Med. 2004, 36, 484.
• 51. Morgan, P. E.; Dean, R. T.; Davies, M. J.; Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1916.
• 52. Silva, E.; De Landea, C.; Edwards, A.; Lissi, E.; J. Photochem. Photobiol., B 2000, 55, 196.
• 53. Luxford, C.; Morin, B.; Dean, R.; Davies, M.; Biochem. J. 1999, 344, 125.
• 54. Hawkins, C. L.; Davies, M. J.; Biochim. Biophys. Acta 2001, 1504, 196.
• 55. Hampton, M.; Morgan, P.; Davies, M. J.; FEBS Lett. 2002, 527, 289.
• 56. Lledias, F.; Rangel, P.; Hansberg, W.; J. Biol. Chem. 1998, 273, 10630.
• 57. Diaz, A.; Horjales, E.; Rudino-Pinera, E.; Arreola, R.; Hansberg, W.; J. Mol. Biol. 2004, 342, 971.
• 58. Lledias, F.; Rangel, P.; Hansberg, W.; Free Radical Biol. Med. 1999, 26, 1396.
• 59. Lledias, F.; Hansberg, W.; Photochem. Photobiol. 1999, 70, 887.
• 60. Estevam, M. L.; Nascimento, O. R.; Baptista, M. S.; Di Mascio, P.; Prado, F. M.; Faljoni-Alario, A.; Zucchi, M. d. R.; Nantes, I. L.; J. Biol. Chem. 2004, 279, 39214.
• 61. Vazquez, S.; Aquilina, J. A.; Jamie, J. F.; Sheil, M. M.; Truscott, R. J. W.; J. Biol. Chem. 2002, 277, 4867.
• 62. Parker, N. R.; Jamie, J. F.; Davies, M. J.; Truscott, R. J. W.; Free Radical Biol. Med. 2004, 37, 1479.
• 63. Robinson, P. A.; Ardley, H. C.; J. Cell Sci. 2004, 117, 5191.
• 64. Grune, T.; Merker, K.; Sandig, G.; Davies, K. J. A.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, 709.
• 65. Mahon, K.; Ortiz-Meoz, R.; Prestwich, E.; Kelley, S.; Chem. Commun. 2003, 15, 1956.
• 66. Turro, N. J.; Chow, M. F.; J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7218.
• 67. Pierlot, C.; Aubry, J.; Briviba, K.; Sies, H.; Di Mascio, P.; Methods Enzymol. 2000, 319, 3.
• 68. Martinez, G. R.; Medeiros, M. H. G.; Di Mascio, P.; Quim. Nova 2000, 23, 686.
• 69. Pierlot, C.; Hajjam, S.; Bathelemy, C.; Aubry, J.-M.; J. Photochem. Photobiol., B 1996, 36, 31.
• 70. Miyamoto, S.; Martinez, G.; Martins, A.; Medeiros, M.; Di Mascio, P.; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4510.
• 71. Miyamoto, S.; Martinez, G.; Martins, A.; Medeiros, M.; Di Mascio, P.; Biofactors 2004, 22, 333.
• 72. Martinez, G. R.; Ravanat, J.-L.; Medeiros, M. H. G.; Cadet, J.; Di Mascio, P.; J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 10212.
• 73. Ravanat, J.-L.; Di Mascio, P.; Martinez, G. R.; Medeiros, M. H. G.; Cadet, J.; J. Biol. Chem. 2000, 275, 40601.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Maio 2006
• Data do Fascículo
  Jun 2006

Histórico

• Aceito
  26 Jul 2005
• Recebido
  04 Abr 2005