Metodologia analítica para determinação de folatos e ácido fólico em alimentos

Analytical methodology for the determination of folates and folic acid in foods

HPLC; methodology; folates; food

ARTIGO

Metodologia analítica para determinação de folatos e ácido fólico em alimentos

Analytical methodology for the determination of folates and folic acid in foods

Rodrigo Ramos Catharino^I; Helena Teixeira Godoy^I; Juliana Azevedo Lima-Pallone^{*, II}

^IDepartamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, CP 6121, 13083-970 Campinas - SP, Brasil

^IICentro de Ciências Exatas, Ambientais e de Tecnologias, Faculdade de Química, Pontifícia Universidade Católica de Campinas, Rod. D. Pedro I, km 136, 13086-900 Campinas - SP, Brasil

ABSTRACT

The aim of this work was to develop and to validate a methodology using HPLC for the simultaneous determination of folates and folic acid in foods. The limits of detection and the recovery rates for the vitamins in the certified reference materials were respectively 5 pg/mL and 94-108% for 5-MTHF, 7 pg/mL and 97-102% for THF, 30 pg/mL and 97.9-104% for 5-FTHF, 30 pg/mL and 95-107 for 10-FFA, 5 ng/mL and 97-102% for FA and 5 ng/mL and 98-103% for 10-MFA. Repeatability showed a coefficient of variation below 3.9% for all the vitamins. The proposed methodology was shown to be efficient when applied to different certified reference materials, namely pig's liver (BCR487), powdered milk (BCR421) and a vegetable mixture (BCR485).

Keywords: HPLC methodology; folates; food.

INTRODUÇÃO

Os folatos fazem parte das vitaminas do grupo B e são importantes para processos bioquímicos, como síntese e reparo de DNA. A deficiência de folatos, que devem ser obtidos através da dieta, está associada à anemia megaloblástica, malformações congênitas, doença de Alzheimer, síndrome de Down, desordens cerebrais, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer¹.

A análise de vitaminas em alimentos envolve alguns desafios em decorrência da baixa concentração em que se encontram, da presença de inúmeros interferentes, da complexidade da matriz e da exigência de cuidados especiais devido à baixa estabilidade desses nutrientes. Os maiores desafios para determinação de vitaminas em alimentos incluem, além do melhoramento dos processos de extração e limpeza, o desenvolvimento e a validação de métodos simultâneos que reduziriam, sensivelmente, o tempo gasto para a análise e os custos, ainda possibilitando menor geração de resíduos^2-4.

A literatura vem apresentando avanços nos métodos para a determinação de folatos, através de técnicas como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)^5-15, em função de sua rapidez, alta sensibilidade, precisão e exatidão^2,16. Pesquisas com CLAE têm sido realizadas para determinação simultânea de folatos, em preparações farmacêuticas multivitamínicas e em alimentos^17-19. Entretanto, a maior parte das determinações de folatos em alimentos envolve a utilização de enzimas (conjugases) no processo de extração, o que dificulta muito a aplicação do método e aumenta o tempo de análise, além de promover a perda de folatos^5-10.

Outro fator importante para o conhecimento do potencial nutricional dos alimentos e a garantia do sucesso no desenvolvimento de novos produtos é a qualidade dos dados analíticos. Planejamentos e análises estatísticas variadas, programas de comparação de métodos analíticos e emprego de materiais de referência são as ferramentas utilizadas hoje pelos pesquisadores no controle de qualidade analítica para determinação de folatos^10,20,21.

Dentro desse panorama, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a validação de metodologia, utilizando a técnica de CLAE, para a determinação simultânea de seis formas naturalmente e mais comumente presentes de folatos em alimentos, além da forma sintética, ácido fólico, comumente adicionada a alimentos enriquecidos.

PARTE EXPERIMENTAL

Amostras

Três diferentes materiais de referência certificados, fígado de porco (BCR487), leite em pó (BCR421) e misturas de vegetais (BCR485), foram adquiridos do Instituto de Material de Referência e Padrões - Bélgica. Cada material foi totalmente homogeneizado antes da análise. Após a homogeneização, porções de 1,0 g foram tomadas para análise. Todas as determinações foram realizadas em duplicatas, sendo cada uma delas utilizada para 3 diferentes injeções.

Reagentes

Os padrões de folatos, 5-metil-5,6,7,8-tetraidrofolato de cálcio (5-MTHF), tetraidrofolato (THF), 5-formil-5,6,7,8-tetraidrofolato de cálcio (5-FTHF), 10-formil-ácido-fólico (10-FAF), 10-metil-ácido-fólico (10-MAF), foram adquiridos do laboratório Schircks - Suíça, e o ácido fólico (F-7876) foi adquirido da Sigma (USA). A acetonitrila, grau cromatográfico, o ácido acético e o ácido tricloroacético, bem como acetato de amônio, todos com grau de pureza analítico, foram adquiridos da Merck, Brasil. A água utilizada no preparo da fase móvel foi purificada no sistema Milli-Q (Millipore). A fase móvel foi filtrada em filtros Millipore, com poros de 0,45 µm de diâmetro.

Equipamento

Foi utilizado um cromatógrafo a líquido HP (Helwett Packard) série 1100, com degaseificador, bomba quaternária, injetor automático com capacidade de 1 a 100 µL e detectores de arranjo de diodos (DAD) (UV-Visível) e de fluorescência dispostos em série. Ambos permitem a detecção simultânea em vários comprimentos de onda. Todo o sistema foi controlado pelo programa Chemstation-HP, que também gerencia o sistema de aquisição e tratamento de dados.

Para separação das diferentes formas de folatos foi utilizada uma coluna cromatográfica Microsorb ODS-2, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm d.i. (Raimin, USA) protegida por uma coluna de guarda Bondesil C₁₈, 5 µm, 10 x 4,6 mm d.i. (Varian).

Determinação de folatos e ácido fólico

Para a extração foi tomado 1,0 g de material de referência certificado (CRM) previamente homogeneizado, que foi triturado com 9,0 mL de solução de acetato de amônio (0,05 mol/L) em homogeneizador e colocado em banho ultra-sônico por 10 min. A solução foi transferida quantitativamente para um balão volumétrico de 10 mL. Para a purificação do extrato, adicionou-se 500 µL de ácido tricloroacético (TCA) e completou-se o volume com solução de acetato de amônio. Após homogeneização, a amostra foi filtrada, primeiro em papel de filtro comum e depois em membrana Durapore (HVLP 01300 Millipore), com poros de 0,45 µm, e o extrato injetado no cromatógrafo (100 µL).

A separação dos folatos foi feita através de um sistema de eluição por gradiente, com vazão de 0,5 mL/min, desenvolvido com 100% de solução acidificada (2% de ácido acético; pH ajustado para 2,8 com hidróxido de potássio) no início, chegando em 25 min a 76% de solução acidificada e 24% de acetonitrila (v/v), mantendo-se essas condições até o final da corrida em 31 min. As condições iniciais foram retomadas e a coluna re-equilibrada por 15 min, antes da próxima injeção. Quatro formas de folatos foram detectadas utilizando-se a fluorescência natural desses compostos (l_exc. 290 nm e l_emis 360 nm para 5-MTHF, 5-FTHF e THF e l_exc 360 nm e l_emis 445 nm para 10FAF). O 10-MAF e o AF foram detectados na região do ultravioleta, a 290 nm.

A identificação dos folatos foi feita por comparação entre os tempos de retenção, obtidos com os padrões analisados nas mesmas condições, por co-cromatografia e pelos espectros obtidos com a utilização do detector de arranjo de diodos e fluorescência. O grau de pureza dos picos foi avaliado pelo sistema disponível no software Chemstation-HP. A quantificação foi realizada por padronização externa e construiu-se a curva analítica com 5 níveis de concentração, sendo cada ponto representado pela média de três determinações. As concentrações foram de 0,01 a 100 ng/mL para 5-MTHF e THF; de 0,06 a 120,0 ng/mL para 5-FTHF; de 0,06 a 60,0 ng/mL para 10-FAF e de 10 a 1000 ng/mL para AF e 10-MAF.

Validação do método

Limites de detecção e quantificação

A avaliação do limite de detecção (LD) foi feita por diluições sucessivas dos padrões de 5-MTHF, THF, 5-FTHF, 10-FAF e, posteriormente, por diluição da matriz, de forma a se confirmar o limite de detecção do método. Já para AF e 10-MAF foi realizada a adição de padrão às matrizes isentas dessas formas da vitamina, seguida da determinação da menor quantidade detectável, como sendo três vezes o valor da amplitude do ruído do equipamento (S/R>3) ²¹. O limite de quantificação foi considerado como sendo 10 vezes o LD²².

Testes de recuperação

Para avaliação da exatidão do método foram realizados testes de recuperação de padrões adicionados à matriz, em dois diferentes níveis de concentração. Para 5-MTHF e THF os níveis foram de 0,85 e 8,5 µg/100 g, para 5-FTHF e 10-FAF de 0,65 e 6,5 µg/100 g, e para AF e 10-MAF de 50 e 100 µg/100 g. A recuperação foi calculada segundo Jastrebova et al.¹¹ e Iwatani et al.¹⁵,

onde R - representa o valor de recuperação encontrado; C_encontrado - concentração total da amostra já adiconada de padrões; C_amostra - concentração de folatos encontrada na amostra sem adição de padrões e, C_adicionado - concentração adicionada de padrões.

Repetibilidade

Esse parâmetro foi avaliado segundo o método proposto por Caulcutt e Boddy²¹. Foram feitas cinco determinações, em duplicatas, do 5-MTHF, THF, 5-FTHF, 10-FAF, 10-MAF e AF, em soluções padrões e em amostras de 3 diferentes materiais de referência certificados, avaliado segundo a Equação

onde r = repetibilidade, com significância de 95%; sr = estimativa do desvio padrão e, t = t de Student

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 1 apresenta os cromatogramas referentes à separação simultânea das diferentes formas de folatos em solução padrão e nos materiais de referência certificados avaliados. O emprego da coluna C₁₈ e a utilização do sistema de eluição por gradiente possibilitaram a eluição do THF pico nº 1, 5-MTHF pico nº 2, 10-FAF pico nº 3, 5-FTHF pico nº 4, AF pico nº 5 e 10-MAF pico nº 6 em 19,12; 20,50; 21,52; 22,5; 26,14 e 27,72 min, respectivamente, com um tempo de análise total de 31 min. Em função da utilização do sistema de eluição por gradiente, o tempo de re-equilíbrio da coluna foi fixado em 15 min após o final da corrida e foi fundamental para reprodutibilidade e repetibilidade do método. Observa-se a versatilidade da metodologia quando aplicada à separação das diferentes formas de folatos, nos tipos de alimentos avaliados (leite, fígado de porco e mistura de vegetais).

As curvas analíticas traçadas por padronização externa apresentaram boa linearidade nas faixas de concentração pré-estabelecidas, de 0,01 a 100 ng/mL para 5MTHF e THF; de 0,06 a 120,0ng/mL para 5FTHF; de 0,06 a 60,0 ng/mL para 10FAF; de 10 a 1000ng/mL para AF e 10MAF. Os coeficientes de correlação obtidos foram de 0,9878 e 0,9998 para o THF e o 5MTHF, e para os demais folatos o valor foi igual a 1,0000.

Os teores de folatos determinados nas amostras do material de referência certificado analisadas estão apresentados na Tabela 1. O AF foi a forma predominante no leite em pó, enquanto que nas demais amostras, a predominância foi de 5-MTHF. O 10-MAF não foi detectado em nenhuma das amostras analisadas.

O teor de folatos totais obtidos no presente trabalho para o leite em pó (BCR421) de 102,9 µg/100 g é similar ao teor encontrado por Konings¹⁰ (107 µg/100 g), que também utilizou o mesmo tipo de material de referência certificado. Entretanto, o valor está abaixo da faixa esperada para o material de referência, que era de 142 ± 14 µg/100 g. Para o fígado de porco (BCR487) o valor encontrado por Konings¹⁰ foi de 1750 µg/100 g, enquanto que neste trabalho foi de 1633 µg/100 g. Ambos estão acima do estipulado no material de referência certificado (1340 ± 140 µg/100 g). Já para a mistura de vegetais (BCR485) o valor encontrado no trabalho foi de 295 µg/100 g para folatos totais e foi superior ao encontrado no trabalho de Konings¹⁰ (195 µg/100 g), porém, se apresentou dentro da faixa esperada para o material de referência certificado, que é de 315 ± 28 µg/100 g. Portanto, os resultados obtidos com a metodologia desenvolvida estão muito próximos aos encontrados por Konings¹⁰, no entanto, diferem dos valores apresentados para os materiais de referência certificados, exceto para a mistura de vegetais, onde os dados foram concordantes. Cabe salientar que os teores de folatos totais nos materiais de referência foram estabelecidos utilizando-se o método microbiológico.

Os limites de detecção obtidos neste trabalho foram de 5 pg/mL para 5-MTHF, 7 pg/mL para THF, 30 pg/mL para 5-FTHF e 10-FAF, e 5 ng/mL para AF e 10-MAF (Tabela 2). Jastrebova et al.¹¹ determinaram limites de detecção para THF, 5-MTHF e 5-FTHF, que foram superiores aos determinados para esses mesmos folatos. Chladek et al.¹³ e Ndaw et al.¹⁴ detectaram, apenas, 5-MTHF e os limites de detecção foram superiores aos obtidos no presente estudo. Na maioria dos trabalhos encontrados na literatura^5-7,10,12, onde foram determinados os limites de detecção para os folatos, com exceção do ácido fólico, os valores foram sempre superiores. Vahteristo et al.⁸ foram os únicos a encontrar para 5-MTHF e THF limites de detecção inferiores aos estabelecidos nesse trabalho (Tabela 2). O limite de quantificação foi considerado, neste estudo, como dez vezes o limite de detecção, ficando para 5-MTHF 0,05 ng/mL, para THF 0,07 ng/mL, para 5-FTHF e 10-FAF 0,3 ng/mL e para AF e 10-MAF de 50 ng/mL.

As taxas de recuperação, nos três diferentes produtos, em dois níveis de adição, para cada forma de folato, estão apresentadas na Tabela 3. Os valores das taxas de recuperação, nos três materiais certificados, para os dois níveis de enriquecimento, variaram para 5-MTHF de 94-108%; para THF de 96-102%, para 5-FTHF de 97-104%; para 10-FTHF de 95-104%; para AF de 97-102% e para 10-MTHF de 98-103%. As taxas de recuperação determinadas foram superiores às relatadas por Vahteristo et al.⁹. Esses autores encontraram para 5-MTHF uma taxa de recuperação de 88% em leite em pó, 76% em carne bovina, 96% em fígado de porco liofilizado e 67% em gema de ovo. Para THF, os mesmos autores relatam níveis de recuperação de 64% em carne bovina e 61% em gema de ovo. O 10-MAF e 10-FAF tiveram recuperações ainda menores no trabalho de Vathteristo et al.⁹, com níveis de 90% para 5-FTHF e 70% para 10-FAF em carne bovina, e em gema de ovo 49% de recuperação para os mesmos folatos, sendo que os níveis de enriquecimento foram de 18 até 42 µg/100 g. Para o ácido fólico, nos quatro produtos analisados por Vahteristo et al.⁹, os valores encontrados para a recuperação variaram de 49 a 77%, com níveis de enriquecimento de 22 e 220 µg/100 g. Konings¹⁰ avaliou os mesmos materiais de referência certificados, embora em um único nível de enriquecimento, e determinou que para a mistura de vegetais, na qual se detectou apenas 5-MTHF, a recuperação foi de 90% em um nível de enriquecimento de 172 µg/100 g, valor este menor que o obtido neste trabalho. No fígado de porco, Konings¹⁰ determinou apenas 5-MTHF e THF e os valores de recuperação, nos respectivos níveis de enriquecimento de 641 e 2161 µg/100 g, foram de 109 e 88%, respectivamente. Mesmo com elevados níveis de enriquecimento, a taxa de recuperação para THF foi menor quando comparada com a apresentada neste estudo. O mesmo ocorreu com a recuperação no leite em pó, que foi mais baixa quando comparada com as taxas obtidas neste trabalho. Konings¹⁰ encontrou em leite em pó apenas 5-MTHF e AF e seus valores de recuperação foram, respectivamente, 85 e 90%, quando adicionados 25,5 do 5-MTHF e 70 µg/100 g de AF.

A repetibildade apresentada pelo método pode ser considerada adequada, pois, as variações existentes entre as medições obtidas no estudo foram menores que os valores do fator "r" calculado, conforme a Tabela 4.

CONCLUSÕES

A simplicidade e a rapidez da preparação de amostra, principalmente pela não utilização da hidrólise enzimática, aliada aos dados obtidos na validação, indicam a eficiência da aplicação da metodologia na determinação simultânea, por CLAE, de folatos e ácido fólico em alimentos.

A metodologia desenvolvida e validada para os materiais de referência certificados pode ser aplicada à análise de folatos em alimentos e, dessa forma, contribuir para a avaliação do teor dessa importante vitamina nas mais diversas matrizes alimentícias.

Recebido em 11/8/05; aceito em 1/2/06; publicado na web em 6/6/06

• 1. Off, M. K.; Steindal, A. E.; Porojnicu, A. C.; Juzeniene, A.; Vorobey, A.; Johnsson, A.; Moan, J.; J. Photochem. Photobiol. 2005, 80, 47.
• 2. Scott, J.; Rébeillé, F.; Fletcher, J.; J. Sci. Food Agric. 2000, 80, 795.
• 3. Ruggeri, S.; Vahteristo, L. T.; Aguzzi, A.; Finglas, P.; Carnovale, E.;. J. Chromatogr., A 1999, 855, 237.
• 4. Stokes, P.; Webb, K.; J. Chromatogr., A 1999, 864, 59.
• 5. Day, B. P.; Gregory, J. F.; J. Agric. Food Chem 1981, 29, 374.
• 6. Duch, D. S.; Bowers, S. W.; Nichol, C. A.; Anal. Biochem 1983, 130, 385.
• 7. Holt, D. L.; Wehling, R. L.; Zeece, M. G.; J. Chromatogr, A 1988, 449, 271.
• 8. Vahteristo, L.; Lehikoinen, K.; Ollilainen, V.; Varo, P.; Food Chem 1997, 59, 589.
• 9. Vahteristo, L.; Ollilainen, V.; Varo, P.; J. Assn. Offic. Anal. Chem. Int. 1997, 80, 373.
• 10. Konings, E. J. M.; J. Assn. Offic. Anal. Chem. Int 1999, 82, 119.
• 11. Jastrebova, J.; Witthöft, C.; Grahn, A.; Svensson, U.; Jagerstad, M.; Food Chem. 2003, 80, 579.
• 12. Doherty, R. F.; Beecher, G. R.; J. Agric. Food Chem 2003, 51, 354.
• 13. Chládek, J.; Sispera, L.; Martínková, J.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2000, 744, 307.
• 14. Ndaw, S.; Bergaentzlé, M.; Aoudé-Werner, D.; Lahély, S.; Hasselmann, C.; J. Chromatogr., A 2001, 928, 77.
• 15. Iwatani, Y.; Arcot, J.; Shrestha, A. K.; J. Food Comp. Anal. 2003, 16, 37.
• 16. Konings, E. J. M.; Roomans, H. H. S.; Dorat, E.; Goldbohm, R. A.;. Saris, W. H. M.; Brandt. P. A.; Am. J. Nutr. 2001, 73, 765.
• 17. Dong, M. W.; Lepore, J.; Taurumoto, T.; J. Chromatogr 1988, 442, 81.
• 18. Finglas, P. M.; Faure, U.; Wagstaffe, P. J.; J. Anal. Chem 1993, 345,180.
• 19. Hollman, P. C.; Slange, J. H.; Wagstaffe, J. P.; Faure, U.; Southgate, D. A. T.; Finglas, P. M.; Analyst 1993, 118, 481.
• 20. Finglas, P. M.; Wigertz, K.; Vahteristo, L.; Witthöft, C.; Southon, S.; Froidmont-Görtz, I..; Food Chem. 1999, 64, 245.
• 21. Caulcutt, R.; Boddy, R.; Statistic for analytical chemists, 1^st ed.; Londres, 1983.
• 22. Ribani, R.; Bottoli, C. B. G.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F; Melo, L. F. C.; Quim. Nova 2004, 27, 771.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Set 2011
• Data do Fascículo
  Out 2006

Histórico

• Recebido
  11 Ago 2005
• Aceito
  01 Fev 2006