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Química Nova

versão impressa ISSN 0100-4042

Quím. Nova v.29 n.6 São Paulo nov./dez. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422006000600020 

ARTIGO

 

Constituintes químicos e atividade antioxidante de Sida galheirensiS Ulbr. (Malvaceae)

 

Chemical constituents and antioxidant activity of Sida galheirensis Ulbr. (Malvaceae)

 

 

Davi Antas e SilvaI; Tânia Maria Sarmento da SilvaI; Antônio Cláudio da Silva LinsI; Danielly Albuquerque da CostaI; José Marcílio Sobral CavalcanteI; Wemerson Neves MatiasI; Maria de Fátima Vanderlei de SouzaI, *; Raimundo Braz FilhoII

ILaboratório de Tecnologia Farmacêutica "Delby Fernandes de Medeiros", Universidade Federal da Paraíba, CP 5009, 58051-970 João Pessoa - PB, Brasil
IISetor de Química de Produtos Naturais, Centro de Ciências e Tecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Av. Alberto Lamego, 2000, 28013-603 Campos - RJ, Brasil

 

 


ABSTRACT

The phytochemical investigation of Sida galheirensis led to the isolation of 5,4'-dihydroxy-3,7,3´-trimethoxyflavone, 173-ethoxyphaeoforbide, a rare natural product, 6,7-dimethoxycoumarin, ortho-hydroxybenzoic acid, sitosterol-3-O-b-D-glucopyranoside, stigmasterol-3-O-b-D-glucopyranoside, 5,7,4'-trihydroxyflavone, 5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone, kaempferol-3-O-b-D-(6"-E-p-coumaroyl) glucopyranoside and luteolin 7-O-b-D-glucopyranoside. Their structures were assigned based on spectroscopic analyses, including two-dimensional NMR techniques. Antioxidant activities of hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH and EtOH extracts of Sida galheirensis were measured using the 1,2-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. This is also the first work reporting the chemical investigation of Sida galheirensis.

Keywords: Sida galheirensis; Malvaceae; flavonoids.


 

 

INTRODUÇÃO

O gênero Sida apresenta ampla distribuição neotropical com várias espécies bem representadas nas Américas. No Brasil este gênero possui muitos representantes nas regiões Nordeste e Sul e, em menor proporção, nas regiões Norte, Centro-Oeste e Sudeste1.

Espécies de Sida são usadas na medicina popular com diversas atividades, como a Sida acuta, empregada para neutralizar o veneno da serpente Bothrops atrox, tendo esse efeito sido investigado em laboratório2. A Sida cordifolia, conhecida como malva branca, é usada na medicina folclórica para tratamento de estomatites, bronquite asmática e congestão nasal. Os efeitos antiinflamatório e analgésico foram investigados para o extrato aquoso desta planta, mostrando-se bastante significativos, comprovando sua utilização popular3. A Sida rhomboidea Roxb é uma erva encontrada em pântanos da Índia, cujas raízes e folhas são usadas como tônico, para cura de febres, doenças do coração e todos os tipos de inflamação. Estudos farmacológicos utilizando extratos desta planta indicaram sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória4.

Investigações fitoquímicas com espécies do gênero Sida mostraram a presença de ácidos graxos5-9, diterpenos7, esteróides10,11, flavonóides12,13 e compostos nitrogenados14,15.

Os radicais livres desempenham papel importante no organismo, mas o efeito cumulativo desses radicais está implicado em doenças, tais como câncer, ateroscleroses, isquemia cerebral e envelhecimento16. Antioxidantes que seqüestram os radicais livres, tanto previnem como apresentam alto potencial terapêutico em doenças que apresentam estes radicais17,18. Estas observações levam à busca de novos potenciais antioxidantes derivados de plantas utilizadas na medicina popular.

Este trabalho descreve o estudo fitoquímico e a avaliação da atividade antioxidante de Sida galheirensis, uma espécie com endemismo em regiões do semi-árido, ocorrendo em praticamente todos os estados do Nordeste, normalmente em densas populações em meio à caatinga1.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos em aparelho Perkin-Elmer, FT-IR-1750 utilizando-se 3,0 mg de amostra em pastilhas de KBr, com freqüência medida em cm-1. Os espectros de RMN foram obtidos em espectrômetros Brucker-AC (UFC) a 500 (1H) e 125 (13C) e Mercury-Varian a 200 (1 H) e 50 (13C) (LTF/UFPB), otimizados para técnicas uni e bidimensionais, utilizando-se quantidades variáveis de amostras. Os solventes empregados foram CDCl3, CD3OD, C6D5N e DMSO-d6, cujos picos característicos em RMN 1H e 13C serviram como padrão interno durante a obtenção dos espectros. Para as cromatografias em coluna utilizou-se como fase estacionária sílica gel 60 (Merck) 7734 (partículas com 0,063-0,2 mm, 70-230 mesh) e Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala-Sweden), tendo como suporte colunas de vidro cilíndricas com dimensões variando de acordo com a quantidade de amostra a ser cromatografada. A cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) foi empregada para análise e reunião das frações obtidas por cromatografia em coluna. Foram utilizadas placas de vidro cuja fase fixa foi preparada com uma suspensão de sílica gel PF254 7749 (Merck) em água. As substâncias em análise foram evidenciadas pelo uso de radiação ultravioleta sob os comprimentos de onda de 254 e 366 nm, pela impregnação das placas em cubas de vidro saturadas por vapores de iodo e, ainda, com solução de AlCl3:EtOH (1%) (para os flavonóides glicosilados).

Material vegetal

A planta total, Sida galheirensis, foi coletada no município de Serra Branca, estado da Paraíba, em abril de 2000 e identificada pela botânica Profª Dra. M. de F. Agra, do Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais/LTF/UFPB e uma exsicata do material (nº 2249) foi arquivada no Herbário Lauro Pires Xavier (CCEN/UFPB).

Extração e isolamento dos constituintes químicos

O material botânico desidratado e moído (15,0 kg) foi macerado em etanol a 95% por 72 h, sendo tal processo repetido exaustivamente. A solução etanólica foi concentrada em evaporador rotativo a 60 °C, produzindo 612,0 g do extrato etanólico bruto. Uma parte deste material (450,0 g) foi submetida a estudo. Este material foi solubilizado em 400 mL de etanol:água (7:3) e extraído sucessivamente com hexano, CHCl3, AcOEt e n-BuOH. Após evaporação do solvente de todas as fases em rotavapor, obteve-se 111,1 g da fase hexânica, 76,8 g da fase CHCl3, 13,1 g da fase AcOEt e 10,0 g da fase n-BuOH. A fase hidroalcoólica remanescente foi filtrada para separação de um precipitado que se formou, o qual foi posteriormente cromatografado.

A fase clorofórmica (20,0 g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 eluindo-se com hexano, AcOEt e MeOH, seguindo uma ordem crescente de polaridade. As amostras obtidas através deste procedimento foram, então, analisadas em CCDC e reunidas de acordo com seus Rfs, resultando em 31 frações. A fração reunida 60/65 (108,0 mg) mostrou-se como duas manchas por análise em CCDC e uma alíquota de 65,0 mg foi cromatografada em coluna com Sephadex LH-20, sendo utilizada uma mistura CHCl3:MeOH (1:1) como eluente, obtendo-se a 5,4'-diidroxi-3,7-3'-trimetoxiflavona (pachypodol) (1, 11,0 mg) e o 173-etoxifaeoforbídeo a (2, 25,0 mg). A fração 84/89 forneceu a 6,7-dimetoxicumarina (escoparona, 3, 65,0 mg) após recristalização em CHCl3 e a fração 103/120, após ser recromatografada em coluna de sílica gel, permitiu o isolamento do ácido orto-hidroxibenzóico (4, 23,0 mg). Uma pequena amostra da fração 210/218 (35,0 mg) forneceu uma mistura de sitosterol-3-O-b-D-glicopiranosídeo e estigmasterol-3-O-b-D-glicopiranosídeo (5 e 6, respectivamente, 30,0 mg) através de recristalização com MeOH.

A fase AcOEt (10,0 g) foi submetida à coluna de sílica gel com hexano, AcOEt e MeOH como eluentes em ordem crescente de polaridade. As frações obtidas foram comparadas por CCDC e reunidas, obtendo-se 18 frações. A 43/72 foi cromatografada em Sephadex LH-20, utilizando-se MeOH e MeOH:CHCl3 (7:3), resultando na obtenção da 5,7,4'-triidroxiflavona (apigenina, 7, 15,0 mg). As frações 85/96 e 186/218 foram recristalizadas com MeOH e forneceram a 5,7,3',4'-tetraidroxiflavona (luteolina, 8, 50,0 mg) e o canferol-3-O-b-D-(6"-E-p-cumaroil) glicopiranosídeo (tilirosídeo, 9, 400,0 mg), respectivamente.

Uma parte (1,5 g) do precipitado obtido da fase hidroalcoólica foi cromatografada em coluna de Sephadex LH-20, usando-se MeOH como eluente. As frações obtidas foram comparadas por CCDC através de visualização em luz ultravioleta e revelados com AlCl3 1%, sendo reunidas as semelhantes. Das 6 frações resultantes, a fração 13-15 foi recristalizada com MeOH para fornecer a luteolina-7-glicosídeo (cinarosídeo, 10, 80,0 mg).

5,4'-Diidroxi-3,7-3'-trimetoxiflavona (1, pachypodol). Sólido amorfo: RMN 1 H [500 MHz, CDCl3, d (ppm), J (Hz)]: 7,73 (d, 1,9 Hz, H-2'), 7,69 (dd, 8,4 e 1,9 Hz, H-6'), 7,06 (d, 8,4 Hz, H-5'), 6,47 (d, 2,1 Hz, H-8), 6,38 (d, 2,1 Hz, H-6), 3,88 (s, MeO-3), 3,90 (s, MeO-7), 4,00 (s, MeO-3'). RMN 13C [(125 MHz, CDCl3, d (ppm)]: 179,15 (C-4), 165,85 (C-7), 162,43 (C-5), 157,13 (C-9), 156,34 (C-2), 148,73 (C-4'), 146,74 (C-3'), 139,26 (C-3), 123,09, (CH-6'), 122,88 (C-1'), 114,98 (CH-5'), 111,29 (CH-2'), 106,44 (C-10), 98,26 (CH-6), 92,60 (CH-8), 60,59 (MeO-3), 56,52 (MeO-3'), 56,23 (MeO-7).

Figura 1

173-Etoxifaeoforbídeo a (2). Sólido cristalino: ES-MS m/z: 621,19 (M+ + H), 593,23, 561,24 (100), 533,21, 473,19, 461,19. IV (KBr) cm-1: 3433, 2957, 2908, 2859, 1731, 1695, 1612, 1459, 1447, 1344, 1222, 1173, 1025, 978, 896, 808, 669. RMN 1H e 13C (Tabela 1).

Canferol-3-O-b-D-(6"-E-p-cumaroil) glicopiranosídeo (9, tilirosídeo). Pó amorfo: RMN 1 H [200 MHz, CDCl3, d (ppm), J (Hz)]: 7,96 (d, 9,0 Hz, H-2'/6'), 7,38 (d, 15,9 Hz, H-b), 7,25 (d, 8,6 Hz, H-2'"/6'"), 6,79 (d, 9,0 Hz, H-3'/5'), 6,77 (d, 8,6 Hz, H-3'"/5'"), 6,27 (d, 2,0 Hz, H-8), 6,11 (d, 2,0 Hz, H-6), 6,05 (d, 15,9 Hz, H-a), 5,23 (d, 7,6 Hz, H-1"), 4,19 (dd, 11,8 e 2,2 Hz, H-6"), 4,06 (dd, 11,6 e 6,4 Hz, H-6") 3,38-3,34 (m, H-2", 3", 4"), 3,25-3,16 (m, H-5"). RMN 13C (50 MHz, CDCl3, d (ppm)]: 179,30 (C-4), 168,82 (COO), 165,79 (C-7), 162,82 (C-5), 161,43 (C-4'), 161,07 (C-4'"), 159,26 (C-2), 158,26 (C-9), 146,52 (CH-b) 135,22 (C-3), 132,19 (CH-2'/CH-6'), 131,13 (CH-2'"/CH-6'"), 127,03 (C-1'"), 122,64 (C-1'), 116,73 (CH-3'"/CH-5'"), 115,99 (CH-3'/CH-5'), 114,70 (CH-a), 105,53 (C-10), 104,02 (CH-1"), 99,93 (CH-6), 94.85 (CH-8), 77,96 (CH-3"), 75,71 (CH-2", CH-5"), 71,67 (CH-4"), 64,37 (CH2-6").

Luteolina 7-O-b-D-glicopiranosídeo (cinarosídeo, 10). Sólido cristalino. RMN 1 H [200 MHz, CDCl3, d (ppm), J (Hz)]: 7,43 (d, 2 Hz, H-2'), 6,92 (d, 8,9 Hz, H-5'), 6,78 (d, 1,8 Hz, H-8), 6.74 (s, H-3), 6,44 (m, H-6'), 6,43 (d, 1,8 Hz, H-6), 5,07 (d, 7,2 Hz, H-1"), 3,60 (m, H-6"), 3,40 (m, H-3", H-6"), 3,23 (m, H-2"), 3,22 (m, H-5"). RMN 13C (50 MHz, CDCl3, d (ppm)]: 181,98 (C-4), 164,56 (C-2), 163,01 (C-7), 161,17 (C-5), 157,01 (C-9), 150,09 (C-4'), 145,90 (C-3'), 121,34 (C-1'), 119,20 (CH-6'), 116,33 (CH-5'), 113,66 (CH-2'), 105,39 (C-10), 103,16 (CH-3), 99,92 (CH-1"), 99,57 (CH-6), 94,81 (CH-8), 77,20 (CH-3"), 76,44 (CH-2"), 73,17 (CH-5"), 69,58 (CH-4"), 60,64 (CH2-6").

Atividade antioxidante

A atividade seqüestradora de radical livre para os extratos EtOH, hexânico, AcOEt e BuOH foi determinada utilizando o teste com o DPPH, usando uma série de diluições, misturando-se 5 mL de solução de DPPH (100 µM em EtOH) com quantidades apropriadas dos extratos (concentrações variando entre 24,0-143,0 µg/mL). Após 30 min, a quantidade dos radicais de DPPH foi registrada em UV-Vis no comprimento de onda 517 nm. O teste foi realizado em triplicata. Foram utilizados como padrão o ácido ascórbico (CE50 = 14,08 µM e o BHT (CE50 = 20,26 µM). A eficiência antiradicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão linear no intervalo de confiança de 95% (P<0,05) obtido pelo programa de estatística GraphPad Prism 4.0. Os resultados foram expressos através do valor da CE50, que representa a concentração da amostra necessária para seqüestrar 50% dos radicais de DPPH (Tabela 2).

 

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O espectro de RMN 1H de 1 mostrou presença de dois dubletos em dH 6,38 e d 6,47, referentes aos hidrogênios 6 e 8, respectivamente, normalmente decorrentes de substituição por funções oxigenadas nos carbonos 5 e 7 em espectros de flavonas19. Absorções para três metoxilas aromáticas foram observadas em dH 3,88, d 3,90 e d 4,00. Uma absorção em campo baixo localizada em dH 12,66 corresponde ao valor típico de hidroxila em ponte com carbonila, normalmente observada em espectros de hidrogênio de flavonóides20. A presença de um sistema ABX foi deduzida por um conjunto de sinais em dH 7,69 (dd, J=8,4 e 1,9 Hz), d 7,06 (d, J=8,4 Hz) e d 7,72 (d, J=1,9 Hz), sugerindo substituições nos carbonos 3' e 4' do anel B de 1. As posições dos grupos metoxílicos foram estabelecidas pelo espectro HMBC, que mostrou interações a três ligações das absorções em dH 3,88 (CH3O-3) com dC 139,36 (C-3), dH 3,90 (CH3O-7) com dC 165,85 (C-7) e dH 4,00 (CH3O-3') com dC 146,74 (C-3'). Os dados espectrais de 1 foram também comparados com a literatura21, permitindo identificá-la como 5,7-diidroxi-3,7-3´-trimetoxiflavona, conhecida como pachypodol (1).

O espectro de IV de 2 mostrou bandas de absorção em nmax 3397 cm-1, referente à deformação axial de N-H, nmax 1344 cm-1, condizente com estiramento de C-N, e 1612 cm-1, relativo à deformação de ligação dupla em sistemas conjugados, sugerindo a presença de núcleo porfirínico. As bandas em nmax 1731 e 1695 cm-1 foram atribuídas a grupos carbonílicos não conjugado e conjugado, respectivamente22. O espectro de massas de 2 revelou o pico do íon molecular em m/z 621 [M++1], que permitiu a dedução da fórmula molecular como C37H40N4O5 .

O espectro de RMN 1H revelou absorções para um grupo de hidrogênios vinílicos em dH 7,93 (dd, J=17,8 e 11,6 Hz), 6,24 (dd, J=17,8 e 1,6 Hz), 6,14 (dd, J=11,6 e 1,6 Hz), três metilas olefínicas em dH 3,37, 3,16 e 3,65 e três hidrogênios olefínicos em dH 9,30, 9,45 e 8,53, estes últimos condizentes com absorções dos hidrogênios 5, 10 e 20 do núcleo porfirínico das feofitinas23,24. Adicionalmente, observou-se um conjunto de deslocamentos químicos para hidrogênios metoxílicos em dH 3,87 e etoxílicos em dH 3,93 (m) e 1,09 (t, J=7,0 Hz). Através do espectro de HMBC tornou-se possível estabelecer as posições dos grupos substituintes no anel porfirínico. Este espectro mostrou correlação a três ligações entre os sinais em dH 6,24 e 6,14 (2H-32) com dC 136,16 (C-3) e ainda entre CH3-82 (dH 1,65) com o carbono 8 (dC 145,09), permitindo definir as posições 3 e 8 para os grupos vinílico e etílico, respectivamente. Os assinalamentos referentes aos hidrogênios e grupos metilícos olefínicos foram feitos também através do espectro HMBC com base nas correlações seguintes: CH3-21 (dH 3,37) com dC 141,98 (C-1) (2J) e dC 136,16 (C-3) (3J); CH3-71 (dH 3,16) com dC 136,05 (C-7, 2J) e CH3-121 (dH 3,65) com dC 137,83 (C-11, 3J). O espectro de NOESY permitiu estabelecer a estereoquímica dos carbonos 17, 181 e 132 através do acoplamento espacial entre as absorções em dH 4,19 (H-17) e 1,79 (CH3-181), de onde se deduziu que H-17 e CH3-181 encontram-se em configuração a (Figura 2). A análise espectral combinada com os dados da literatura25 permitiu identificar a substância 2 como 173-etoxifaeoforbídeo.

 

 

As estruturas das substâncias 3-9 foram caracterizadas através dos espectros 1D e 2D de RMN 1H e 13C envolvendo comparação com dados descritos na literatura, permitindo identificá-las como 6,7-dimetoxicumariana (escoparona, 3)26,27, ácido orto-hidroxibenzóico (4)28, sitosterol-3-O-b-D-glicopiranosídeo (5)29 e estigmasterol-3-O-b-D-glicopiranosídeo (6)29, 5,7,4'-triidroxiflavona apigenina (7)30 5,7,3',4'-tetraidroxiflavona (luteolina, 8)21 e canferol-3-O-b-D-(6"-E-p-cumaroil) glicopiranosídeo tilirosídeo (9)31.

Os espectros de RMN 1H e 13C da substância 10 mostraram absorções compatíveis com um flavonóide com o padrão de substituição da luteolina (8). O espectro de RMN 1H apresentou também sinais para uma molécula osídica, caracterizada pelos multipletos entre dH 2,90-4,00 e um dubleto em dH 5,07 (J= 7,20 Hz) atribuído a hidrogênio anomérico, sugerindo a presença de uma unidade glicopiranozílica com configuração b. O espectro de NOESY de 10 mostrou acoplamento espacial entre o hidrogênio anomérico 1" (dH 5,06) com os hidrogênios H-6 (dH 6,42) e H-8 (dH 6,78), permitindo, conseqüentemente, localizar a O-glicosilação na posição 7 do esqueleto da luteolina. Este espectro mostrou ainda as interações espaciais entre os hidrogênios H-3 (dH 6,74) e H-6' (dH 7,43), sugerindo a ausência de substituinite no átomo de carbono C-3 e contribuindo para a localização dos demais substituintes na molécula (Figura 3). Os dados espectrais foram também comparados com valores registrados na literatura32, permitindo caracterizar a estrutura da luteolina 7-O-b-D-glicopiranosídeo (cinarosídeo, 10).

 

 

Atividade antioxidante

A atividade antioxidante utilizando o radical DPPH tem sido muito utilizada para verificar a capacidade seqüestradora de radicais livres de muitos produtos naturais33-35.

Como mostrado na Figura 4 e Tabela 2, a atividade antiradicalar de diferentes extratos de Sida galheirensis foi determinada utilizando o radical livre DPPH. Os valores foram expressos através de EC50. O extrato AcOEt revelou-se o mais ativo. A atividade diminuiu na seguinte ordem: ácido ascórbico > BHT > AcOEt > BuOH >EtOH> CHCl3 > hexânico. O alto valor de EC50 para o extrato hexânico mostrou uma menor capacidade de seqüestrar os radicais livres. A alta atividade seqüestradora de radicais livres para o AcOEt pode ser justificada pela presença de pelo menos dois dos flavonóides. Em trabalhos anteriores foi verificada a atividade antiradicalar, utilizando o DPPH, para os flavonóides luteolina 36 e tilirosídeo36, sendo a flavona apigenina37 inativa frente a este radical.

 

 

AGRADECIMENTOS

Ao PRONEX/CNPq e FAPERJ pela bolsa (CNPq) e pelo suporte financeiro, ao CENAUREM/UFC pela obtenção dos espectros de 500 e 125 MHz, à Profa M. de F. Agra (LTF/DCF/UFPB) pela identificação botânica e a V. C. da Costa (NPPN/LTF/UFPB) pela obtenção dos espectros de 200 e 50 MHz.

 

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Recebido em 6/12/05; aceito em 9/3/06; publicado na web em 11/8/06

 

 

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