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Química Nova

Print version ISSN 0100-4042On-line version ISSN 1678-7064

Quím. Nova vol.30 no.4 São Paulo July/Aug. 2007

https://doi.org/10.1590/S0100-40422007000400024 

ARTIGO

 

Estudo da influência dos íons K+, Mg2+, SO42- e CO32- na cristalização biomimética de fosfato de cálcio amorfo (ACP) e conversão a fosfato octacálcico (OCP)

 

Study of the influence of K+, Mg2+, SO42- and CO32- ions in the biomimetic crystallization of amorphous calcium phosphate (ACP) and conversion into octacalcium phosphate (OCP)

 

 

Anahí Herrera Aparecida*; Marcus Vinícius Lia Fook; Márcio Luis dos Santos; Antonio Carlos Guastaldi

Departamento de Físico-Química, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, R. Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara – SP, Brasil

 

 


ABSTRACT

The crystallization of hydroxyapatite (HA) in aqueous solution can be described by the mechanism ACP ® OCP ® HA. In this work, it was studied the influence of K+, Mg2+, SO42- and CO32- ions in the formation of ACP and in its conversion to OCP, using biomimetic coatings on metallic substrates of commercially pure titanium (Ti c.p.). The results showed that Mg2+ and CO32- ions favored both the formation of ACP and its conversion to OCP. Differently, K+ and SO42- ions did not influence the formation of ACP and, consequently, interfered in the conversion to OCP.

Keywords: biomimetic coating; amorphous calcium phosphate; octacalcium phosphate.


 

 

INTRODUÇÃO

Durantes as décadas passadas, as biocerâmicas de fosfato de cálcio têm sido amplamente utilizadas em aplicações médicas, ortopédicas e odontológicas, como recobrimentos ou materiais densos para a reposição e reparação do tecido ósseo, devido à similaridade química e estrutural com a apatita biológica, que propicia a interação direta com o tecido ósseo1-4. Uma forma conveniente de classificar os fosfatos de cálcio é através da razão molar entre os átomos de cálcio e fósforo - Ca/P, a qual varia de 0,5 a 2,0 conforme mostra a Tabela 1. Os fosfatos de cálcio podem ser sintetizados por precipitação a partir de soluções contendo íons Ca2+ e PO43-, sob condições alcalinas ou ácidas.

 

 

A hidroxiapatita – HA, por constituir o principal componente mineral dos ossos, é o fosfato de cálcio mais utilizado como biocerâmica, seja como recobrimento ou material denso1. Contudo, além da HA, vários outros fosfatos de cálcio também ocorrem em calcificações normais e patológicas, o que vem despertando interesse significativo nas possibilidades de utilização destes materiais como biocerâmicas5. A Tabela 2 relaciona diversos fosfatos de cálcio e suas ocorrências em sistemas biológicos.

 

 

A utilização de HA em recobrimentos tornou-se popular em implantes dentários e ortopédicos devido às seguintes vantagens: rápida adaptação óssea, não formação de tecido fibroso, íntima adesão implante/tecido, tempo de cicatrização reduzido e maior tolerância a imprecisões cirúrgicas. A estas vantagens podem estar associadas outras características, como um sistema de manutenção do osso ao redor da área recoberta que aumenta a tolerância às mudanças ósseas naturais inevitáveis6. Apesar de todas estas vantagens, o uso clínico da HA é limitado devido à sua lenta biodegradação. Estudos efetuados por longos períodos de tempo têm mostrado que a HA começa a ser reabsorvida gradualmente após 4 a 5 anos de implantação. A reabsorção é uma característica desejada para biomateriais nos quais o processo de degradação é concomitante com a reposição do osso em formação5.

Fosfato de Cálcio Amorfo – ACP

Quando fosfatos de cálcio são precipitados a partir de soluções aquosas supersaturadas, com pH neutro ou alcalino, uma fase amorfa metaestável forma-se rapidamente nos estágios iniciais da reação7,8. Esta fase é denominada fosfato de cálcio amorfo – ACP, cuja fórmula é Ca3(PO4)2.nH2 O, com n = 3 a 4,5, e que corresponde à hidroxiapatita deficiente em cálcio - HAD com composição Ca9H2(PO4)6 .n'H2O.

Alguns autores descrevem que ACP se converte diretamente a HA, contudo, a formação de fosfato octacálcico – OCP – como fase intermediária pode ocorrer e é descrita por outros autores8,9.

Embora não pareça existir em quantidade detectável nos tecidos duros dos vertebrados, o ACP tem sido encontrado em muitos sistemas biológicos e como parte da composição de recobrimentos obtidos por aspersão térmica ("plasma-spray"). Esta fase de apatita tem sido relatada como responsável pela otimização das propriedades mecânicas destes recobrimentos, especialmente a adesão a superfícies metálicas, e das propriedades biológicas. O aumento da quantidade de ACP em recobrimentos melhora a osteocondutividade, contudo pode ocasionar a degradação do material, danificando sua integração biológica com o tecido vivo10.

Fosfato Octacálcico – OCP

O fosfato octacálcico (OCP) - Ca8H2(PO4)6 .5H2O - apresenta importância biológica tanto quanto o ACP e a HA, pois é um importante precursor na formação de ossos e dentes. O OCP tem estrutura similar à HA e, freqüentemente, aparece como um intermediário em sua formação. Em solução aquosa, esta fase pode ser considerada como uma fase de transição, pois é formada como intermediária na conversão do ACP a HA, segundo o mecanismo ACP®OCP®HA, que pode ser influenciado por diferentes fatores, tais como temperatura, pH e composição da solução9,11,12.

Entre as técnicas de recobrimento o método biomimético vem se destacando entre os demais, pois possibilita a mimetização do processo biológico de formação de tecidos rígidos. Inicialmente proposto por Kokubo et al.13, este método utiliza uma solução aquosa denominada "Simulated Body Fluid - SBF" de composição e pH similares ao fluido corpóreo. Dentre as diversas vantagens apresentadas por este método, pode-se destacar a possibilidade de controle de espessura da camada, tamanho de grãos e diversidade de forma cristalina.

Tanto no meio biológico quanto em solução aquosa como a SBF, a formação de apatitas ocorre em meio contendo, além de íons Ca2+ e PO43-, íons-traços essenciais tais como: Mg2+, HCO3-, K+ e Na+. Alguns destes íons apresentam propriedades específicas frente à formação de HA e de outras fases de apatita9,14,15. O objetivo deste trabalho foi estudar a influência dos íons K+, Mg2+, SO42- e CO32- na formação da fase precursora ACP e na sua conversão a OCP. Utilizaram-se neste trabalho soluções biomiméticas com composições variadas e substratos metálicos de titânio comercialmente puro - Ti c.p.

 

PARTE EXPERIMENTAL

Amostras de Ti c.p., depois de cortadas nas dimensões de 0,5 X 1,0 X 0,3 cm, foram lixadas com lixas d'água de granulometria 180 mesh, limpas em ultra-som por 15 min em mistura de acetona e álcool etílico e 15 min em água desmineralizada. Logo após, foram colocadas em solução de NaOH 5M por 24 h em estufa a 60 ºC e, então, secas por 3 h, também em estufa a 60 ºC. Para analisar o efeito da composição da solução SBF na obtenção das fases ACP e OCP, seis diferentes soluções foram preparadas, com reagentes de grau analítico e água desmineralizada, como mostra a Tabela 3.

 

 

Na Tabela 3, a solução denominada SBF 0 é a solução padrão utilizada pelo método biomimético, com a presença de todos os íons em sua composição. Com a utilização da solução modificada SBF 1, avaliou-se o efeito da ausência dos íons-traços essenciais na formação das fases de apatita em estudo. Nas soluções denominadas SBF 2, 3 e 4, os íons em estudo foram Mg2+, K+ e SO42-, respectivamente, todos na concentração de 1mM. O comportamento do íon CO32- foi avaliado em duas concentrações, 3 e 5 mM, utilizando-se as soluções SBF 5 e 6, respectivamente.

As amostras foram mantidas em cada SBF a 37 ºC por 7 dias, efetuando-se a troca da solução a cada 48 h.

Os recobrimentos obtidos foram analisados utilizando-se as técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), usando microscópio JEOL-JSM, modelo T-330 A acoplado a espectrômetro de energia dispersiva de raios X - EDX e à câmera fotográfica; difratometria de raios X – DRX, utilizando um difratômetro de raios X Siemens D5000 com varredura angular entre 10 e 70º com passo de 0,02 (2q), sendo que o tempo de passo foi de 1,0 s para cada amostra; espectroscopia no infravermelho médio – IV (com número de ondas de 4000 a 400 cm-1), realizada com espectrômetro Perkin Elmer, FT-IR Spectrometer-Spectrum 2000 de reflectância difusa Drift Collector.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Recobrimento por SBF 0

Por imersão em SBF 0, obteve-se sobre a superfície do Ti c.p. um recobrimento compacto e de grãos esféricos com trincas de aproximadamente 10 µm. Por EDX, notou-se que o recobrimento é composto somente pelos elementos Ca e P, em uma razão Ca/P de 1,45. A caracterização por DRX mostrou que este recobrimento é composto por uma mistura de fases correspondentes ao fosfato octacálcico (OCP) e à hidroxiapatita deficiente em cálcio (HAD) – Ca9,04(PO4)6(OH) 1,68, Figura 1. O espectro de IV mostrou bandas características de grupos PO4 em 387, 646, 984 e 1144 cm-1, P-OH em 515 cm-1 e apatita carbonatada do tipo B em 1464 e 876 cm-1, que pode ser atribuída também ao grupo P-OH.

 

 

A formação de ACP a partir de uma solução aquosa envolve um período de indução (tACP), o qual pode ser alterado mediante as condições de temperatura, pH e composição da solução. A presença de íons Mg2+, CO32-, F-, P2O74- e poliacrilatos reduz significantemente este período. Diferentemente, a presença de íons como Na+ e K+ não altera este período de indução9.

Após sua cristalização, o ACP sofre hidrólise originando OCP ou HA, segundo o mecanismo9:

ACP ® OCP ® HAD (Ca/P < 1,67) ® HA (Ca/P = 1,67) ou ACP ® HA

O estudo do comportamento hidrolítico do ACP mostra que o mecanismo da conversão é governado por um processo de dissolução-reprecipitação, devido à alta solubilidade da fase amorfa comparada à fase cristalina. Em pH fisiológico (7,4), a hidrólise do ACP é descrita por um processo em duas etapas. Na primeira, ocorre a diminuição da razão Ca/P da fase sólida (inferior a 1,5) associada ao aumento do pH e ao aumento da razão Ca/P da solução (maior que 1,5). Na segunda etapa, um aumento na razão Ca/P do sólido é observado devido ao consumo de íon OH- da solução e uma diminuição da razão Ca/P da solução. Esta etapa é caracterizada como hidrólise do OCP a hidroxiapatita10.

A partir dos dados obtidos, pode-se notar que a composição da solução SBF 0 possibilitou a cristalização completa do ACP, devido à redução do tACP ocasionada pela presença dos íons Mg2+ e CO32- e sua total conversão a OCP. Esta última fase converteu-se parcialmente a HA deficiente em cálcio, conforme o mecanismo mostrado.

Recobrimento por SBF 1

O recobrimento obtido por imersão em SBF 1 apresentou morfologia característica de fase amorfa de fosfato de cálcio, composta por grãos esféricos9. A presença dos elementos Ca e P deu-se em uma razão de 1,4. Por DRX, Figura 2, observou-se que somente a fase ACP estava presente no recobrimento. O espectro de IV, Figura 2cS, confirmou os resultados obtidos por DRX, pois apresentou bandas características dos grupos PO4 (em 662 e 1301 cm-1) e P-OH (em 1045 cm-1) e da fase amorfa de fosfato de cálcio (em 573 cm-1). Além destas bandas, o recobrimento apresentou bandas referentes ao grupo CO32- da apatita carbonatada tanto do tipo A (em 1557 cm-1) quanto do tipo B (em 1409 e 1468 cm-1), caracterizando uma apatita carbonatada do tipo AB. Mesmo a solução SBF 1 não contendo o íon CO32- em sua composição, a presença de apatita carbonatada no recobrimento é possível pela reação entre os íons OH- da apatita com CO2 do ar, durante o período de imersão, segundo a reação9:

2OH-(apatita) + CO2(ar) ® CO32-(apatita) + H2O

O fato da solução SBF 1 conter, além dos íons Ca2+ e PO43-, somente os íons Na+ e Cl- contribuiu para a obtenção majoritária de ACP no recobrimento, pois estes íons não alteram tACP, não favorecendo sua conversão a OCP.

 

 

Recobrimento por SBF 2

Por imersão em SBF 2, obteve-se um recobrimento com morfologia característica das fases amorfa de fosfato de cálcio e OCP, este último caracterizado por cristais orientados perpendicularmente semelhante a agulhas (acuniformes)11,12,15. Por DRX, observou-se somente a presença destas fases, Figura 3. A razão Ca/P foi de 1,35. O espectro de IV apresentou bandas características dos grupos P-OH no intervalo de 1000-1104 cm-1 e PO4 em 573 cm-1, que pode ser também atribuída à fase amorfa de fosfato de cálcio, confirmando os resultados obtidos por DRX. Bandas de apatita carbonatada do tipo A apareceram em 1457 e 1528 cm-1.

 

 

A presença do íon Mg2+ na solução possibilitou a obtenção de OCP, pois favoreceu a cristalização completa do ACP, por diminuição do tACP, e, conseqüentemente, sua transformação parcial a OCP.

Recobrimento por SBF 3

O recobrimento obtido por imersão em SBF 3 apresentou morfologia predominante de fosfato de cálcio amorfo, resultado confirmado por DRX, Figura 4. A razão Ca/P foi de 1,42. O espectro de IV apresentou bandas características dos grupos P-OH em 944-1119 cm-1, PO4 em 573 cm-1, que pode ser atribuída também à fase amorfa de fosfato de cálcio, e apatita carbonatada do tipo A em 1457 e 1528 cm-1.O comportamento desta solução assemelhou-se à solução SBF 1, indicando a não interferência do íon K+ em tACP.

 

 

Recobrimento por SBF 4

Por imersão em SBF 4 obteve-se um recobrimento composto por grãos esféricos característicos de fosfato de cálcio amorfo. A razão Ca/P foi de 1,5. Os resultados do DRX confirmaram a presença majoritária ACP, Figura 5. O fenômeno de formação desta fase é semelhante ao ocorrido pela imersão das amostras em SBF 1 e 3, ou seja, a composição da solução não possibilitou a redução de tACP, interferindo desta forma na sua conversão a outras fases de apatita. O espectro de IV exibiu bandas características dos grupos PO4 (em 564 cm-1), P-OH (em 944 -1119 cm-1) e apatita carbonatada do tipo A e B (em 1536 e 1468 cm-1, respectivamente).

 

 

Recobrimento por SBF 5

O recobrimento obtido pela imersão em SBF 5 apresentou morfologia característica das fases ACP e OCP, ou seja, composto por grãos esféricos e cristais em forma de agulhas. Estas observações foram confirmadas pela análise do DRX, o qual apresentou picos característicos destas fases, Figura 6. A presença dos elementos Ca e P deu-se em uma razão de 1,46. O espectro de IV apresentou bandas dos grupos PO4 em 465 e 593 cm-1, P-OH em 944-1119 cm-1, apatita carbonatada do tipo A em 880 e 1457 cm-1 e apatita carbonatada do tipo B em 870 cm-1, que pode também ser atribuída ao grupo PO4.

 

 

Pode-se notar que o íon CO32- na concentração de 3 mM possibilitou a cristalização completa do ACP, favorecendo, dessa forma, sua conversão parcial a OCP.

Recobrimento por SBF 6

O recobrimento obtido por imersão nesta solução apresentou em sua morfologia aglomerados entre partículas esféricas maiores que aquelas características da fase ACP e agulhas características do OCP. A presença dos elementos Ca e P deu-se em uma razão de 1,53. Os resultados de DRX confirmaram as observações anteriores, pois apresentaram picos característicos somente da fase OCP e de apatita carbonatada AB, Figura 7. Dessa forma, nota-se que nesta concentração (5 mM) os íons CO32- apresentam maior eficiência na diminuição do período de indução da cristalização do ACP. As bandas exibidas por espectroscopia de IV foram características dos grupos PO4 (em 454, 544 e 595 cm-1), P-OH (em 879 e 944-1095 cm-1) e apatita carbonatada dos tipos A e B (em, respectivamente, 1547 e 1311, 1468 cm-1).

 

 

A elevada concentração do íon CO32- nesta solução possibilitou, além da cristalização completa do ACP, sua conversão total a OCP.

 

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho confirmam a influência da composição da solução biomimética na obtenção de diferentes fases de apatita. A cristalização de ACP foi possível com a utilização de todas as soluções em estudo, sendo que a composição de tais soluções determinou a presença desta fase como majoritária ou como mistura juntamente com OCP ou ainda na sua conversão direta a OCP. A presença majoritária de ACP no recobrimento só foi observada quando se utilizou soluções contendo os íons K+ e SO42-, tendo em vista que estes íons não alteraram tACP. A conversão desta fase a OCP somente foi possível com a presença dos íons Mg2+ e CO32-. O comportamento do íon CO32- tornou-se acentuado na concentração de 5 mM, onde foi observada a conversão direta de ACP a OCP.

 

MATERIAL SUPLEMENTAR

No material suplementar, disponível gratuitamente em http://quimicanova.sbq.org.br na forma de arquivo PDF, estão contidas as Figuras referentes a MEV, EDX e IV dos recobrimentos obtidos, Figuras 1S a 7S.

 

REFERÊNCIAS

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Recebido em 15/5/06; aceito em 29/9/06; publicado na web em 28/5/07

 

 

* e-mail: aherrera@posgrad.iq.unesp.br

 

Material Suplementar

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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