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Química Nova

Print version ISSN 0100-4042On-line version ISSN 1678-7064

Quím. Nova vol.31 no.4 São Paulo  2008

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422008000400018 

ARTIGO

 

Constituintes químicos das flores de Pterogyne nitens (Caesalpinioideae)#

 

Chemical constituents of the flowers of Pterogyne nitens (caesalpinioideae)

 

 

Luis Octávio RegasiniI; Daniara Cristina FernandesI; Ian Castro-GamboaI; Dulce Helena Siqueira SilvaI; Maysa FurlanI; Vanderlan da Silva BolzaniI, *; Eliezer Jesus BarreiroII; Elaine Monteiro Cardoso-LopesIII; Maria Cláudia Marx YoungIII; Luce Brandão TorresIII; José Carlos Rebuglio VellosaIV; Olga Maria Mascarenhas de OliveiraIV

IDepartamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Rua Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara - SP, Brasil
IICentro de Ciências da Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, CP 68006, 21944-190 Rio de Janeiro - RJ, Brasil
IIISeção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, Av. Miguel Stéfano, 3687, 04301-012 São Paulo - SP, Brasil
IVDepartamento de Bioquímica e Tecnologia, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Rua Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara - SP, Brasil

 

 


ABSTRACT

The phytochemical investigation of the flowers of Pterogyne nitens (Caesalpinioideae) resulted in the isolation and identification of nine phenolic derivatives, quercetin 3-O-sophoroside, taxifolin, astilbin, ourateacatechin, caffeic, ferulic, sinapic, chlorogenic and gallic acid, besides two guanidine alkaloids, pterogynine, pterogynidine. This is the first time these compounds have been reported in P. nitens flowers. As this is a monospecific genus, these secondary metabolites may have taxonomical significance. Their structures were assigned on the basis of spectroscopic analyses, including two-dimensional NMR techniques.

Keywords: Pterogyne nitens; flavonoids; guanidine alkaloids.


 

 

INTRODUÇÃO

Pterogyne nitens Tulasne (Fabaceae – Caesalpinioideae), uma espécie pertencente a um gênero monoespecífico, é popularmente conhecida como "amendoim-do-campo", "amendoim-bravo", "bálsamo", "yvi-raró", "cocal", "tipa" etc. Na América Latina essa espécie arbórea ocorre na Argentina, Bolívia, Paraguai e Brasil. No território brasileiro ocorre com freqüência na região de Mata Atlântica e Cerrado compreendida entre o Ceará até o Paraná.1

"Amendoim-bravo", como é popularmente conhecida no estado de São Paulo, é amplamente empregada na construção civil devido às características da sua madeira moderadamente densa e resistente.2 P. nitens também conhecida pela beleza e odor de suas flores, bem como pela intensidade de suas folhagens e frutificação possui grande valor ornamental sendo, portanto, recomendada para arborização de vias urbanas e rodovias e na reposição de mata ciliar em locais com inundações periódicas. Esta espécie habita os remanescentes de vegetação paulista e encontra-se sob risco de extinção, fazendo parte da lista de espécies recomendadas para a conservação genética no estado de São Paulo.3

A literatura apresenta poucos dados das aplicações medicinais e da constituição química de P. nitens. Estudos etnofarmacológicos em comunidades guaranis do nordeste da Argentina revelam o uso das cascas do caule no tratamento de infestações parasitárias, principalmente no combate ao "tacho", nome popular de Ascaris lumbricoides.4 Em trabalhos fitoquímicos anteriores, foram isolados cinco alcalóides guanidínicos das folhas e caules de P. nitens, os quais mostraram atividade citotóxica sobre linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, sugerindo atividade antitumoral potencial desses alcalóides.5

Dada a emergência de preservação da espécie ameaçada de extinção, o estudo sobre a composição micromolecular das flores de P. nitens foi bastante significativo para o registro do perfil metabólico da espécie. Desse estudo foram isolados e identificados onze constituintes: quatro flavonóides, quatro derivados do ácido cinâmico, dois alcalóides guanidínicos e o ácido gálico.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A identificação de todas as substâncias foi realizada com base na comparação de dados espectroscópicos de RMN de 1H, RMN de 13C, gCOSY, gHMQC, gHMBC, NOESY 1D e comparação desses dados com aqueles disponíveis na literatura.

A análise dos espectros de RMN de 1H e 13C permitiu caracterizar as substâncias 1-4 como derivados do ácido cinâmico, com uma feição comum caracterizada por um par de dubletos entre dH 7,58-7,49 (J= 16,0 Hz; 1H) e dH 6,40-6,13 (J= 16,0 Hz; 1H), típicos do sistema trans-alceno de derivados aromáticos C6-C3. Os demais valores atribuídos aos sinais correspondentes ao anel aromático demonstram sutis diferenças na série 1-4. Os sinais em dH 7,12 (d, J= 2,5 Hz), dH 7,04 (dd, J= 2,5 e 8,5 Hz) e dH 6,85 (d, J= 8,5 Hz) observados no espectro de RMN de 1H de 1 foram atribuídos aos hidrogênios H-2, H-6 e H-5, respectivamente. Esses dados sugerem a presença de um anel aromático 1,3,4-trissubstituído, permitindo concluir que o derivado de ácido cinâmico em análise é o ácido cafeico.6

Os espectros de RMN de 1H e 13C da substância 2 apresentaram o mesmo perfil de sinais daqueles observados para 1, exceto pela presença do singleto em dH 3,90 (3H), atribuído a uma metoxila. A ligação do grupo metoxílico ao anel aromático foi estabelecida pela correlação observada entre os sinais em dH 3,90 (OCH3) e 147,9 (C-3), no mapa de contornos gHMBC. Assim, a substância 2 pôde ser caracterizada como sendo ácido ferúlico.7 Os espectros de RMN de 1H da substância 3 apresentaram dois singletos dH 6,98 (2H) e dH 3,80 (6H), os quais foram atribuídos aos hidrogênios metínicos H-2 e H-6 e aos dois grupos metoxílicos, respectivamente. Os demais dados espectrais confirmaram a posição dos dois grupos metoxílicos nos carbonos C-3 e C-5 e permitiram identificar a estrutura molecular de 3 como sendo ácido sinápico.8 Os dados dos espectros de RMN de 1H e 13C de 4 foram quase similares àqueles observados para o ácido cafeico 1. Na estrutura de 4, além dos sinais de uma unidade de ácido cafeico analisados a partir dos espectros de RMN de 13C, foram diagnosticados um conjunto de sinais compatíveis com uma unidade de ácido quínico. O espectro de RMN de 1H apresentou sinais para três hidrogênios metínicos em dH 3,56 (dd, J= 3,5 e 10,0 Hz, H-4), 3,92 (d, J= 3,5 Hz, H-4) e 5,06 (td, J= 3,5 e 10,0 Hz, H-5) e para hidrogênios metilênicos na região compreendida entre dH 1,08 e 1,99 (H-2 e H-6), os quais confirmaram a presença de uma unidade derivada do ácido quínico. A ligação do grupo cafeoíla à unidade de ácido quínico foi estabelecida pela correlação observada entre os sinais em dH 5,06 (H-5) e dC 165,7 (C-9'), no mapa de contornos gHMBC. Os valores observados para os acoplamentos de H-4 com H-3 e H-5 indicaram uma relação axial-equatorial entre H-4 e H-3 (J= 3,5 Hz) e axial-axial entre H-4 e H-5 (J = 10,0 Hz) confirmando as posições diequatoriais para os grupos cafeoíla e a hidroxila (4-OH). Os experimentos de NOESY 1D mostraram um aumento na intensidade do sinal em dH 3,92 (H-3) pela irradiação do sinal atribuído ao hidrogênio H-4 (3,56) e ausência de NOE quando da irradiação do sinal em dH 5,06 (H-5), consolidando a configuração relativa proposta. Tais informações foram confirmadas com dados da literatura, indicando que a estrutura de 4 corresponde ao ácido 5-O-cafeoilquínico.9 Os dados obtidos dos espectros de RMN de 1H e 13C permitiram caracterizar a substância 5 como sendo ácido gálico.10

Os espectros de RMN de 1H e 13C permitiram inferir que a substância 6 pertence à classe dos flavonóides. Entre outras feições destacam-se o conjunto de sinais do espectro de 13C em dC 73,6, 85,0 e 198,3 atribuídos aos carbonos C-3, C-2 e C-4, respectivamente, indicando que 6 possui a estrutura de um diidroflavonol. Um par de dubletos em dH 5,91 (J= 2,0 Hz, 1H) e dH 5,88 (J= 2,0 Hz, 1H) foram atribuídos ao anel A 5,7,9,10-tetrassubstituído. Os sinais em dH 6,96 (d, J= 2,0 Hz, 1H), dH 6,80 (d, J= 8,0 Hz, 1H) e dH 6,84 (dd, J= 2,0 e 8,0 Hz, 1H) corroboram o padrão 1,3,4-trissubstituído para o anel B. Ainda o espectro de RMN de 1H de 6 apresentou um par de dubletos em dH 4,90 (J= 12,0 Hz, 1H) e 4,49 (J= 12,0 Hz, 1H), os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-2 e H-3, respectivamente. A constante de acoplamento apresentada por estes dois dubletos (J= 12 Hz) sugere um acoplamento do tipo axial-axial, conduzindo à proposição de que o anel B e o grupo hidroxila 3-OH mantém uma relação anti. Estes dados analisados em consonância com os de RMN de 13C permitiram caracterizar 6 como sendo taxifolina.11 Os espectros de RMN de 1H e 13C de 7 indicaram uma estreita similaridade entre 6 e 7. A única diferença notada entre os espectros das duas substâncias refere-se aos sinais característicos de uma unidade glicosídica em 7. O sinal em dC 17,8, atribuído ao carbono metílico C-6" e o conjunto de sinais em dC 100,1 (C-1"), 71,7 (C-4"), 70,4 (C-3"), 70,1 (C-2") e 69,0 (C-5") permitiram caracterizar a unidade monosídica como sendo uma ramnose. O espectro de RMN de 1H demonstrou a presença de um dubleto em dH 4,04 que foi atribuído ao hidrogênio anomérico H-1", cuja constante de acoplamento de 1,5 Hz inferiu a configuração a para a unidade de ramnose. A correlação deste dubleto e o sinal em dC 75,7, atribuído ao carbono C-3, observada no mapa de contornos gHMBC, sugeriu que a unidade de ramnose se encontra ligada ao carbono C-3. Os dados espectroscópicos analisados para 7 indicaram tratar-se da estrutura da astilbina.12 A análise polarimétrica dos diidroflavonóis 6 e 7 indicou valores de rotação óptica específica de +17º(c= 1,02 MeOH, 27 ºC) e –22 o (c= 0,82, MeOH, 27 ºC), respectivamente. Esses dados sugerem as configurações absolutas R,R dos carbonos C-2 e C-3 presentes nas estruturas moleculares de 6 e 7, os quais se mostraram compatíveis com os valores descritos na literatura.13

O espectro de RMN de 1H da substância 8 apresentou três sinais característicos de hidrogênios aromáticos: dH 6,53 (s, 2H), 5,93 (d, J= 2,0 Hz, 1H) e 5,95 (d, J= 2,0 Hz, 1H) indicando tratar-se também de um flavonóide. Os sinais correspondentes a dois hidrogênios metilênicos em dH 2,72 (dd, J= 3,0 e 17,0 Hz) e dH 2,86 (dd, J= 5,0 e 17,0 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios H-4a e H-4b, respectivamente e permitiram atribuir a estrutura de uma catequina para 8. Os sinais relativos aos carbonos entre dC 100,1 e 157,9 e 29,1 analisados em conjunção com as correlações observadas no mapa de contornos gCOSY para os hidrogênios H-4a, H-4b e H-3 ajudaram a confirmar a proposição de uma catequina para 8. Os experimentos de NOESY 1D foram empregados visando confirmar a estereoquímica relativa de C-2 e C-3. A irradiação em dH 2,73 (H-4a) causou aumento na intensidade do sinal em dH 4,19 (m, H-3). A irradiação do sinal em dH 2,86 (H-4b) também levou ao aumento de intensidade em dH 4,19 (H-3), indicando a proximidade destes hidrogênios. No entanto, pela intensidade dos NOE observados os sinais em dH 2,86 (H-4b) e dH 4,19 (H-3) estão posicionados na mesma face do plano do anel ao qual estão ligados. A irradiação do sinal em dH 2,73 (H-4a) também causou um incremento em dH 4,78 (sl, H-2), indicando uma correlação 1,3-diaxial entre H-4a e H-2. Ao irradiar-se o sinal em dH 4,19 (H-3), houve um ganho de intensidade em dH 4,78 (H-2) e dH 2,73 (H-4a) coerente com uma relação sin entre H-2, H-3 e H-4a. Estes dados analisados em consonância com as constantes de acoplamento destes sinais permitiram atribuir a configuração relativa proposta. O mapa de contornos gHMBC demonstrou uma intensa correlação entre o sinal em dH 3,80 (s, 3H), atribuído a um hidrogênio metoxílico e o sinal em dC 136,0, o qual está relacionado ao carbono C-4', sugerindo que o grupo metoxila se encontra ligado ao carbono C-4'. A medida da rotação óptica específica de 8 [a]D27 = -58º(c= 1,22, acetona) indicou as configurações R e R dos carbonos C-2 e C-3, similares aos valores encontrados para a epigalocatequina.14 Os dados apresentados são compatíveis com estrutura da ourateacatequina,15 confirmando sua identidade com 8.

 

 

A análise dos espectros de RMN de 1H e 13C permitiu caracterizar a substância 9 também como um flavonóide. O espectro de RMN de 13C apresentou os sinais em dC 177,3, 155,4 e 132,9 atribuídos aos carbonos C-4, C-2 e C-3, respectivamente, evidenciando a subclasse dos flavonóis. Os sinais em dC 144,7 e 148,7 atribuídos aos carbonos C-3' e C-4', respectivamente, evidenciaram um flavonol cujo anel B encontra-se 1',3',4'-trissubstituído. Adicionalmente, os sinais de RMN de 13C compreendidos entre dC 60,6 e dC 82,6 analisados com os sinais de RMN de 1H em dH 5,66 (d, J= 7,5 Hz, 1H) e dH 4,58 (d, J=7,5 Hz, 1H) correspondentes a dois hidrogênios anoméricos indicaram duas subunidades de glicose e, com base no valor da constante de acoplamento (J= 7,5 Hz) para estes dois dubletos, verificou-se tratar de duas subunidades de b-glicose. Os experimentos de gHMBC demonstraram duas correlações entre os dubletos em dH 5,66 e dH 4,58 atribuídos aos hidrogênios anoméricos H-1" e H-1'", respectivamente, e o sinal em dH 82,6 sugerindo que a ligação interglicosídica seja do tipo 2"'®1'". O mapa de contornos gHMBC de 9 também apresentou uma correlação entre o sinal em dC 132,9 atribuído ao carbono C-3 e o dubleto em dC 5,66, levando à conclusão que a posição de O-glicosilação se encontra em C-3. Pelos dados obtidos pode-se caracterizar 9 como sendo quercetina 3-O-soforosídeo.16

Análise dos dados de RMN de 13C das substância 10 e 11 indicou tratar-se de alcalóides de estruturas bastante similares. Entre outras características destacam-se a presença de sinais em torno de dC 155,7 e 156,9 (C-2) típico de carbono guanidínico e um conjunto de cinco sinais relacionados às subunidades isoprenílicas em torno de dC 17,8/17,7; dC 25,2/25,1; dC 39,0/38,7; dC 119,2/119,0 e dC 135,8/136,0. A análise desses dados indicou que 10 e 11 contêm um núcleo guanidínico substituído por unidades hemiterpenoídicas. Dado evidenciado por dois singletos em dH 1,62 (H-4') e dH 1,68 (H-5') atribuídos aos hidrogênios dos grupos metílicos; um dubleto em dH 3,72 (d, J= 6,5, H-1') e um tripleto em dH 5,16 (t, J= 6,5, H-2') relacionados aos hidrogênios metilênicos e metínico, respectivamente, para 10. Da mesma forma, dados similares caracterizaram a estrutura de 11, indicando que as estruturas em questão se tratam de alcalóides guanidino-prenilados. A única diferença entre os alcalóides 10 e 11 deve-se ao padrão de substituição do núcleo guanidínico. No alcalóide 10 o sinal dH 3,72 (J= 6,5 Hz), atribuído aos hidrogênios H-1', apresenta-se como um dubleto devido ao acoplamento com H-2'. Adicionalmente, a ausência do hidrogênio azometínico na estrutura alcaloídica indicou o padrão N,N-dissubstituído para 10, que foi caracterizado como sendo a pteroginina.17 No alcalóide 11, a presença de um tripleto em dH 7,72 (t, J= 6,5, 1H) devido ao acoplamento do hidrogênio azometínico do núcleo guanidínico com H-1' da unidade hemiterpênica indicou que a substituição terpênica ocorre nos nitrogênios vicinais da estrutura guanidínica. Análise de todos os dados indica que 11 possui padrão N,N' de substituição isoprenílica. Fundamentado nestas análises, a substância 11 foi caracterizada como a pteroginidina,5 um isômero constitucional do alcalóide 10.

As substâncias 1-11 foram avaliadas quanto à sua capacidade de inibição sobre mieloperoxidase (MPO), uma heme-enzima abundante em polimorfonucleares (PMNs), e considerada uma macromolécula-chave na resposta imunológica inespecífica a vários agentes invasores, principalmente bactérias. A MPO é responsável pela conversão de peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânions cloreto em água e ácido hipocloroso (HOCl) que, por sua vez, atua como um potente agente antimicrobiano. Além disso, o excesso da atividade de MPO e subseqüente produção exagerada de HOCl culmina em um intenso estresse oxidativo para os PMNs. A literatura correlaciona essa injúria oxidativa promovida por MPO e HOCl com inúmeros processos inflamatórios, tais como artritite reumatóide, fibrose cística, doença inflamatória intestinal (IBD), injúria pulmonar neonatal, etc. Dessa forma, a busca por inibidores de MPO a partir de fontes naturais torna-se de grande valia na descoberta de novos agentes anti-inflamatórios.18

Dentre as substâncias ensaiadas com MPO, apenas as substâncias 5 e 9 mostraram-se ativas, exibindo CI50 de 17,5 e 3,72 nM, quando comparadas à quercetina, utilizada como controle positivo, que apresentou uma CI50 de 1,22 nM. O valor de CI50 da quercetina apresenta-se inferior àquele observado para o seu glicosídeo 9, sugerindo a importância de uma hidroxila livre na posição 3 para atividade de inibição de MPO. As demais substâncias mostraram-se inativas (CI50 > 100 nM), incluindo a substância 6, um análogo hidrogenado da quercetina. Essa observação sugere que uma insaturação situada entre os carbonos C-2 e C-3 no núcleo flavonoídico para uma ação inibitória sobe MPO.

Os extratos e frações obtidas das flores de P. nitens tiveram sua capacidade antioxidante avaliada no ensaio em cromatoplacas reveladas com b-caroteno, mostrando-se ativos, uma vez que mantiveram a coloração laranja nos pontos de aplicação. As substâncias fenólicas isoladas neste estudo são provavelmente as responsáveis pela atividade antioxidante dessas frações detectadas pelo teste preliminar com b-caroteno e que foi anteriormente relatado por Cai e colaboradores, que demonstraram a capacidade seqüestradora de radicais livres das substâncias 1-9 nos ensaios com DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila) e ABTS [2,2'-azino-di-(3-etillbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)].19 A atividade seqüestradora de radicais exibida pelos derivados fenólicos vem sendo amplamente discutida na literatura e está correlacionada a fatores mesoméricos que conferem a esse grupo funcional uma alta reatividade como doadores de elétrons.20 Os alcalóides guanidínicos 10 e 11 tiveram seu poder antioxidante avaliado sobre os radicais DPPH e ABTS. Os resultados indicaram que os alcalóides são inativos no teste com DPPH (CI50 > 200 µM) e mostraram atividade baixa sobre o radical ABTS, apresentando CI50 de 87,7 e 190,0 µM, tendo a quercetina como controle positivo (CI50 de 7,64 e 3,12 µM para os radicais DPPH e ABTS, respectivamente).

O estudo químico das flores de P. nitens culminou no isolamento de onze substâncias de três classes químicas distintas: flavonóides (flavonóis, diidroflavonóis e catequinas), derivados do ácido cinâmico e alcalóides. Dentre esses, somente as substâncias 10 e 11 já haviam sido relatadas como pertencentes ao metaboloma de P. nitens. Este trabalho permitiu concluir ainda que os metabólitos secundários acumulados nas flores desta espécie são predominantemente de natureza fenólica. A descrição dos constituintes acumulados em P. nitens é também de grande valia tendo em conta que sua madeira vem sendo empregada indiscriminadamente pela construção civil e, por tratar-se de um gênero monoespecífico, esta leguminosa está seriamente ameaçada de extinção.2

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN de 1H e 13C e experimentos bidimensionais foram realizados em espectrômetro Varian INOVA-500® operando a 500 MHz para o núcleo de 1H e 125 MHz para o núcleo de 13C, TMS foi utilizado como referência interna. Os dados de rotação óptica foram obtidos em polarímento Polamat A Carl Zeiss Jena®. As análises por CLAE no modo analítico foram realizadas em equipamento ProStar/Varian® acoplado ao detector ProStar 330® de arranjos de diodos, utilizando coluna analítica Phenomenex® Fenil-Hexila (250 x 4,60 mm; 5 µm). No modo preparativo, as análises por CLAE foram realizadas em equipamento ProStar/Varian® acoplado ao detector ProStar-UV®, utilizando-se coluna Phenomenex Fenil-Hexila (250 x 21,2 mm; 10 µm). Nas separações em coluna aberta foram utilizadas gel de sílica derivatizado C-18 (40-63 µm, Merck®), gel de sílica para cromatografia flash (35-70 µm) e para cromatografia de exclusão molecular (Sephadex,® LH-20). As análises por cromatografia em camada delgada foram realizadas com cromatoplacas de gel de sílica G60 (0,25 mm). Após o desenvolvimento das cromatoplacas estas foram visualizadas sob luz ultravioleta (l = 254 e 365 nm) e reveladas com solução de anisaldeído em ácido sulfúrico seguido de aquecimento.

Material vegetal

As flores de P. nitens foram coletadas no Instituto de Botânica, São Paulo – SP, no mês de abril de 2003, pela Dra. M. C. M. Young. O material botânico foi identificado como sendo Pterogyne nitens (Fabaceae – Caesalpinoideae) pela Dra. I. Cordeiro, do mesmo Instituto. Uma exsicata (SP204319) encontra-se depositada no herbário "Maria Eneida P. Kaufmann" do Instituto de Botânica, São Paulo - SP.

Extração e isolamento

As flores (1,8 kg) foram secas à temperatura ambiente por 15 dias e, posteriormente, submetidas à moagem empregando moinho de facas. O pó obtido (1,5 kg) foi levado à maceração empregando hexanos e posteriormente maceração em etanol. Após evaporação, o extrato hexânico (3,8 g) foi analisado por RMN de 1H e CCDC mostrando tratar-se de uma mistura complexa de terpenos. O extrato etanólico (15,0 g) foi dissolvido em uma mistura de metanol:água (7:3) e posteriormente submetido à partição líquido-líquido empregando acetato de etila e n-butanol.

A fração AcOEt (3,8 g) foi submetida à cromatografia em coluna de permeação em gel (Sephadex®, LH-20, 180 x 5 cm), eluída em MeOH, obtendo-se 25 subfrações de 75 mL. A subfração AcOEt-17 (143,0 mg) foi submetida à cromatografia flash em coluna de gel de sílica (28 x 3 cm), eluída em modo gradiente (CHCl3:MeOH, 100 a 50%), obtendo-se os ácidos cafeico (1; 12, 0 mg), ferúlico (2; 14,0 mg) e sinápico (3, 7,0 mg). A subfração AcOEt-20 (79 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de fase reversa (8 x 3 cm) empregando misturas de MeOH:H2O (30 a 80%), resultando no isolamento de dois flavonóides, taxifolina (6, 14 mg) e ourateacatequina (8, 15 mg).

A fração n-butanólica (3,0 g) foi submetida à cromatografia por exclusão molecular (LH-20, Sephadex, 180 x 5 cm) eluída em MeOH, resultando em 22 subfrações de 70 mL. A subfração BuOH-7 (280 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de gel de sílica (28 x 4 cm), eluída em misturas de CHCl3:MeOH (10 a 30%), obtendo-se dois alcalóides guanidínicos, pteroginina (10, 98 mg) e pteroginidina (11, 90 mg). A subfração BuOH-12 (120 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de fase reversa (10 x 3 cm), eluída em MeOH:H2O (1:1), obtendo-se astilbina (7, 27 mg). A subfração BuOH-18 (97 mg) foi submetida à CLAE-UV preparativo [MeOH:H2O (56:44), l = 254 nm, fluxo = 11,0 mL/min), culminando no isolamento do flavonol glicosilado (9, 18 mg).

A fração hidroalcoólica (1,7 g) foi inicialmente submetida à cromatografia de permeação em gel (Sephadex®, LH-20, 120 x 8 cm), eluída em MeOH, obtendo-se 13 subfrações de 35 mL. A subfração HA-5 foi identificada como ácido gálico (5, 11 mg) e a subfração HA-12, como sendo o ácido 5-O-cafeoilquínico (4, 22 mg).

Atividades antioxidante e inibitória sobre mieloperoxidase (MPO)

Para os ensaios em CCD reveladas com b-caroteno, as amostras foram eluídas e reveladas com uma solução diclorometânica de b-caroteno a 0,02%. Após revelação, a cromatoplaca foi mantida à exposição de luz solar até total perda de coloração. Os pontos que mantiveram a coloração laranja indicaram a presença de substâncias antioxidantes.21 Os ensaios de capacidade seqüestradora de radicais livres realizados para as substâncias 10 e 11 seguiram protocolos relatados na literatura com pequenas modificações.22

A atividade inibitória sobre MPO das substâncias 1-11 foi avaliada segundo o método de oxidação do guaiacol. O meio reacional constituído de uma mistura de MPO (8,0 nM), peróxido de hidrogênio (0,3 mM) e guaiacol (70 mM) foi utilizado para a avaliação da ação de MPO na presença das substâncias em estudo e do controle positivo quercetina. As substâncias foram dissolvidas em DMSO nas concentrações 0,50; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 e 100 nM. Após o tempo de reação (4 h), o meio reacional foi lido em espectrofotômetro (470 nm). A atividade inibitória foi expressa em CI50, valor calculado a partir da plotagem de um gráfico correlacionando velocidade inicial versus absorbância, obtendo-se, assim, as curvas concentração-resposta.23

 

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Programa BIOTA-FAPESP (Instituto Virtual da Biodiversidade, www.biota.org.br), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). L. O. Regasini e D. C. Fernandes agradecem à FAPESP pelas bolsas, respectivamente, de Doutorado e Iniciação Científica concedidas.

 

REFERÊNCIAS

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Recebido em 15/1/08, aceito em 17/3/08, publicado na web em 23/4/08

 

 

# Em homenagem à Profa. Helena Maria C. Ferraz
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