Alcalóides e outros metabólitos do caule e frutos de Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil

Alkaloids and other metabolites from stems and fruits of Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil

Rutaceae; alkaloids

Zanthoxylum tingoassuiba

ARTIGO

Alcalóides e outros metabólitos do caule e frutos de Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil

Alkaloids and other metabolites from stems and fruits of Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil

Cinara Vasconcelos da SilvaI, ^*; Cássia Britto Detoni^I; Eudes da Silva Velozo^I; Maria Lenise da Silva Guedes^II

^IDepartamento do Medicamento, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Rua Barão de Jeremoabo, s/n, 40170-115 Salvador - BA, Brasil

^IIHerbário Alexandre Leal Costa, Instituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia, Rua Barão de Jeremoabo, s/n, 40170-115 Salvador - BA, Brasil

ABSTRACT

Phytochemical investigation of this species, popularly known as tinguaciba and used in traditional medicine to various diseases, resulted in the isolation of 15 substances: 2 alkaloids - norchelerythrine and arnottianamide; 1 lignan - sesamin; 4 terpenoids - citronellyl acetate, lupeol, α-bisabolol and spatulenol; 5 coumarins described for the first time - xanthotoxin, isopimpinelin, O-prenylumbelliferone, imperatorin and aurapten, 1 protoalkaloid - methyl N-methylanthranilate and 2 steroids - stigmasterol and β-sitosterol. The structures of the compounds were elucidated by spectroscopic analyses and compared with literature data.

Keywords: Rutaceae; Zanthoxylum tingoassuiba; alkaloids.

INTRODUÇÃO

A espécie Zanthoxylum tingoassuiba A. St. Hil. (Rutaceae), possuidora de sinonímias como Zanthoxylum articulatum Engl., Xanthoxylum tingoassuiba ou Fagara tingoassuiba Hoene, foi descrita primeiramente por Saint Hilaire em 1825 e era uma das mais de 710 plantas medicinais presentes na Farmacopéia Brasileira 1ª. edição (1926). Encontrava-se distribuída nos estados da Bahia, Pernambuco, Maranhão, Amazonas, Minas Gerais, Rio de Janeiro, Goiás e São Paulo. Atualmente, porém, esta espécie do gênero Zanthoxylum encontra-se extinta em vários destes estados.^1,2

Zanthoxylum tingoassuiba é popularmente conhecida como casca preciosa, tinguaciba-da-restinga, tinguaciba, limão-bravo, laranjeira-do-mato, mamica-de-porca ou limãozinho. A casca do seu caule é utilizada na medicina tradicional, na forma de chás ou infusões, como antiespasmódico, relaxante muscular, analgésico, sudorífero, antifúngico, diurético, anti-hipertensivo, antiagregação plaquetária, antiparasitário para Ascaris lumbricoides, Taenia sp, Trichiuris trichiura e Shistossoma sp, além de antiinflamatório para infecções de garganta.³

Esta planta tem sido comercializada desde 1923, pelo Laboratório Flora Medicinal J. Monteiro da Silva, como componente de um medicamento fitoterápico, em associação com abútua (Chondrodendron platyphyllum A. St. Hill. Miers), denominado Uva do Mato® e indicado para cólicas, espasmos da musculatura estriada e mialgias.

O primeiro estudo fitoquímico foi relatado por Antonaccio e Gottlieb,⁴ em um espécime de Z. tingoassuiba coletado no Rio de Janeiro em 1959. Os autores descreveram a presença do triterpeno lupeol (1) e da lignana sesamina (2) (Figura 1).

Estudo posterior desenvolvido por Pereira e colaboradores⁵ identificou o alcalóide benzofenantridínico nitidina, reputado por apresentar diversas atividades biológicas, inclusive anti-viral⁶ (3). Em 1961, Riggs et al.⁷ identificaram o alcalóide quaternário cloreto de 1-hidroxi-2,9,10-trimetoxi-N,N-dimetilaporfina (4) na casca do caule. Em 1978, Bernhard e Thiele⁸ descreveram o isolamento e purificação da tembamida (5) e, em 1987, Menezes e Pereira⁹ estudaram o efeito bloqueador neuromuscular do alcalóide aporfínico (4) (Figura 1).

O presente trabalho é o primeiro relato de estudo fitoquímico dos frutos e caule de Z. tingoassuiba, coletada no semi-árido do estado da Bahia.¹⁰

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato hexânico do caule de Z. tingoassuiba, após fracionamento cromatográfico em coluna simples, tendo como fase estacionária sílica gel 60, forneceu um sólido amorfo que se revelou positivo para os reagentes de Dragendorff e iodocloroplatinato, indicando tratar-se de substâncias nitrogenadas. A purificação deste material por cromatografia em camada delgada preparativa permitiu a identificação do alcalóide arnotianamida (6). O tipo estrutural e padrão de substituição foram determinados pelo espectro de RMN de ¹H, no qual estavam presentes sinais característicos dos hidrogênios benzofenantridínicos na região aromática, formando quatro dupletos com acoplamento orto: H-4 [6: δ_H 7,33 (d, J= 8,4 Hz)] e H-3 [6: δ_H 7,80 (d, J= 8,4 Hz)], H-5' [6: δ_H 6,56 (d, J= 8,4 Hz)] e H-6' [6: δ_H 6,82 (d, J= 8,4 Hz)]. A oxidação do heterociclo foi observada através do hidrogênio de aldeído [6: δ_H 8,16 (s)]. Demais sinais no espectro de RMN de ¹H apontaram a presença do grupo metilenodioxi [6: δ_H 6,08 (s)], duas metoxilas [6: δ_H 3,96 (s) e 3,91 (s)] e uma N-metila [6: δ_H 2,99 (s)].

Os dados de RMN ¹³C, apresentados na Tabela 1, foram consistentes com aqueles registrados na literatura para a arnotianamida.^11,12

O extrato metanólico do caule foi alcalinizado e extraído com hexano e clorofórmio. A fração hexânica revelou teste positivo para os reagentes de Dragendorff e iodocloroplatinato, indicando a presença de alcalóides. O fracionamento e purificação por cromatografia líquida clássica deste material possibilitaram a identificação da benzofenantridina norqueleritrina (17). Assim como na substância anterior, o espectro de RMN de ¹H de 17 apresentou 4 dupletos, integrando para 4 hidrogênios correspondentes aos H-9 e H-10; H-11 e H-12, com constantes de acoplamento J=9,0 Hz. O hidrogênio ligado ao C-6, em posição a ao nitrogênio, apareceu bastante desprotegido [17: δ_H 9,77 (s)], bem como o H-4 [17: δ_H 8,77 (s)]. Observou-se ainda no espectro a presença de um grupamento metilenodioxi [17: δ_H 6,17 (s)], além de duas metoxilas [17: δ_H 4,15 (s) e δ_H 4,13 (s)]. No espectro de RMN ¹³C foram observados como característicos deste alcalóide, os sinais: 101,0 (OCH₂O), 62,0 (OCH₃), 56,8(OCH₃).¹³

Após fracionamento por cromatografia em coluna simples, o extrato diclorometânico dos frutos de Z. tingoassuiba forneceu o protoalcalóide N-metilantranilato de metila (9). Seu espectro de RMN de ¹H revelou os sinais dos hidrogênios aromáticos atribuídos a: H-6 - um duplo dupleto em δ 7,88 (J= 6,8 e 1,8 Hz); H-5 - um tripleto em δ 6,58 (J= 6,8 Hz); H-4 - um multipleto em δ 7,35 e H-3 - um dupleto em δ 6,67 (J= 8,7 Hz). O simpleto encontrado em δ 3,84 correspondeu aos três hidrogênios do carbono metílico (C-8). Já o simpleto em δ 2,90 foi atribuído aos hidrogênios da N-metila.¹⁴ O espectro de RMN de ¹³C exibiu dois sinais: um em δ 168,9, referente ao carbono carboxílico (C-7) e o outro em δ 151,8 do carbono quaternário ligado ao grupamento N-metila (C-2).

As cumarinas aurapteno (7-geraniloxicumarina) (13) e O-prenilumbeliferona (7-preniloxicumarina) (14) foram encontradas nos extratos metanólico e diclorometânico dos frutos, após processo de separação fitoquímica por cromatografia líquida clássica com sílica gel como fase estacionária. Estas substâncias apresentaram em seus esqueletos, o padrão de substituição comum às cumarinas simples: a presença do oxigênio em C-7.¹⁵ A análise de seus espectros de RMN ¹H permitiu observar dois dupletos em δ 7,64 e 6,18 (J=9,3 Hz) referentes aos hidrogênios da dupla ligação C-4 e C-3, respectivamente, e a presença de três sinais distintos na região aromática correspondentes aos hidrogênios H-5 (δ 7,35 d, J=9,5 Hz), H-6 (δ 6,80 dd, J=8,4 e 2,1 Hz) e H-8 (δ 6,77, J=2,1 Hz). Observou-se ainda o dupleto em δ 4,51 (2H, J=6,7 Hz), referente ao hidrogênio H-1' do carbono ligado ao oxigênio em C-7, além de sinais de H-2' (δ5,41 t, J=6,5 Hz) (Tabela 2).

A diferença entre estes compostos evidenciou-se pela ausência dos sinais H6' (δ 5,05 m), e dos sinais de carbono em δ 123,5 e 131,7 nos espectros de RMN de ¹H e ¹³C. Apesar de ambas as substâncias serem bem descritas e comuns em Rutaceae, este é o primeiro relato do composto 7-preniloxicumarina (14) no gênero Zanthoxylum.^16-18

Foram encontradas ainda nos frutos de Zanthoxylum tingoassuiba as furanocumarinas lineares - imperatorina (10), isopimpinelina (11) e xantotoxina (12);¹⁸ o lupeol (1);^19,20; a sesamina (2)²¹ e os fitoesteróides estigmasterol (15) e β-sitosterol (16)^20,22,23 através dos dados fornecidos pelos espectros RMN ¹H, ¹³C e DEPT-135, comparados com valores descritos na literatura.

No óleo extraído do caule de Z. tingoassuiba com hexano, foram identificados por CG/EM, os compostos espatulenol - IK1551 (7), α-bisabolol - IK1686 (8) e acetato de citronelila - IK1346 (18), baseando-se para isto, nos índices de retenção em CG, comparação computadorizada dos espectros de massas adquiridos com aqueles armazenados nas bibliotecas de espectros e com outros espectros de massas da literatura, nas condições de Adams.²⁴

O presente estudo possibilitou a identificação de metabólitos secundários relatados pela primeira vez na espécie Zanthoxylum tingoassuiba, a exemplo de N-metilantranilato de metila, cumarina O-prenilada: aurapteno e as furanocumarinas: isopimpinelina, xantotoxina e imperatorina. Este também foi a primeira descrição da cumarina O-prenilumbeliferona no gênero Zanthoxylum.

As furanocumarinas lineares e alcalóides benzofenatridínicos são freqüentemente associados com as Rutaceae mais primitivas, as proto-Rutaceae, denominação dos gêneros Zanthoxylum (o único encontrado no Brasil), Phellodedron e Tetradium, e podem ser considerados marcadores quimiotaxonômicos deste grupo.²⁵ O perfil químico da Zanthoxylum tingoassuiba estudada, portanto, assemelha-se ao de outras espécies do gênero e condiz com seu uso etnobotânico.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN de ¹H (300 MHz), ¹³C (75 MHz) e DEPT 135° foram obtidos nos espectrômetros Varian Gemini 300 e Mercuri 300. Os espectros de massas foram registrados por impacto eletrônico (70 eV) em CG-EM- Perkin Elmer, equipado com coluna capilar (30 m x 0,25 mm x 0,1 mm) e T_inj 60 °C com elevação de 3 °C/min até 240 °C e depois 10 °C/min até 280 °C com tempo total de análise de 100 min. Os cromatogramas foram revelados através de irradiação de lâmpada UV nos comprimentos de onda de 254 e 366 nm, vapores de iodo e reveladores químicos como Dragendorff, iodocloroplatinato e vanilina/ácido sulfúrico. Nas separações cromatográficas em coluna foram usadas sílica gel 60 (70-230 mesh/0,063-0,200 mm/40-63 mm) das marcas Merck e Vetec.

Material botânico

O caule de Z. tingoassuiba A. St. Hil. foi coletado no distrito de Jaíba, em Feira de Santana, Bahia, em 8/4/2004 e os frutos, em 12/3/2005, no mesmo local. Este material foi identificado no Herbário Alexandre Leal Costa (ALCB), Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia; e suas exsicatas encontram-se catalogadas no ALCB, sob os números 66983 e 67894, respectivamente.

Extração e isolamento

Cerca de 7,2 kg do caule seco e triturado foram submetidos a extrações sucessivas com hexano e metanol (3 x 5,0 L/solvente) em temperatura ambiente.

Os extratos dos frutos frescos imaturos foram obtidos por maceração a frio, partindo-se de 197,0 g de material e utilizando como solventes extratores 1,5 L de diclorometano e 1,5 L de metanol em 3 extrações para cada solvente. Todos os extratos foram concentrados sob pressão reduzida.

Uma alíquota de 50,0 g do extrato hexânico do caule foi submetida a uma coluna filtrante, utilizando como eluentes benzina de petróleo, hexano (Hex), diclorometano (CH₂Cl₂), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH). A fração hexânica foi separada por cromatografia em coluna (CC) com o sistema Hex/AcOEt em misturas de polaridade crescente. Este procedimento resultou em 27 frações. As frações 13, 21 e 26 foram purificadas por cromatografia em coluna e cromatografia em camada delgada preparativa, fornecendo as substâncias 1 - lupeol (372,6 mg), 2 - sesamina (22,6 mg) e 6 - arnotianamida (18,6 mg), respectivamente.

Aproximadamente 50 g do extrato metanólico do caule foi particionado com hexano, clorofórmio, metanol e ácido acético. A fração hexânica, de massa 1,37 g foi submetida à CG-EM, obtendo-se quatro substâncias: 7 - espatulenol , 8 - -bisabolol, 9 - N-metilantranilato de metila e 18 - acetato de citronelila.

Com o objetivo de isolar alcalóides quaternários, 200 g do extrato metanólico do caule foram tratados com 100 mL de KOH a 10% (p/v) e extraídos com hexano e clorofórmio. A fração hexânica resultou em um resíduo de 820 mg, que foi submetido a uma CC, utilizando CH₂Cl₂/MeOH em gradiente crescente de polaridade.^25,26 A fração 6 (20 mg) desta coluna resultou na substância 17 - norqueleritrina (20 mg).

O extrato diclorometânico dos frutos (3,87 g) foi fracionado em coluna cromatográfica, utilizando misturas de CHCl₃/MeOH em gradiente de polaridade como fase móvel. Este procedimento resultou em 24 frações. As frações 3, 8, 11 e 13 foram purificadas por cromatografia líquida clássica, utilizando o mesmo sistema do fracionamento do extrato diclorometânico e foram identificadas como as substâncias 9 - N-metilantranilato de metila (198,6 mg), 13 - aurapteno (26,7 mg), 11 - isopimpinelina (23,1 mg) e 12 - xantotoxina (68 mg), respectivamente.

O extrato metanólico dos frutos (23,25 g) foi submetido a uma separação cromatográfica em coluna de média pressão, utilizando como eluente a mistura de clorofórmio e metanol, em ordem crescente de polaridade. A fração 6 (169,7 mg) foi separada em coluna isocrática, eluída com clorofórmio e resultou na mistura 15 - estigmasterol e 16 - β-sitosterol (22,9 mg), além de 14 - O-prenilumbeliferona (20,4 mg). A fração 10 foi purificada e resultou em 10 - imperatorina (21 mg).

AGRADECIMENTOS

À CAPES, FAPESB, ao CNPq e Banco do Nordeste pelas bolsas e apoios financeiros concedidos.

Recebido em 19/2/08; aceito em 20/6/08; publicado na web em 10/11/08

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jan 2009
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  20 Jun 2008
• Recebido
  19 Fev 2008