Experimento didático sobre cromatografia gasosa: uma abordagem analítica e ambiental

Didactic experiment on gas chromatography: an environmental and analytical approach

benzene; internal standard; contamination

EDUCAÇÃO

Experimento didático sobre cromatografia gasosa: uma abordagem analítica e ambiental

Didactic experiment on gas chromatography: an environmental and analytical approach

José Carlos P. Penteado^*; Dulce Magalhães; Jorge C. Masini

Instituto de Química, Universidade de São Paulo, CP 26077, 05513-970 São Paulo - SP, Brasil

ABSTRACT

This paper describes an experiment to teach the principles of gas chromatography exploring the boiling points and polarities to explain the elution order of a series of alcohols, benzene and n-propanone, as well as to teach the response factor concept and the internal standard addition method. Retention times and response factors are used for qualitative identification and quantitative analysis of a hypothetical contamination source in a simulated water sample. The internal standard n-propanol is further used for quantification of benzene and n-butanol in the water sample. This experiment has been taught in the instrumental analysis course offered to chemistry and oceanography students.

Keywords: benzene; internal standard; contamination.

INTRODUÇÃO

Entre os métodos de separação, a cromatografia tem grande aplicabilidade em áreas tão diversas como ambiental, farmacêutica, análises clínicas, medicina legal e outras. A cromatografia permite separar e quantificar componentes com características físico-químicas muito semelhantes, tais como dioxinas e furanos,¹ em misturas complexas. O limite de detecção obtido pela cromatografia pode ser cerca de 100 a 1000 vezes menor que aquele obtido por outros métodos de separação.²

O processo de separação ocorre através da distribuição dos componentes da amostra entre duas fases: uma fase fixa de grande área superficial (fase estacionária), que é percolada por um fluido (fase móvel) em uma direção definida.³ A fase móvel pode ser um gás inerte, um líquido ou um fluido supercrítico, dependendo do tipo de cromatografia utilizada. A fase estacionária deve ser imiscível com a fase móvel, podendo ser colocada numa coluna ou depositada em uma superfície plana. As fases móvel e estacionária são escolhidas de modo que os componentes da amostra se distribuam entre elas de modo distinto. Os analitos fortemente retidos pela fase estacionária movem-se mais lentamente na fase móvel e, conseqüentemente, são eluídos posteriormente aos componentes com baixa interação com a fase estacionária. Essa retenção seletiva dos componentes da amostra pela fase estacionária é uma importante característica e resulta em migrações diferenciadas dos compostos de interesse. De acordo com o estado físico da fase móvel utilizada, a cromatografia em coluna pode ser classificada em cromatografia gasosa (gás inerte), cromatografia líquida⁴ (líquido) ou cromatografia com fluido supercrítico (fluido no estado supercrítico).^3,5

Com mais de um século de existência, a cromatografia, iniciada por Michael S. Tswett,⁶ participou direta ou indiretamente de pesquisas que foram laureadas com 12 prêmios Nobel (1937 a 1972).³

Cromatografia gasosa

A cromatografia gasosa^8,9 é uma das mais importantes técnicas analíticas disponíveis atualmente. Em curto espaço de tempo tornou-se a principal técnica para separação e determinação de compostos voláteis e/ou volatilizáveis. O poder de resolução excelente alcançado permite a determinação de dezenas de compostos diferentes em matrizes complexas.¹⁰ Outro diferencial da técnica vem a ser sua grande sensibilidade e elevada detectabilidade. Por exemplo, o limite de detecção para o pesticida halogenado Lindane pode atingir valores tão baixos quanto 10^-16 mol mL^-1 empregando-se o detector de captura de elétrons.¹¹ A cromatografia gasosa pode ser aplicada em amostras gasosas, líquidas ou sólidas, desde que os analitos sejam voláteis ou possam ser volatilizados sem sofrer decomposição térmica.

A cromatografia gasosa classifica-se, de acordo com a natureza da fase estacionária, em cromatografia gás-sólido (CGS) e cromatografia gás-líquido (CGL). A fase estacionária pode ser um sólido (CGS) ou um líquido imobilizado sobre um suporte inerte (CGL), sendo que a CGL é a mais versátil e seletiva forma de cromatografia a gás, devido à grande diversidade de fases líquidas disponíveis.

Em linhas gerais, os principais componentes de um cromatógrafo a gás são: cilindro de gás, injetor, forno, coluna, detector, sistema de controle do instrumento e aquisição de dados.

Inicialmente a amostra é introduzida no injetor aquecido (com o auxílio de uma micro-seringa), onde é vaporizada e transferida com o auxílio do gás de arraste para a coluna cromatográfica colocada dentro de um forno pré-aquecido. Os componentes da amostras são eluídos e conduzidos para o detector conectado na saída da coluna. O detector emite um sinal elétrico que é registrado graficamente sob a forma de picos.

Trabalhos didáticos envolvendo cromatografia gasosa redigidos em língua portuguesa têm sido pouco explorados neste periódico. Com o intuito de colaborar com a divulgação e ensino da cromatografia, apresentamos uma proposta de experimento para a disciplina de análise instrumental com enfoque na introdução à cromatografia gasosa para alunos de graduação em Química e áreas correlatas. Este experimento explora a investigação da contaminação por solventes orgânicos em águas. Para isso, os alunos deverão investigar quatro fontes de contaminação em duas amostras de água. Entre os solventes adicionados destaca-se o benzeno, uma substância reconhecidamente carcinogênica, considerada a quinta substância de maior risco, segundo os critérios do programa das Nações Unidas.⁷

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentação

Foi utilizado o cromatógrafo a gás modelo Varian GC-3800 (Palo Alto, CA, USA) com detector de ionização em chama (250 ºC), injetor (250 ºC) com divisão de fluxo na razão 1:25, coluna capilar HP-Innowax (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) (J&W, USA) empregando N₂ como gás de arraste, com fluxo constante de 1 mL min^-1. A temperatura inicial foi de 80 ºC (1 min), seguida por taxa de aquecimento de 10 ºC min^-1 até 120 ºC, com tempo total de corrida de 6 min. O volume de injeção foi igual a 1,0 µL. A aquisição e o processamento de dados foram feitos com o programa Star Advanced versão 4.52 da Varian.

Reagentes e soluções

Todos os reagentes utilizados (isobutanol, n-propanol, n-propanona, benzeno, n-pentanol) foram procedentes da Merck Brasil (Rio de Janeiro, RJ, Brasil) com teores maiores que 98%. A água desionizada foi obtida pelo sistema Milli-Q, apresentando resistividade maior que 18 MΩ cm^-1. Foram preparadas as seguintes misturas de soluções de referência, conforme mostrado na Tabela 1: A - isobutanol (500 mg L^-1) e n-pentanol (500 mg L^-1); B - n-propanona (500 mg L^-1) e n-pentanol (500 mg L^-1); C - benzeno (350 mg L^-1 ) e n-butanol (81 mg L^-1); D - benzeno (88 mg L^-1) e n-butanol (324 mg L^-1); padrão interno (PI) n-propanol (500 mg L^-1) e as amostras W - benzeno (175 mg L^-1) e n-butanol (40 mg L^-1) e H - benzeno (44 mg L^-1) e n-butanol (162 mg L^-1).

Procedimentos

Este experimento se compõe das etapas qualitativa e quantitativa, sendo que a primeira se baseia na identificação dos compostos utilizando o tempo de retenção, enquanto a segunda etapa consiste na determinação da concentração dos analitos a partir das áreas de pico.

Etapa qualitativa

Foram injetadas, seqüencialmente, 1,0 µL das soluções A, B, C, D, W e H diluídas na razão de 1:10 em água desionizada. A seguir foram atribuídos os picos observados nos cromatogramas de cada solução. A identificação de cada componente foi realizada pelos seus respectivos tempos de retenção (t_r), que representam o tempo gasto desde o momento da injeção até a saída do ponto máximo do pico.

Etapa quantitativa

Com auxílio de uma pipeta volumétrica transferiu-se 1,00 mL da solução C e 1,00 mL da solução de PI (500 mg L^-1) para um balão volumétrico de 10 mL, completando o volume com água desionizada. O mesmo procedimento foi repetido para as soluções D, W e H. Um volume de 1,0 µL de cada uma destas soluções foi injetado seqüencialmente no cromatógrafo a gás para a determinação das áreas de pico correspondentes a cada um dos analitos, previamente identificados pelos respectivos tempos de retenção.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Etapa qualitativa

Os resultados de tempo de retenção médios obtidos na etapa qualitativa são apresentados na Tabela 1 em comparação com a composição das soluções, bem como com os pontos de ebulição e constantes dielétricas dos componentes das misturas. Observa-se que a cromatografia gasosa é uma técnica com grande aplicação na determinação simultânea de compostos voláteis e semi-voláteis, tais como álcoois,¹² cetonas e hidrocarbonetos. A separação cromatográfica das diferentes famílias de compostos orgânicos foi possível devido às características físico-químicas dos analitos, tais como ponto de ebulição e constante dielétrica,¹³ parâmetro este que é relacionado com a polaridade das substâncias e que determina a afinidade pela fase estacionária (polar, no presente experimento). Entre todos os componentes, a n-propanona é o primeiro componente a ser eluído apesar de apresentar a constante dielétrica mais elevada. Este fato ocorre devido principalmente a sua alta volatilidade (56,05 ºC). O segundo componente é o benzeno, que, entre os compostos estudados, é o mais apolar (ε 2,28). Essa característica faz com que tenha baixa afinidade pela fase estacionária (polar), sendo eluído rapidamente. A partir do benzeno, temos o grupo dos alcoóis com 3 a 5 átomos de carbono na cadeia principal. Esses alcoóis têm características polares (ε 15,13 -20,8), sofrendo uma maior interação com a fase estacionária. Entretanto, para estes alcoóis, o ponto de ebulição vem ser a característica dominante na ordem de eluição.

Na solução A (isobutanol e n-pentanol), o primeiro componente a ser eluído é o isobutanol. O isobutanol apresenta maior constante dielétrica que o n-pentanol, de modo que, baseando-se apenas nos dados de polaridade, se esperaria que o isobutanol fosse o último composto a ser eluído da coluna. Entretanto, o ponto de ebulição do isobutanol é cerca de 30 ºC menor que o n-pentanol, de modo que para compostos cuja diferença de polaridade não seja elevada, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição. No caso da solução B (n-propanona e n-pentanol), a n- propanona é o primeiro componente a ser eluído, seguido pelo n-pentanol. Com base apenas na polaridade, a n-propanona deveria ser eluída por último, pois apresenta uma constante dielétrica maior que o n-pentanol e, portanto, possui uma maior afinidade com a fase estacionária. No entanto, é eluída primeiro, pois seu ponto de ebulição é cerca de três vezes menor que o do n-pentanol. Em relação às soluções C, D, W e H (benzeno e n-butanol), o benzeno é eluído antes do n-butanol. Nesse caso os valores de constante dielétrica e ponto de ebulição justificam a ordem de eluição, pois o benzeno é menos polar e tem ponto de ebulição menor que o n-butanol.

O princípio do funcionamento do detector de ionização de chama (DIC) baseia-se na combustão dos compostos na chama. Os compostos não suscetíveis à combustão, como água, CO₂ e compostos inorgânicos em geral, não apresentam sinal mensurável neste detetor.³ O sinal elétrico enviado pelo detector é registrado graficamente sob a forma de pico, cuja área é proporcional à concentração do analito. O perfil cromatográfico da solução C e da amostra W, bem como da solução D e amostra H são semelhantes (Figura 1). Na Figura 1a, o pico com maior intensidade vem a ser o benzeno (solução C e amostra W), enquanto que na Figura 1b isso ocorre com o n-butanol (solução D e amostra H). Essa observação pode ser constatada numericamente na Tabela 2, onde estão descritos os resultados das áreas obtidas nos cromatogramas e as relações de áreas entre benzeno e n-butanol para as soluções C e D e as amostras W e H. Uma vez que a relação de área entre o benzeno e o n-butanol da solução C é 7,49, pode-se inferir que é esta a fonte de contaminação da amostra W, para a qual a relação de área destes dois compostos é de 7,53. De modo similar, pode se inferir que a solução D (relação 0,47) é a fonte de contaminação da amostra H (relação 0,40).

Etapa quantitativa

A quantificação dos analitos foi feita pelo método de adição de padrão interno, que consiste em adicionar uma quantidade conhecida de uma substância (padrão interno) na amostra a ser analisada e no padrão, relacionando então as duas áreas obtidas.¹⁴ O padrão interno aumenta a precisão dos resultados ao minimizar as incertezas introduzidas especialmente pela injeção da amostra, mas também por variações de vazão e das condições da coluna.^15-17 Neste experimento o padrão interno selecionado foi o n-propanol cujo tempo de retenção está depois do benzeno e n-butanol.

A Tabela 2 mostra os resultados obtidos dos fatores de resposta dos analitos benzeno e n-butanol para os padrões C e D e as concentrações calculadas para as amostras W e H.

Concentrações nas amostras W e H

A determinação das concentrações de benzeno e n-butanol foi feita a partir da adição de padrão interno, no caso n-propanol, na concentração de 500 mg L^-1. Para isso, a primeira etapa envolve a obtenção do chamado fator de resposta (F) do detector para os dois analitos, o qual é definido como:¹⁸

onde A_P e C_P são a área de pico e concentração de um padrão do analito (benzeno ou n-butanol), obtidos com os cromatogramas das soluções C ou D, enquanto A_PI e C_PI são a área de pico e concentração do padrão interno (n-propanol 500 mg L^-1), respectivamente. De posse do fator de resposta, e reescrevendo a Equação 1, a concentração do analito na amostra pode ser calculada a partir da Equação 2:

onde C_x é a concentração do analito X na amostra desconhecida, F_X é o fator de resposta para este analito e A_X é a sua respectiva área de pico, obtida dos cromatogramas das soluções W ou H.

Embora teoricamente os fatores de respostas obtidos nas soluções padrões C e D devessem ser os mesmos, na prática houve uma diferença para o benzeno e n-butanol (Tabela 2). Essa variação ocorreu provavelmente devido a diferenças entre as concentrações dos analitos nas soluções C e D. Assim, o cálculo das concentrações dos analitos nas soluções das amostras W e H foi feito empregando os fatores de resposta das soluções de referência C e D, respectivamente.

As concentrações obtidas de benzeno e n-butanol nas amostras W e H foram próximas aos dos valores esperados, conforme mostrado na Tabela 2, indicando que o método de padronização interna foi eficiente na quantificação dos analitos. As concentrações de benzeno encontradas neste experimento são elevadas quando comparadas com alguns valores reportados na literatura.²⁰ Porém, recentemente foram divulgados acidentes desastrosos no Rio Songhua (China), onde ocorreram vazamentos de enormes quantidades de benzeno e nitrobenzeno.²¹ Este acidente afetou o abastecimento de milhões de habitantes tendo um custo estimado de remediação de US$ 3,8 bilhões.²²

CONCLUSÕES

O experimento proposto pode ser facilmente implementado em laboratórios de ensino de graduação em Química e áreas correlatas. Os pontos discutidos fornecem ao docente flexibilidade na abordagem didática e despertam o interesse dos alunos na aplicabilidade da cromatografia gasosa. Neste experimento foi feita uma simulação de contaminação de benzeno em água, pois em condições reais a concentração máxima de benzeno em água potável permitida pela legislação é de 5 µg L^-1 (CETESB).¹⁹

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPESP pelo apoio financeiro.

Recebido em 16/10/07; aceito em 16/4/08; publicado na web em 3/10/08

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  » link

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jan 2009
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  16 Abr 2008
• Recebido
  16 Out 2007