Biodegradação de fenol por uma nova linhagem de A spergillus sp. isolada de um solo contaminado do sul do Brasil

Biodegradation of phenol by a newly Aspergillus sp. strain isolated from a contaminated soil in southern Brazil

Resumo

The main goal of this work was to study the biodegradation of phenol in batch mode by a filamentous fungus isolated from a contaminated site in Southern Brazil. A better performance was obtained by previous adaptation of the microorganism to the toxic chemical. A 2³ experimental design was proposed and it could be observed total phenol degradation in 72 h using 500 mg L-1 glucose, inoculum of 20% and agitation of 200 rpm, resulting a biodegradation rate of 3.76 mg L-1 h-1. In relation to phenol tolerance, Aspergillus sp. LEBM2 was able to consume up to 989 ± 15 mg L-1.

bioremediation; filamentous fungi; phenol

bioremediation; filamentous fungi; phenol

ARTIGO

Biodegradação de fenol por uma nova linhagem de A spergillus sp. isolada de um solo contaminado do sul do Brasil

Biodegradation of phenol by a newly Aspergillus sp. strain isolated from a contaminated soil in southern Brazil

Cátia Tavares dos Passos; Janaína Fernandes de Medeiros Burkert; Susana Juliano Kalil; Carlos André Veiga Burkert^*

Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, CP 474, 96201-900 Rio Grande - RS, Brasil

ABSTRACT

The main goal of this work was to study the biodegradation of phenol in batch mode by a filamentous fungus isolated from a contaminated site in Southern Brazil. A better performance was obtained by previous adaptation of the microorganism to the toxic chemical. A 2³ experimental design was proposed and it could be observed total phenol degradation in 72 h using 500 mg L^-1 glucose, inoculum of 20% and agitation of 200 rpm, resulting a biodegradation rate of 3.76 mg L^-1 h^-1. In relation to phenol tolerance, Aspergillus sp. LEBM2 was able to consume up to 989 ± 15 mg L^-1.

Keywords: bioremediation; filamentous fungi; phenol.

INTRODUÇÃO

Fenol e seus derivados constituem uma importante classe de contaminantes ambientais pela sua presença em muitos efluentes industriais, incluindo refinarias, plantas petroquímicas, siderúrgicas, indústrias de cerâmicas e de resinas fenólicas, entre outros.¹ Embora sendo biodegradável tanto por via aeróbia como anaeróbia, o fenol é tóxico para a maioria dos microrganismos, principalmente não aclimatados, em concentração de apenas 10 mg L^-1, podendo ser inibidor do crescimento mesmo para as espécies que o utilizam como substrato, causando problemas em estações de tratamento de efluentes.² A resolução CONAMA nº 357, publicada em 18 de março de 2005, define como padrão de lançamento para efluentes industriais o teor de 0,5 mg L^-1 de fenóis totais,³ valor considerado baixo frente às concentrações geradas pelas indústrias. Portanto, a remoção eficiente de fenol de efluentes industriais é de grande importância para a proteção ambiental e novas estratégias têm sido propostas para atingir esta finalidade.

A bioaumentação por microrganismos autóctones selecionados constitui uma excelente alternativa para a biodegradação do fenol. Diversos autores têm mencionado o uso de microrganismos visando a remoção de fenol em efluentes industriais como, por exemplo, Penicillium,¹Aspergillus,^1,4 Graphium,^1,5 Candida,^6,7Pseudomonas,⁸Acinetobacter⁹ e Rhodococcus.¹⁰ No entanto, a prospecção de novas linhagens degradadoras, adaptadas a condições ambientais locais, e sua caracterização quanto à capacidade biodegradativa e tolerância à toxidade constituem aspectos importantes a serem ainda explorados. Para a avaliação da toxicidade e biodegradabilidade, os ensaios em batelada são úteis para classificar variáveis importantes, verificando seus efeitos no desempenho do microrganismo no processo biodegradativo.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a biodegradação do fenol por Aspergillus sp. LEBM2, verificando-se a influência da adaptação prévia do fungo, os efeitos dos parâmetros de cultivo em batelada e a tolerância ao fenol.

PARTE EXPERIMENTAL

Água residuária sintética

Os constituintes da água residuária sintética foram preparados na forma de soluções concentradas, sendo esterilizadas separadamente em autoclave (soluções de minerais e de glicose) e por filtração utilizando membrana Millipore de 0,22 µm (solução de fenol). Após as soluções foram misturadas, de forma a resultar na seguinte composição no início dos cultivos (mg L^-1): 400, KH₂PO₄; 200, MgSO₄.7H₂O; 100, NaCl; 25, CaCl₂.2H₂O; 3, MnSO₄.H₂O; 500, NH₄NO₃.H₂O; glicose e fenol em concentrações variáveis.

Microrganismo

Utilizou-se o fungo Aspergillus sp. LEBM2, isolado de um solo contaminado por hidrocarbonetos derivados de petróleo,¹¹ na região da cidade do Rio Grande, RS, Brasil, sendo mantido a 4 ºC, em ágar batata dextrose (PDA).

Influência da adaptação sobre a capacidade biodegradativa

Para obtenção dos diferentes inóculos, empregaram-se frascos erlenmeyer de 500 mL onde foram adicionados 150 mL de água residuária sintética contendo diferentes fontes de carbono: somente fenol (250 mg L^-1), glicose (250 mg L^-1) e fenol (250 mg L^-1) e somente glicose (250 mg L^-1).

Cada um destes frascos recebeu três unidades de 1 cm de diâmetro, provenientes do cultivo prévio do fungo em placas de Petri com PDA (sem adição de fenol) durante 5 dias a 25 ºC.¹²

Após incubação a 25 ºC por 7 dias, os diferentes inóculos obtidos foram transferidos para frascos erlenmeyers de 500 mL contendo água residuária sintética acrescida de 250 mg L^-1 de fenol como única fonte de carbono. O volume de inóculo correspondeu a 10% do volume total, de 150 mL. Paralelamente foi realizado um ensaio controle, sem a inoculação do microrganismo, para avaliar as perdas abióticas. Os experimentos foram realizados em triplicata, de forma estática (sem agitação), a 25 ºC.

Os resultados foram avaliados pela taxa de biodegradação de fenol (em mg L^-1 h^-1), obtida pelo acompanhamento da concentração do fenol ao longo do tempo, sendo esta determinada nas amostras previamente filtradas e diluídas, através do método baseado no uso do reagente de Folin-Ciocalteau,⁵ com posterior leitura de absorbância a 750 nm, utilizando uma curva de calibração de fenol na faixa de 0,25 a 10 mg L^-1.

Influência dos parâmetros de cultivo na biodegradação do fenol

Efetuou-se um planejamento fatorial completo envolvendo 3 variáveis (2³ ensaios mais três pontos centrais), visando aumentar a eficiência de biodegradação do fenol por Aspergillus sp. LEBM2. As variáveis estudadas foram: concentração de glicose (0 a 500 mg L^-1), agitação (0 a 200 rpm) e volume de inóculo (10 a 20%). Nos experimentos, foram acompanhadas as concentrações de fenol por Folin-Ciocateau⁵ e de glicose pelo método 3,5 DNS,¹³ e a resposta analisada foi a taxa de biodegradação de fenol.

O inóculo foi preparado conforme estabelecido na etapa anterior, sendo transferido para frascos erlenmeyer de 500 mL com água residuária sintética contendo fenol (250 mg L^-1) e glicose (concentração conforme planejamento experimental), totalizando um volume de 150 mL. A temperatura de todos os experimentos foi controlada a 25 ºC; os ensaios estáticos (0 rpm) foram conduzidos em estufa com circulação de ar e os experimentos realizados sob agitação (100 ou 200 rpm, conforme planejamento experimental) foram conduzidos em incubadora rotatória.

Avaliação da tolerância ao fenol

A partir da condição otimizada no planejamento experimental, foram realizados testes em triplicata para avaliar a tolerância do fungo filamentoso Aspergillus sp. LEBM2 na biodegradação em concentrações crescentes de fenol. Foram testadas concentrações acima de 500 mg L^-1, que foi o limite de tolerância estabelecido anteriormente para este microrganismo quando cultivado em placas de Petri, tendo o fenol como única fonte de carbono.¹¹

Análise estatística

Os dados obtidos foram tratados usando-se o software Statistica 5.0 (StatSoft, Inc.).

Resultados e discussão

A Figura 1 mostra as médias das concentrações de fenol ao longo do tempo e os desvios padrão obtidos para a degradação deste composto, utilizando-se diferentes substratos no preparo do inóculo. Mediante o ensaio controle verificou-se que não houve perdas abióticas significativas de fenol. A Figura 1 indica que a biodegradação foi mais rápida para o inóculo preparado com o substrato misto glicose e fenol, diminuindo o tempo para biodegradação total do fenol em 62 h. Comportamento similar foi observado por González et al.⁸ para a biodegradação de fenol por Pseudomonas putida.

Os resultados obtidos para taxa de biodegradação de fenol foram submetidos à análise de variância e comparação de médias utilizando o Teste de Tukey (p<0,05). A Figura 2 indica que a taxa de biodegradação obtida usando-se o inóculo preparado com o substrato misto glicose e fenol (0,67 ± 0,04 mg L^-1 h^-1) foi estatisticamente superior e diferente dos demais ensaios. As taxas de biodegradação obtidas com os inóculos preparados somente com glicose (0,44 ± 0,04 mg L^-1 h^-1 ) ou fenol (0,41 ± 0,02 mg L^-1 h^-1 ) não apresentaram diferenças significativas entre si.

A partir desses resultados pôde-se constatar que a etapa de adaptação do microrganismo ao fenol durante o preparo do inóculo é essencial. A adaptação aumenta a taxa de biodegradação e a tolerância ao fenol, tornando o processo biológico mais eficiente. Por outro lado, também a presença de glicose como fonte adicional de carbono, facilmente assimilável, garante produção inicial de biomassa para a biodegradação.

Os resultados para o planejamento experimental 2³ são apresentados na Figura 3 e Tabela 1, sendo que a taxa de biodegradação de fenol variou de 0,58 a 3,76 mg L^-1 h^-1.

Os resultados obtidos foram ajustados a um modelo de primeira ordem (Equação 1) para a taxa de biodegradação de fenol (r) em função das variáveis significativas codificadas X₁ (concentração de glicose) e X₃ (velocidade de agitação).

Com a análise de variância (ANOVA), apresentada na Tabela 2, onde as variáveis significativas foram acopladas ao resíduo,¹⁴ observa-se a validade do modelo pelo Teste F, que foi 109,65 vezes maior que o valor tabelado, obtendo-se coeficiente de correlação de 0,995. A partir destes dados gerou-se a superfície de resposta e a curva de contorno apresentadas na Figura 4.

De acordo com a superfície de resposta (Figura 4a) e curva de contorno (Figura 4b), o incremento na agitação em toda a faixa de concentração de glicose avaliada proporcionou um aumento efetivo da taxa de biodegradação de fenol. Por outro lado, o aumento da concentração de glicose até agitação de 65 rpm praticamente não influenciou a taxa de biodegradação. Porém, com agitações superiores a 100 rpm, incrementando a concentração de glicose de 0 até 500 mg L^-1 registraram-se taxas de biodegradação de fenol de aproximadamente 0,8 a 3,5 mg L^-1 h^-1. Portanto, a agitação foi um parâmetro fundamental para o desempenho do Aspergillus sp. LEBM2 no processo de biodegradação.

Admitindo-se que haja uma correlação entre a velocidade de agitação do meio e o fornecimento de oxigênio proveniente do ar, o efeito positivo da agitação pode ser explicado por favorecer o metabolismo aeróbio do fungo, estimulando o crescimento microbiano e, desta forma, contribuindo para o sucesso da biodegradação.

Pelo acompanhamento do consumo de glicose e fenol nos ensaios do planejamento experimental (Figura 3) verificou-se que o fungo consumiu preferencialmente o carboidrato. Após o consumo da glicose, o fenol continuou sendo consumido, confirmando que o Aspergillus sp. LEBM2 pode utilizá-lo em seu metabolismo como única fonte de carbono.

O incremento da taxa de biodegradação de fenol ao utilizar-se maior concentração de glicose no meio explica-se devido à glicose ser um composto preferencialmente assimilado pelos fungos, favorecendo a formação de biomassa, e sua presença no substrato não implica que outros compostos não possam ser utilizados. Apesar da repressão catabólica ser freqüentemente mencionada, fontes de carbono convencionais, como glicose, glutamato e extrato de levedura, podem aumentar a taxa de biodegradação de compostos aromáticos, sugerindo que sua presença diminui a toxicidade e o efeito inibitório sobre o crescimento celular exercido por compostos xenobióticos.¹⁵ Desta forma, esta habilidade de degradar fenol mesmo na presença de glicose implica na capacidade que o fungo tem de remover fenol em efluentes, solos e aqüíferos que contenham outras fontes de carbono mais facilmente assimiláveis.

Analisando a superfície de resposta (Figura 4a), a condição otimizada para minimização do tempo de biodegradação foi 500 mg L^-1 de glicose e 200 rpm de agitação, independente do volume de inóculo, conseguindo-se aumento de 6,28 vezes na taxa de biodegradação (ensaios 6 e 8) quando comparada ao ensaio menos eficiente. Sugere-se que seja utilizado volume de inóculo de 20% (ensaio 8), para garantir a eficiência do processo para maiores concentrações de fenol, uma vez que se trata de uma substância tóxica. Na Tabela 1 observa-se ainda que o modelo proposto prevê muito bem a taxa de biodegradação de fenol, principalmente na região ótima, onde apresenta desvios relativos inferiores a 2%.

A Figura 5a apresenta os resultados obtidos para a biodegradação de fenol utilizando diferentes concentrações deste componente, permitindo afirmar que houve aumento no tempo de biodegradação conforme incremento na concentração de fenol.

A biodegradação foi total até a concentração inicial de fenol de 989 ± 15 mg L^-1. Até esta concentração inicial, o fungo consumiu a glicose preferencialmente, mas simultaneamente ao fenol, para após consumir totalmente o fenol (Figuras 5a e 5b). Observa-se também na Figura 5b que, aumentando a concentração de fenol, a glicose foi consumida mais lentamente, demonstrando claramente o efeito inibidor do fenol sobre o metabolismo do fungo.

Como pode ser observado na Figura 6, não foi verificada diferença significativa na taxa de biodegradação de fenol entre as concentrações iniciais de 663 ± 20 e 743 ± 22 mg L^-1. A concentração de 989 ± 15 mg L^-1 foi diferente das demais, apresentando taxa de biodegradação de fenol inferior (1,66 ± 0,02 mg L^-1 h^-1), cerca de 50% menor que as anteriores, provavelmente por estar se aproximando do limite de tolerância ao fenol. A menor taxa de biodegradação mostrou-se associada a um aumento da fase de adaptação, evidenciada pela pequena variação na concentração de fenol nas primeiras 264 h de cultivo.

Foi observada uma variação não expressiva na concentração de fenol, cerca de 4%, para a concentração inicial de 1166 ± 11 mg L^-1 durante o período acompanhado, apesar do consumo de glicose nas primeiras 192 h de cultivo. A partir deste ponto também não houve consumo de glicose. Este fato indica que nesta concentração inicial de fenol o fungo provavelmente permaneceu viável pelo período citado, sendo que após sua atividade metabólica cessou pelo efeito tóxico do fenol, pois não mais se verificou decréscimo na concentração de glicose.

A concentração inicial de 989 ± 15 mg L^-1 pode ser considerada elevada tratando-se de fenol, o que possibilita afirmar que Asper gillus sp. LEBM2 apresenta alta tolerância ao fenol, sendo capaz de biodegradá-lo totalmente mesmo em altas concentrações. Limites de tolerância ao fenol em níveis similares têm sido observados para outros microrganismos cultivados em batelada, como Candida tro picalis,⁷Pseudomonas putida⁸ e Acinetobacter sp..⁹ Um linhagem de Candida tropicalis³ foi capaz de degradar até 2000 mg L^-1. Gra phium sp.⁶ foi capaz de tolerar 2000 mg L^-1, mas a degradação foi de aproximadamente 60%. Para o gênero Aspergillus, Santos e Linardi¹ observaram percentuais de biodegradação variando de cerca de 90% (concentração inicial até 600 mg L^-1) até 4% (1000 mg L^-1), com taxas de biodegradação na faixa de 3 a 4 mg L^-1 h^-1.

Desta forma, é importante destacar que com Aspergillus sp. LEBM2 foi possível a biodegradação total em altas concentrações de fenol, apesar do decréscimo na taxa de biodegradação.

CONCLUSÕES

Constatou-se que a adaptação prévia do fungo Aspergillus sp. LEBM2 em meio contendo fenol e glicose, ambos na concentração de 250 mg L^-1, possibilitou maior taxa de biodegradação de fenol, tornando o processo mais eficiente. Os ensaios em frascos agitados apresentaram resultados promissores, permitindo otimizar algumas variáveis que incrementaram a taxa de biodegradação de fenol em até 6,48 vezes. As condições otimizadas para alcançar uma taxa de biodegradação de fenol de 3,76 mg L^-1 h^-1 foram 500 mg L^-1 de glicose e agitação de 200 rpm, sugerindo-se que seja utilizado um volume de inóculo de 20% para garantir a eficiência do tratamento para maiores concentrações de fenol. Aspergillus sp. LEBM2 tem alta tolerância ao fenol, podendo biodegradá-lo efetivamente até uma concentração de 989 ± 15 mg L^-1 apresentando, desta forma, grande potencial para emprego em processos de bioaumentação.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, o qual possibilitou a realização desse trabalho.

Recebido em 6/6/08; aceito em 24/10/08; publicado na web em 12/2/09

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Jun 2009
• Data do Fascículo
  2009

Histórico

• Aceito
  24 Out 2008
• Recebido
  06 Jun 2008