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Química Nova

versão On-line ISSN 1678-7064

Quím. Nova vol.32 no.7 São Paulo  2009

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422009000700005 

ARTIGO

 

Esteroides produzidos por Penicillium herquei, um fungo endofítico isolado dos frutos de Melia azedarach (Meliaceae)

 

Steroids produced by Penicillium herquei, an endophytic fungus isolated from the fruits of Melia azedarach (Meliaceae)

 

 

Andrey Moacir do Rosario MarinhoI, *; Patrícia Santana Barbosa MarinhoII; Edson Rodrigues FilhoII

IDepartamento de Ciências Naturais, Universidade do Estado do Pará, 6113-010 Belém - PA, Brasil
IIDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, 13565-905 São Carlos - SP, Brasil

 

 


ABSTRACT

Six compounds comprising the groups of steroids, the ergosterol, the ergosterol peroxide, the cerevisterol, the neociclocitrinols, the ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, the 25-hydroxy-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, were isolated from Penicillium herquei fungus obtained from Melia azedarach. The structures were identified by spectral methods of RMN 1D and 2D and MS.

Keywords: steroids, endophytic fungus, Penicillium.


 

 

INTRODUÇÃO

Micro-organismos endofíticos estão presentes nos tecidos internos das plantas onde esta associação pode ocorrer em nível celular. É estimado que cerca de 80% das plantas são hospedeiras de fungos.1-3 A natureza dessas interações tem despertado o interesse de químicos, bioquímicos e biólogos na tentativa de entender essas associações, que é um fascinante e amplo campo de pesquisa. A colonização das plantas por endofíticos pode ser mediada pelo seu metabolismo secundário.4 Em geral esses compostos apresentam atividades antimicrobianas e inseticidas, e sua produção pode ser uma forma de proteção da planta hospedeira contra invasões.1,4

Nosso grupo tem estudado a química de micro-organismos associados a plantas da família Meliaceae. Uma grande coleção de fungos tem sido isolada das folhas, frutos, raiz e caule de Melia azedarach.5 Algumas espécies de Penicillium isoladas dessa planta têm produzido metabólitos secundários interessantes pela sua química e atividade biológica.6 Este artigo descreve o estudo químico de P. herquei, cultivado em arroz, o isolamento e identificação de esteroides.

 

RESULTADOS

As substâncias 1, 2 e 3 foram obtidas da fase diclorometânica do extrato metanólico da biomassa produzida por P. herquei cultivado em arroz (Uncle Ben's). Essas substâncias são sólidas cristalinas e seus dados de RMN e EM são perfeitamente coincidentes com os descritos na literatura para o ergosterol (1), peróxido de ergosterol (2) e cerevisterol (3).7-9

O espectro de RMN 1H de 4 não apresentou características de um composto com esqueleto esteroidal comum. Seu espectro de EM (APCI) apresentou um m/z 401 [M+H]+. Foram observados ainda os m/z 383, 365 e 347 indicando a perda de três moléculas de água, sugerindo uma molécula tri-hidroxilada. O espectro de RMN 1H apresentou sinais para três hidrogênios carbinólicos H-3 (δ 3,24), H-23 (δ 4,18/4,04) e H-24 (δ 3,60/3,47); estas informações corroboram com as perdas de água no espectro de massas e observa-se ainda no espectro de RMN 13C um sinal típico de carbonila em δ 207,8 (C-6). Foram evidentes alguns sinais duplicados com relação 1:1 de intensidade. Estes dados sugeriram a presença de uma mistura epimérica. Após análise dos dados de RMN e EM concluímos que 4 é a mistura das formas 23,24-eritro e 23,24-treo do esteroide neociclocitrol isolado anteriormente por nós de Penicillium janthinellum.10 Não foi possível separar a mistura por nenhum método de HPLC. Recentemente foi isolada uma série de esteroides neociclocitrinois de P. citrinum e o estudo biossintético realizado neste trabalho corroborara com a nossa proposta de rota bioquímica.10,11

 

 

 

 

Os espectros de RMN 1H e 13C da substância 5 apresentaram características de um composto esteroidal. No espectro de RMN 1H observamos o sinal de grupo metila CH3-18 (δ 0,95, s, 3H) ligada a um carbono quaternário. Seguindo as correlações para esta metila foi possível determinar os sinais dos carbonos C-12 (δ 35,7), C-13 (δ 44,1), C-14 (δ 156,0) e C-17 (δ 55,8). O sinal δ 0,98 foi atribuído à metila CH3-19 e tem correlações de HMBC com C-2 (δ 34,2), C-10 (δ 36,8), C-9 (δ 44,5) e C-5 (δ 164,2). Os hidrogênios H-6 (δ 6,01) e H-7 (δ 6,60) apresentaram constante de acoplamento J = 9,6 Hz e devem estar cis relacionados. As correlações de HMBC e COSY para CH3-18, CH3-19, H-6 e H-7 permitiram definir um sistema conjugado 4,6,8(14) nos anéis A, B e C. O sinal em δ 5,72 apresentou correlação no HMBC com os carbonos C-5, C-6, C-10 e foi atribuído a H-4. Esta atribuição pode ser confirmada através da correlação com a carbonila α,β-insaturada localizada em C-3 (δ 199,3). Através das análises dos dados de RMN, EM e comparações com os dados descritos na literatura concluímos que a substância 5 é o ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona.

 

 

 

 

A substância 6 apresentou o mesmo padrão de correlações no HMBC, HSQC e COSY para os anéis A, B, C e D da substância 5. Porém ao invés de quatro sinais dubletos de metila como em 5 foram observados dois sinais dubletos e quatro sinais singletos na região de metilas no espectro de RMN ¹H de 6. No espectro de RMN ¹³C de 6 observou-se ainda um sinal referente a um carbono carbinólico em δ 72,5. Como os anéis A, B, C e D são idênticos aos de 5, o carbono carbinólico foi localizado na cadeia lateral. Já que no espectro de RMN ¹H são observados quatro sinais referentes a singletos de metila, o grupo hidroxila foi posicionado em C-25, que é o único local na cadeia lateral que contempla o padrão espectral observado. Essa proposta foi confirmada através da correlação da metila CH3-28 no HMBC com C-23 e δ 72,5 (C-25). As metilas CH3-26 e CH3-27 apresentaram correlação com C-24 (δ 49,0) e com C-25 confirmando a estrutura de 6. Assim, 6 foi identificado como 25-hidroxi-esgosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona.

 

 

As substâncias 5 e 6 foram isoladas anteriormente de uma espécie de Ascomiceto encontrado em uma esponja.12,13 Esta é a primeira ocorrência desses esteroides em espécies de Penicillium. Os dados de RMN ¹H e ¹³C de 5 e 6 estão dispostos da Tabela 1.

 

 

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos gerais

O espectro de IV foi medido em um espectrofotômetro Bomen MB-102 em pastilha de KBr. Os dados de APCIMS foram adquiridos no modo positivo usando um instrumento Micromass Quattro-LC equipado com uma fonte de íons ESI/APCI do tipo Z-spray. Os experimentos de RMN 1H e 13C foram obtidos em um espectrômetro Bruker DRX-400 em MeOD e CDCl3 com TMS como padrão interno.

Micro-organismo

P. herquei foi obtido de uma coleção do Laboratório de Bioquímica Micromolecular de Micro-organismos do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos. Esta coleção contém isolados de Melia azedarach.5

Cultura de P. herquei em arroz e isolamento dos esteroides

Quarenta e cinco fracos de Erlenmeyer (500 mL), contendo 90 g de arroz (Uncle Been's) e 75 mL de água destilada por frasco, foram autoclavados por 45 min a 121 °C. Pequenos cubos de meio BDA contendo o micélio de P. herquei foram adicionados em 42 frascos de Erlenmeyer sob condição estéril. Três frascos foram utilizados como controle. Após 20 dias de crescimento a 25 °C foi adicionado metanol (300 mL) em cada frasco de Erlenmeyer, e após 5 h esse metanol foi filtrado por gravidade. O metanol foi evaporado sob pressão reduzida, onde se obteve 10,4 g de extrato. Esse extrato foi fracionado em coluna sob pressão reduzida usando hexano, diclorometano e metanol como eluentes. Da fase diclorometânica, após fracionamento em coluna cromatográfica de sílica gel eluída com hexano, acetona e metanol, em gradiente de polaridade, foram obtidos os esteroides ergosterol (1), peróxido de ergosterol (2), cerevisterol (3), neociclocitrinois (4), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona (5) e 25-hidroxi- ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona (6).

Dados físicos e espectrais dos compostos

Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona (5): sólido amarelo pálido; RMN ¹H e ¹³C (CDCl3, 400 MHz) ver Tabela 1; APCIMS (full scan, modo positivo): m/z (rel. int): 393 [M+H]+ (100), 346 (31), 306 (75), 252 (52).

25-hidroxi-ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona (6): sólido amarelo pálido; RMN ¹H e ¹³C (CDCl3, 400 MHz) ver Tabela 1; APCIMS (full scan, modo positivo): m/z (rel. int): 409 [M+H]+ (100); APCIMS (íons filhos, 30 eV): 409 [M+H]+ (20), 391 (35), 349 (28), 333 (38), 253 (88), 235 (65), 225 (100), 211 (38), 199 (38).

 

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo suporte financeiro.

 

REFERÊNCIAS

1. Rizzo, I.; Varsavky, M.; Haidukowski, M.; Frade, H.; Toxicon 1997, 35, 753.         [ Links ]

2. Stierle, A.; Strobel, G.; Stierle, D.; Science 1993, 260, 214.         [ Links ]

3. Zhang, W.; Wendel, J. F.; Clark, L. G.; Mol. Phylogent. Evol. 1997, 8, 205.         [ Links ]

4. Huang, E. X.; Huang, T. L.; Wildung, M. R.; Croteau, R., Scott, A. I.; Prot. Expr. Pur. 1998, 13, 90.         [ Links ]

5. Santos, R. M. G.; Rodrigues-Fo, E.; Rocha, W. C.; Teixeira, M. F. S.; World J. Microbiol. Biotechnol. 2003, 19, 767.         [ Links ]

6. Marinho, A. M. do R.; Rodrigues-Fo, E.; Santos, L. S.; Moitinho, M. L. R..; J. Braz. Chem. Soc. 2005, 16, 280.         [ Links ]

7. Breitmaier, E.; Voelter, W.; Carbon-13 NMR Spectroscopy: High Resolution Methods and Applications in Organic Chemistry and Biochemistry, 3rd ed., VCH: Weinhein, 1987.         [ Links ]

8. Yue, J.; Chen, S.; Lin, Z.; Sun, H.; Phytochemistry 2001, 56, 801.         [ Links ]

9. Kawagishi, H.; Katsumi, R.; Sazawa Takashi, M.; Hagiwara, T.; Nakamura, T.; Phytochemistry 1988, 27, 2777.         [ Links ]

10. Marinho, A. M. R.; Rodrigues-Fo, E.; Ferreira, A. G.; Santos, L. S.; J. Braz. Chem. Soc. 2005, 16, 1342.         [ Links ]

11. Du, L.; Zhu, T.; Fang, Y.; Gu, Q.; Zhu, W.; J. Nat. Prod. 2008, 71, 1343.         [ Links ]

12. Fujimoto, H.; Nakamura, E.; Okuyama, E.; Ishibashi, M.; Chem. Pharm. Bull. 2004, 52, 1005.         [ Links ]

13. Ciminiello, P.; Fattorusso, E.; Magno, S.; Mangoni, A.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 1331.         [ Links ]

 

 

Recebido em 30/4/08; aceito em 18/3/09; publicado na web em 4/8/09

 

 

* e-mail: andreymoacir@yahoo.com.br

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