Terpenos isolados de Coussarea platyphylla Müll. Arg. (Rubiaceae)

Terpenes isolated of Coussarea platyphylla Müll. Arg. (Rubiaceae)

Coussarea platyphylla; terpenes; antitumor

ARTIGO

Terpenos isolados de Coussarea platyphylla Müll. Arg. (Rubiaceae)

Terpenes isolated of Coussarea platyphylla Müll. Arg. (Rubiaceae)

Francieli Casassa Vieira de Araujo^I; Fábio Gonçalves Marques^I; Cleuza Conceição da Silva^I; Silvana Maria de Oliveira Santin^I,*; Celso Vataru Nakamura^II; Maria Lucília Motinha Zamuner^III; Maria Conceição de Souza^IV

^IDepartamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 Maringá - PR, Brasil

^IIDepartamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 Maringá - PR, Brasil

^IIIDepartamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 Maringá - PR, Brasil

^IVDepartamento de Biologia, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 Maringá - PR, Brasil

ABSTRACT

The phytochemical investigation of Coussarea platyphylla led to the isolation of triterpenes betulonic and betulinic acid, monoterpenes monotropein and monotropein salt, the diterpene trans-phytol and esteroids. The structures of the isolated compounds were assigned on the basis of spectroscopic data, including two-dimensional NMR methods. The antiproliferative properties against human cancer cell lines and molluscicidal activity against Biomphalaria glabrata of the crude methanolic extract and of its fractions were investigated.

Keywords:Coussarea platyphylla; terpenes; antitumor.

INTRODUÇÃO

O gênero Coussarea (Rubiaceae) compreende 150 espécies distribuídas nos países da America do Sul e Central.¹ Apesar da ampla quantidade de espécies deste gênero, estudos químicos e farmacológicos se delimitam em apenas quatro espécies: C. macrophylla, C. paniculata, C. brevicaulis. e C. hydrangeifolia, Estes estudos constataram a presença de antracenos,¹ antraquinonas,¹ triterpenos das classes dos lupanos,² oleananos^2,3 e ursanos,^1-3 fenilpropanoides⁴ e o iridoide éster metílico diacetilescandosídeo.⁵ Alguns dos triterpenos isolados mostraram-se bioativos para células tumorais.

O estudo de Coussarea platyphylla, popularmente conhecida como jasmim-da-mata, teve como objetivo dar continuidade à investigação do potencial químico e farmacológico das espécies pertencentes à família Rubiaceae, em área de preservação ambiental da região de Porto Rico, na planície de inundação do alto do Rio Paraná, que abrange áreas dos estados do Paraná e Mato Grosso do Sul. Em estudo anterior da espécie Galianthe brasiliensis,⁶ encontrada na mesma região e da mesma subfamília de C. platyphylla (Rubioideae), foi constatada a presença de esteroides, de ácido ursólico e de alguns iridoides como asperulosídeo e ondelandosídeo, os quais possuem potenciais antitumores⁷ e são importantes marcadores quimiotaxonômicos na subfamília.^6,8 Análises preliminares de atividade antiproliferativa em células tumorais do extrato bruto das partes aéreas apresentaram resultados promissores.⁶

O presente trabalho, primeiro estudo químico da espécie Coussarea platyphylla, descreve o isolamento e a identificação de dois triterpenos, um diterpeno e de dois iridoides e os resultados dos ensaios antitumorais e moluscicida dos extratos brutos e frações das folhas e galhos.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN (uni e bidimensionais) foram obtidos em espectrômetro Varian, modelo Mercury plus BB, operando a 300 MHz para ¹H e 75,5 MHz para ¹³C. Os deslocamentos químicos foram dados em ppm, tendo como referência interna o tetrametilsilano TMS (δ= 0,0 ppm) ou o próprio solvente. Os solventes utilizados foram D₂O, CD₃OD e CDCl₃. Para as cromatografias em coluna (CC) utilizou-se gel de sílica 60 (0,063-0,200 mm, Merck) ou Sephadex LH-20 como fase estacionária. Para as cromatografias em camada delgada (CCD) e em camada delgada preparativa (CCDP) empregou-se gel de sílica 60 G e 60 GF254 (Merck). A visualização dos compostos em CCD foi realizada por irradiação com luz ultravioleta em 254 e 366 nm e/ou por pulverização com solução de H₂SO₄/MeOH (1:1), H₂SO₄/anisaldeído/ácido acético (1:0,5:50 mL) seguido de aquecimento. A caracterização do cátion do sal orgânico foi realizada por meio de espectrômetro de absorção atômica Varian modelo AA 175 (comprimento de onda de 330,2 nm) usando chama de ar/acetileno como fonte de energia e lâmpada de cátodo oco.

Material vegetal

A planta foi coletada em abril de 2004 na bacia de inundação do Rio Paraná, no município de Bataiporã - MS. A exsicata do material vegetal encontra-se depositada no Herbário da Universidade Estadual de Maringá sob o registro nº HUNP 3175.

Isolamento dos terpenos presentes nas folhas e galhos

As folhas e galhos de Coussarea platyphylla (600 e 400 g, respectivamente) foram secos ao ar, triturados e extraídos exaustivamente com metanol, à temperatura ambiente, fornecendo 59,0 e 18,0 g de extrato bruto. Parte dos extratos brutos das folhas e galhos (39,0 e 13,0 g) foram solubilizados em MeOH/H₂O 1:1 e submetidos à partição em solventes de diferentes polaridades, resultando nas frações hexânica (FHF, 13,13 g), clorofórmica (FCF, 3,26 g), acetato de etila (FAEF, 0,75 g) e hidrometanólica (FHMF, 20,10 g) das folhas e hexânica (FHG, 1,16 g), clorofórmica (FCG, 1,53 g), acetato de etila (FAEG, 0,42 g) e hidrometanólica (FHMG, 7,78 g) dos galhos. Parte da fração FHF (11,98 g) foi fracionada em CC em gel de sílica com misturas de hexano, acetato de etila e metanol em ordem crescente de polaridade. Tratamento da subfração hexano:AcOEt 2% por CC em gel de sílica (hexano, hexano/AcOEt 2-20%) resultou no isolamento da substância 5 (19,9 mg) e de uma mistura de esteroides (estigmasterol, sitosterol e campesterol, 26,9 mg). A subfração hexano:AcOEt 10%, após tratamento em CCDP com hexano:AcOEt 15% resultou no isolamento das substâncias 1 (15,8 mg) e 2 (5,5 mg). A fração FCF (3,00 g) foi tratada em CC em gel de sílica (hexano, hexano/AcOEt 5-60%) e purificações das subfrações hexano:AcOEt 10% (77,3 mg) e 20% (105,6 mg) através de CCDP resultaram novamente nas substâncias 5 e 1. A filtração da fração FHMF (0,50 g) em Sephadex LH-20, utilizando água e metanol resultou no isolamento das substâncias 3 (22,7 mg) e 4 (4,6 mg). As frações FHG e FCG foram submetidas ao mesmo tratamento empregado para as frações FHF e FCF, resultando no isolamento da substância 2 para ambas frações. Parte da fração FHMG (0,68 g) foi submetida à filtração em Sephadex LH-20 com água/metanol resultando no isolamento de 3 (7,2 mg).

Ensaio de atividade moluscicida

A atividade moluscicida dos extratos e frações sobre caramujos adultos de Biomphalaria glabrata foi determinada segundo a metodologia descrita por Hostettmann.⁹ Os bioensaios foram realizados em duplicata usando a niclosamida como controle positivo.

Ensaio de atividade antitumoral

Os extratos brutos das folhas (EBF) e dos galhos (EBG) e as frações hexânica (FHF e FHG), clorofórmica (FCF e FCG), acetato de etila (FAEF e FAEG) e hidrometanólica (FHMF e FHMG) provenientes da partição destes extratos foram avaliados frente a culturas de células tumorais humanas do intestino (Caco-2) e do colo do útero (HeLa) cultivadas durante 48 h a 37 ºC pelo método da sulforodamida B descrito por Skehan.¹⁰

Dados espectroscópicos das substâncias isoladas

Monotropeína ( 3 )

Aspecto físico: sólido castanho claro. RMN de ¹H (D₂O, 300,06 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.): 5,58 (d, 1,8, H-1); 7,40 (d, 1,5, H-3); 3,57 (m, H-5); 6,23 (dd, 2,7; 5,7, H-6); 5,70 (dd, 1,8; 5,7, H-7); 2,68 (dd, 1,8; 8,7, H-9); 3,68 (m, H-10); 4,81 (d, 8,1, H-1'); 3,20 (m, H-2'); 3,34 (m, H-3'), 3,28 (m, H-4'); 3,26 (m, H-5') e 3,64 (m, H-6'). RMN de ¹³C (D₂O - 75,5 MHz): 95,0 (C-1); 152,3 (C-3); 106,5 (C-4); 41,3 (C-5); 140,7 (C-6); 134,1 (C-7); 87,8 (C-8); 47,8 (C-9); 69,4 (C-10); 174,0 (C-11); 98,9 (C-1'); 73,8 (C-2'); 76,8 (C-3'); 72,1 (C-4'); 78,4 (C-5') e 64,0 (C-6').

Sal de monotropeína ( 4 )

Aspecto físico: sólido castanho claro RMN de ¹H (D₂O, 300,06 MHz), δ (mult., J em Hz): 5,59 (d, 1,5, H-1); 7,10 (sl, H-3); 3,60 (m, H-5); 6,23 (dd, 2,4; 5,7, H-6); 5,70 (d, 1,8; 5,7, H-7); 2,69 (dd, 1,8; 8,7, H-9); 3,74 (m, H-10); 4,65 (d, 8,1, H-1'); 3,30 (m, H-2'); 3,33 (m, H-3'); 3,44 (m, H-4'); 3,52 (m, H-5') e 3,96 (sl, H-6'). RMN de ¹³C (D₂O - 75,5 MHz): 96,7 (C-1); 149,4 (C-3); 118,1 (C-4); 41,2 (C-5); 140,8 (C-6); 134,2 (C-7); 87,8 (C-8); 47,0 (C-9); 69,4 (C-10); 179,8 (C-11); 100,9 (C-1'); 75,5 (C-2'); 78,4 (C-3'); 72,4 (C-4'); 79,1 (C-5') e 63,5 (C-6').

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo fitoquímico de Coussarea platyphylla resultou no isolamento dos triterpenos ácidos betulônico¹¹ (1) e betulínico¹² (2), do iridoide monotropeína¹³ (3) e seu derivado salino¹³ (4), do diterpeno trans-fitol¹⁴ (5) e da mistura de esteroides¹⁵ (24α -metil-colesta-5-enol, 24α -etil-colesta-5,22-dienol e 24ξ-etil-colesta-5-enol). As estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas com base nas análises dos dados espectroscópicos (RMN ¹H e ¹³C, DEPT 90 º e 135º, COSY ¹H -¹H, HMQC, HMBC e NOESY) e por comparação com os dados disponíveis na literatura.

A substância 1 foi isolada da fração hexânica como sólido branco solúvel em clorofórmio e apresentou fluorescência quando visualizado sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 366 nm. Pelo espectro de RMN de ¹H da substância foram observados sinais em δ_H 4,74 (d, J= 1,8 Hz, H-29), 4,62 (sl, H-29), 3,01 (ddd, J= 10,7, 10,7 e 4,5 Hz, H-18) e seis sinais de hidrogênios metílicos em δ_H 1,07 (s, H-23), 1,02 (s, H- 24), 0,94 (s, H- 25), 0,97 (s, H- 26), 0,99 (s, H- 27) e 1,69 (s, H-30). O espectro de RMN de ¹³C apresentou sinais referentes a carbonos carbonílicos de cetona em δ_c 218,5 (C-3) e de ácido carboxílico em δ_c 181,5 (C-28), sinal de carbono metilênico em δ_c 109,9 (C-29) e de carbono vinílico em δ_c 150,6 (C-20). Os carbonos metílicos apresentam deslocamentos químicos entre δ_c 14,8 (C-27) e δ_c 26,8 (C-23). Através do experimento COSY, pode-se observar as correlações entre os hidrogênios vinílicos em δ_H 4,74 e 4,62 e entre os hidrogênios δ_H 3,01 e 1,69, dentre outras. As análises dos dados de RMN de ¹H e de ¹³C e comparação com os descritos na literatura permitiram identificar 1 como o ácido betulônico.¹²

A substância 2 foi obtida da fração hexânica como sólido branco. Na comparação dos dados de RMN de ¹H e ¹³C desta com os da substância 1 foram observadas várias semelhanças, destacando-se a principal diferença para o sinal de C-3 que em 1 correspondia a carbono não ligado a hidrogênio em δ_c 218,5 e em 2 corresponde a carbono carbinólico em δ_c 78,1/ δ_H 3,40 (tl, J= 5,4 Hz, H-3). De acordo com os dados apresentados e comparação com os dados da substância 1 e da literatura para o ácido betulínico¹³ pode-se constatar que 2 se trata desta substância.

A substância 4 foi isolada da fração hidrometanólica das folhas como sólido castanho claro solúvel em água. O espectro de RMN de ¹H da substância apresenta um singleto em δ_H 7,10 relativo ao hidrogênio do éter enólico (sl, H-3), dois duplo dupletos em δ_H 6,23 (dd, J= 2,4 e 5,7 Hz, H-6) e 5,70 (dd, J= 1,8 e 5,7 Hz, H-7), um dupleto em δ_H 5,59 (d, J= 1,8 Hz, H-1) e um duplo dupleto em δ_H 2,69 (dd, J= 1,8 e 8,7 Hz, H-9). Os sinais na região de δ_H 3,15-3,94 em conjunto com o sinal δ_H 4,68 (d, J= 8,1 Hz, H-1') determinaram a presença de uma unidade β-D-glicose. No espectro de RMN de ¹³C observa-se sinal em δ_c 179,8 (C-11) evidenciando a presença de um carbono carboxílico e sinais referentes a carbonos olefínicos em δ_c 149,4 (C-3), δ_c 118,1 (C-4), δ_c 140,8 (C-6) e δ_c 134,2 (C-7). O sinal presente em δ_c 69,4 (C-10) é característico de carbono carbinólico, em δ_c 100,9 (C-1') de carbono anomérico da unidade glicosídica e em δ_c 96,7 (C-1) de carbono anomérico da aglicona. Os sinais em δ_c 41,2 (C-5) e 47,0 (C-9) foram atribuídos aos carbonos da junção dos anéis e em δ_c 87,8 ao C-8. Os demais sinais na região de δ_c 79,1 a 63,5 correspondem aos carbonos da unidade glicosídica. No mapa de contornos HMBC pode-se observar correlações dos hidrogênios δ_H 7,10 (H-3) e 2,69 (H-9) com o carbono C-1 (δ_c 96,7) e do hidrogênio em δ_H 5,59 (H-1) com C- 3 (δ_c 149,4). Os hidrogênios em δ_H 5,59 (H-1), 5,70 (H-7), 6,23 (H-6), 7,10 (H-3) e 2,69 (H-9) correlacionam-se com o carbono C-5 (δ_c 41,2) e os hidrogênios em δ_H 5,70 (H-7) e δ_H 3,74 (H-10) com os carbonos C-6 (δ_c 140,8) e C-7 (δ_c 134,2). Também foram observadas correlações dos hidrogênios em δ_H 5,70 (H-7) e 3,74 (H-10) com C-8 (δ_c 87,8) e dos hidrogênios com deslocamentos químicos δ_H 5,70 (H-7), 6,23 (H-6) e 3,74 (H-10) com C-9 (δ_c 47,0). Pelo experimento COSY destaca-se, além das correlações dos hidrogênios glicosídicos, a correlação entre os hidrogênios vinílicos δ_H 6,23 (H-6) e 5,70 (H-7), e entre o hidrogênio em δ_H 2,69 (H-9) com os hidrogênios δ_H 5,59 (H-1) e 3,60 (H-5). As correlações observadas pelo experimento NOESY entre o sinal em δ_H 2,69 (H-9) com os sinais em 5,59 (H-1), 3,60 (H-5) e 3,74 (H-10) indicam que estes hidrogênios estão na mesma face, e evidenciam a estereoquímica relativa de C-1, C-5, C-8, C-9 e C-10. O cátion inorgânico foi determinado por espectrometria de absorção atômica como sendo o íon sódio. Dados de RMN de ¹H e de ¹³C de 4 comparados com os dados da literatura¹³ permitiram concluir que a substância isolada se trata do sal sódico da monotropeína.

A substância 3 foi isolada da fração hidrometanólica dos galhos e os dados de RMN de ¹H e de ¹³C foram comparados com os dados da substância 4. Foram observadas similaridades, com exceção dos sinais do hidrogênio do éter enólico que de δ_H 7,10 (sl, H-3) deslocou para δ_H 7,40 (d, J= 1,5 Hz, H-3), e dos carbonos C-3 de δ_c 147,3 para δ_c 152,3; C-4 de δ_c 118,1 para δ_c 106,5 e do C-11 de δ_c 179,8 para δ_c 174,0. Estas diferenças nos deslocamentos de ¹H e ¹³C podem ser atribuídas à mudança do sal para ácido. Comparando os dados da substância 3 com os da substância 4 e da literatura,¹³ podemos constatar que esta substância se trata da monotropeína.

A substância 5 foi isolada das frações hexânica e clorofórmica das folhas como um óleo incolor solúvel em clorofórmio, que apresentou fluorescência quando visualizado sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 366 nm. Análises dos dados de RMN de ¹H e de ¹³C e comparação com os da literatura permitiram concluir que a substância isolada é o trans-fitol.¹⁴

Os extratos brutos e frações das folhas e galhos foram submetidos à avaliação da atividade moluscicida com caramujos Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do Shistosoma mansoni, causador da esquistossomose. Os extratos brutos e frações não se mostraram ativos, com exceção da fração hexânica dos galhos que apresentou resultado moderado com DL₅₀= 139 ppm. Foram realizados ainda ensaios de atividade antiproliferativa em células HeLa (célula tumoral do colo do útero) e células Caco-2 (célula tumoral do intestino). Para as células HeLa os melhores resultados foram observados para as frações hexânica e clorofórmica dos galhos e das folhas, e fração acetato de etila dos galhos com CC₅₀ < 100 μg/mL. Para células Caco-2, foram encontrados CC₅₀ < 100 μg/mL para as frações hexânica e clorofórmica dos galhos e das folhas, e fração acetato de etila dos galhos. A efetiva atividade antiproliferativa observada para as frações apolares pode ser relacionada, em parte, às substâncias ácido betulínico¹⁶ e trans-fitol¹⁷ presentes, as quais possuem comprovada atividade antitumor.

CONCLUSÃO

O estudo químico de Coussarea platyphylla resultou no isolamento de terpenos e esteroides. O ácido betulônico, o trans-fitol, a monotropeína e sua forma salina foram isolados pela primeira vez no gênero. Os iridoides são considerados marcadores quimiotaxonômicos da subfamília Rubioideae.^6,18

AGRADECIMENTOS

À Fundação Araucária (Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Paraná).

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Recebido em 7/8/08; aceito em 5/3/09; publicado na web em 10/8/09

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Out 2009
• Data do Fascículo
  2009

Histórico

• Aceito
  05 Mar 2009
• Recebido
  07 Ago 2008