Alcaloides iboga de Peschiera affinis (Apocynaceae) - Atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono: atividade antioxidante

Iboga alkaloids from Peschiera affinis (Apocynaceae) - unequivocal 1H and 13C chemical shift assignments: antioxidant activity

Resumo

Six known alkaloids iboga type and the triterpen α- and β-amyrin acetate were isolated from the roots and stems of Peschiera affinis. Their structures were characterized on the basis of spectral data mainly NMR and mass spectra. 1D and 2D NMR spectra were also used to unequivocal ¹H and 13C chemical shift assignments of alkaloids. The ethanolic extract of roots, alkaloidic and no-alkaloidic fractions and iso-voacristine hydroxyindolenine and voacangine were evaluated for their antioxidative properties using an autographic assay based on β-carotene bleaching on TLC plates, and also spectrophotometric detection by reduction of the stable DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical.

Peschiera affinis; iboga alkaloids; DPPH

Peschiera affinis; iboga alkaloids; DPPH

ARTIGO

Alcaloides iboga de Peschiera affinis (Apocynaceae) - Atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono. Atividade antioxidante

Iboga alkaloids from Peschiera affinis (Apocynaceae) - unequivocal 1H and 13C chemical shift assignments. Antioxidant activity

Allana Kellen L. Santos; Ticiane S. Magalhães; Francisco Jose Q. Monte; Marcos Carlos de Mattos; Maria Conceição F. de Oliveira; Maria Mozarina B. Almeida; Telma L. G. Lemos^*; Raimundo Braz-Filho^#

Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, 60451-970 Fortaleza - CE, Brasil

ABSTRACT

Six known alkaloids iboga type and the triterpen α- and β-amyrin acetate were isolated from the roots and stems of Peschiera affinis. Their structures were characterized on the basis of spectral data mainly NMR and mass spectra. 1D and 2D NMR spectra were also used to unequivocal ¹H and ¹³C chemical shift assignments of alkaloids. The ethanolic extract of roots, alkaloidic and no-alkaloidic fractions and iso-voacristine hydroxyindolenine and voacangine were evaluated for their antioxidative properties using an autographic assay based on β-carotene bleaching on TLC plates, and also spectrophotometric detection by reduction of the stable DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical.

Keywords:Peschiera affinis; iboga alkaloids; DPPH.

INTRODUÇÃO

O gênero Peschiera, também conhecido como Tabernaemontana, família Apocynaceae, compreende cerca de 100 espécies largamente distribuídas nos trópicos¹ e são potencialmente ricas em alcaloides indólicos.² Esta classe de alcaloides é conhecida por apresentar inúmeras atividades biológicas, tais como, contraceptiva, anti-inflamatória, antimalarial, anti-HIV, leishmanicida, antitumoral, antimicrobiana, anti-hipertensiva, anticolinesterase e estimulante do sistema nervoso central.³ Alcaloides indólicos podem ser considerados marcadores químicos desse gênero contribuindo, assim, para a classificação de suas espécies.⁴ Estudos anteriores revelaram que os alcaloides do tipo iboga (por exemplo, coronaridina, voacristina, voacangina e eglandina)⁵ são abundantes em espécies pertencentes ao gênero Peschiera. O termo "iboga" deriva do nome da espécie Tabernanthe iboga de onde foi isolado o alcaloide ibogaína, primeiro desta série.⁵

Peschiera affinis, popularmente conhecida como "grão-de-galo", é um arbusto perene, podendo chegar ao porte de pequena árvore, bioprodutora de abundante látex branco e viscoso. Investigações fitoquímicas anteriores revelaram a presença de diversos metabólitos especiais, entre eles, alcaloides dos tipos indólico (sarpagina) e iboga⁶ (vobasina), triterpenos e esteroides.

Dando continuidade ao estudo de plantas com atividades biológicas,⁷ o presente trabalho divulga resultados de uma reinvestigação fitoquímica da espécie P. affinis, utilizando as raízes e caule de espécimen cultivada no estado do Ceará-Brasil, relatando-se o isolamento dos alcaloides voacristina hidroxi-indolenina (1), voacristina (2), voacangina (3), coronaridina (4), iboxigaina (5) e affinisina (6) e dois triterpenoides 3-O-acetil-α-amirina (7) e 3-O-acetil-β-amirina (8) (Figura 1). As estruturas destas substâncias foram caracterizadas através da análise de dados espectrais, principalmente, os fornecidos por espectros de massa (EM) e ressonância magnética nuclear (RMN). Os espectros de RMN 1D e 2D permitiram também a atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio (δ_H) e carbono (δ_C) dos alcaloides. Foram realizados também ensaios de atividade antioxidante com o extrato etanólico das raízes (EERPA), a fração alcaloídica (PAFA), a fração não-alcaloídica (PAFNA) e os compostos isolados utilizando os métodos do β-caroteno⁸ e do DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila).⁹

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

As cromatografias de adsorção em coluna foram feitas utilizando gel de sílica (60 F₂₅₄) previamente tratada com bicarbonato de sódio 5% por 2 h, filtradas e secas em estufa a 100 ⁰C por 4 h. Nas cromatografias em camada delgada (CCD) utilizaram-se cromatoplacas de sílica gel GF₂₅₄. Os espectros na região do infravermelho (IV) foram obtidos em espectrômetro Perkin-Elmer 1000, em pastilhas de KBr. Os pontos de fusão foram determinados em aparelho (MQAPF-302, modelo 12038DV) digital da Microquímica. Os espectros de massa (EM) foram registrados em um espectrômetro Hewlett-Packard 5971 (70 eV) e os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) em espectrômetro Bruker Avance DRX-500, operando nas frequências de 500 e 125 MHz para RMN ¹H e ¹³C, respectivamente.

Coleta e identificação do material vegetal

O material botânico (raízes e caule) de P. affinis foi coletado nos arredores da Universidade Federal do Ceará (Campus do Pici) no município de Fortaleza - CE, Brasil. A identificação botânica foi realizada pelo Prof. E. P. Nunes, e a exsicata de Nº 33.339 encontra-se arquivada no Herbário Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do Ceará, Brasil.

Extração do material vegetal

As raízes (2 kg) foram secas a temperatura ambiente e após serem trituradas foram submetidas à extração a frio, sucessivamente, com hexano e etanol. As soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida, fornecendo os extratos hexânico (EHRPA, 9 g) e etanólico (EERPA, 20 g), respectivamente.

Isolamento dos alcaloides

Parte do extrato etanólico das raízes, EERPA (10 g) foi tratada com solução aquosa de HCl 10% (40 mL) e mantida sob agitação por 2 h. A solução foi submetida à extração com AcOEt (3X 80 mL) e a fase orgânica evaporada sob pressão reduzida, fornecendo a fração não-alcaloídica PAFNA (2,1 g). A fase aquosa foi alcalinizada com NH₄OH até pH 11, sendo então extraída com AcOEt (3X 80 mL), obtendo-se a fase orgânica (PAFA) que, após evaporada sob vácuo, forneceu 4,4 g da fração alcaloídica. A fração alcaloídica (PAFA) foi submetida à cromatografia em coluna filtrante de sílica gel eluída, sucessivamente, com hexano, CHCl₃, AcOEt e MeOH. A fração CHCl₃ (2,4 g) após sucessivas CC em sílica gel permitiu o isolamento de 2 (10 mg) e 5 e 6 (9 mg), como uma mistura. O EHRPA (9 g) foi submetido à coluna cromatográfica filtrante de sílica gel eluída, sucessivamente, com hexano, AcOEt e MeOH. A fração hexânica-EHRPA (3,8 g) foi submetida a sucessivas CC em sílica gel e em Sephadex-LH-20. Análise através de CCD permitiu reuni-las em grupos de frações equivalentes resultando no isolamento de 3 (13 mg), 4 (8 mg) e 7/8 (12 mg), como uma mistura.

O caule (1,5 kg) de P. affinis foi triturado e submetido à extração exaustiva com etanol a frio. O solvente foi evaporado sob vácuo fornecendo o extrato etanólico (EECPA, 13,6 g) que, submetido ao processo convencional de extração química de alcaloides (ácido-base) originou as frações alcaloídica (PAFA; 2,12 g) e não-alcaloídica (PAFNA; 7,9 g). A fração alcaloídica (PAFA) foi adsorvida em sílica gel e submetida ao processo de desadsorção (coluna filtrante) eluída com solventes em ordem crescente de polaridade: hexano, CHCl₃, AcOEt e MeOH. A fração CHCl₃, após repetidas CC em sílica gel e em Sephadex-LH-20, forneceu 1 (12 mg).

Atividade antioxidante pelo método do β-caroteno

Com os extratos brutos, as frações alcaloídica e não alcaloídica e as substâncias 1-6 foram realizados testes de atividade antioxidante utilizando o método qualitativo do β-caroteno, conforme protocolo previamente descrito.⁸

Atividade antioxidante pelo método do sequestro de radical DPPH

Foi determinada também a atividade antioxidante dos extratos brutos e dos alcaloides 1 e 3 pelo método do sequestro do radical DPPH, usando metodologia já reportada.⁹

Propriedades físicas

Voacristina hidroxi-indolenina (1)

Sólido amarelo, p.f. 107-108 ºC, IV (KBr, υ_max cm^-1): 3393, 2927, 2859, 1730, 1242, 754, EM-IE, 70 eV, m/z (rel. int., %): 400 ([M]^.+, 31), (85, 71), (83, 100). RMN ¹H e ¹³C, ver Tabelas 1 e 2.

Voacristina (2)

Sólido amarelo, p.f. 122-124 ºC, IV (KBr, υ_max cm^-1): 3342, 2950, 1731, 1454, 1217, EM-IE, 70 eV, m/z (rel. int., %,) 384 ([M]^.+, 48,2), (366, 92), (244, 57), (184, 71), (160, 63), (154, 48), (152, 74), (140, 63). RMN ¹H e ¹³C, ver Tabelas 1 e 2.

Voacangina (3)

Sólido amarelo, p.f. 128-130 ºC, IV (KBr, υ_max cm^-1): 3368, 2931, 2859, 1727, 1454, 1217, 754, EM-IE, 70 eV, m/z (rel. int., %) 368 ([M]^.+, 100), (136, 65). RMN ¹H e ¹³C, ver Tabelas 1 e 2.

Coronaridina (4)

Sólido amarelo, RMN ¹H e ¹³C, ver Tabelas 1 e 2.

Iboxigaina (5) e Affinisina (6)

Sólido amarelo. RMN ¹H e ¹³C, ver Tabelas 1 e 2.

3-O-acetil-α-amirina/3-O-acetil- β-amirina (7,8)

Sólido branco, p.f. 179-181 ºC, IV (KBr, υ_max cm^-1): 2945, 1731, 1446, 1372, 1244, EM-IE, 70 eV, m/z (rel. int., %) 468 ([M]^.+, 7), (218, 100). RMN ¹H e ¹³C de acordo com a literatura.¹⁰

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A substância 1 foi isolada como um sólido amarelo, p.f. 107-108 ºC. O espectro IV revelou bandas de absorção em υ_max 3393 ( NH), 1730 ( C=O), 1242 cm^-1 (ligação C-O de éster). A análise dos espectros de RMN ¹³C-{¹H} DEPT permitiu reconhecer a presença de sinais correspondentes a cinco átomos de carbono sp² quaternários [um carbonílico em δ_C 173,2 (MeO₂C-22) e um oxigenado em δ_C 159,5 (C-10)]; um carbono quaternário sp³ oxigenado [δ_C 88,1 (C-7)], sete metínicos [três sp² e quatro sp³ (sendo um oxigenado em δ_C 70,1 (C-19)]; cinco carbonos metilênicos, um metílico e dois metoxílicos (δ_C 53,6 MeO-22 e 55,9 MeO-10). Os sete sinais de carbono sp² em δ_C 186,3 (C-2), 159,5 (C-10), 144,9 (C-8), 144,1 (C-13), 121,7 (C-12), 114,1 (C-11), 108,2 (C-9) associados ao sinal 88,1 (C-7) sugerem a presença de unidade hidroxi-indolenina com o anel aromático do sistema indólico monometoxilado, em acordo com dados de RMN ¹H que exibiu sinais em δ_H 7,38 (d, J=8, 4 Hz, H-12), 6,93 (d, J=2,5 Hz, H-9) e 6,83 (dd, J=8,4 e 2,5 Hz, H-11), cada sinal com integração para um hidrogênio. Por outro lado os sinais em δ_C 48,7 (C-3), 48,1 (C-5), 33,3 (C-6), 26,7 (C-14), 29,5 (C-15), 35,0 (C-17), 39,6 (C-20), 54,6 (C-21) indicaram a presença da porção iboga contendo o C-21 [δ_C 54,6 e δ_H 4,41 (s)] ligado a um átomo de nitrogênio, em acordo com os sinais no espectro de RMN ¹H em δ_H 2,92 e 2,74 (m, H-3), 3,62 e 2,98 (m, H-5) (Tabela 2). Esses dados, juntamente com o pico do íon molecular em m/z 400 (EM-IE, 70 eV), e outros fragmentos presentes, estão em acordo com a fórmula molecular C₂₂H₂₈N₂O₅ estabelecida para 1.

Os espectros de RMN 2D de correlação homonuclear COSY e heteronuclear, HMQC, HMBC também foram utilizados na interpretação destes dados para dedução estrutural e atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono de 1 (Tabelas 1 e 2).

A configuração 19(R) do átomo de carbono C-19 de 1 foi definida através dos deslocamentos químicos dos átomos de carbono C-15 (δ_C 29,5) e C-21 (δ_C 54,6) comparados com os valores descritos na literatura para os alcaloides 19(S)-heineanina e 19(R)-epi-heineanina,^2,3,6 que demonstram claramente a influência do efeito gama do grupo do metila CH₃-18 no carbono metilênico C-15 (δ_C em aproximadamente 22 ppm) na configuração 19(S) e no C-21 (δ_C 54 ppm) na configuração 19(R); na ausência deste efeito gama, o sinal do grupo metilênico aparece em δ_C 28 ppm e do C-21 em torno de δ_C 59 ppm (Figura 1). Assim, a estrutura 1 foi definida para o alcaloide indolenínico conhecido como 19(R)-iso-voacristina hidroxi-indolenina isolado pela primeira vez de P. affinis e já descrito na literatura de outras espécies da família Apocynaceae, como exemplos Tabernaemontana calcarea¹ e T. catharinensis⁶ bioprodutores de 19(R)-epi- e 19(S)-epi- voacristina hidroxi-indolenina.

O composto 2 apresentou-se como um sólido amarelo com p.f. 122-124 ºC. O espectro de RMN ¹H exibiu sinais típicos do grupo indol em δ_H 7,15 (d, J=8,7; H-12), 6,83 (dl, J=8,7; H-11), 6,92 (sl, H-9) e 7,84 (sl, H-1) além dos sinais indicativos da porção iboga em δ_H 1,80 (m, 2H-15), 2,75 [(d, J=9,7) e 2,00 (m), 2H-17)], 2,83 [(d, J=9,1) e 3,00-3,20 (m, 2H-3)], 3,75 [(m), e 3,00-3,20 (m, 2H-5)], 3,00-3,20 (m, 2H-6), 2,02 (m, H-14), 1,43 (t, J=8,6; H-20) e 4,14 (sl, H-21), assim como sinais de hidrogênios de dois grupos metoxila em δ_H 3,73 (MeO-22) e 3,85 (s, MeO-10). O espectro de RMN ¹³C confirmou a existência do grupo indol através dos sinais dos carbonos sp² C-2, C-7 e C-13 (Tabela 1). De modo semelhante ao composto 1, uma das metoxilas foi posicionada no C-10. Em adição, foram verificados sinais devidos ao carbono carbonílico de éster em δ_C 174,9 (C-22) e sinais em δ_C 70,7 (carbono hidroxilado, C-19) e δ_C 22,4 (C-18), caracterizando a cadeia lateral como observado em 1 (Tabela 1). O espectro de massas obtido por impacto eletrônico (EM-IE, 70 eV) revelou o pico do íon molecular m/z 384 (48,2 %), compatível com a fórmula molecular C₂₂H₂₈N₂O₄ . Os dados obtidos associados aos dados da literatura confirmaram que 2 trata-se do alcaloide voacristna.²

A definição da configuração 19(R) do átomo de carbono C-19 de 2 foi estabelecida de maneira semelhante a 1.¹

Os espectros de RMN ¹H das substâncias 3 e 4 mostraram, de modo geral, características semelhantes às da substância 2, evidenciando as absorções correspondentes às partes indólicas e iboga (Tabela 2). Entretanto, nos espectros de RMN ¹³C, não apareceram os sinais de carbono sp³ metínico oxigenado (C-19), enquanto nos espectros de RMN ¹H os hidrogênios do grupo metila 3H-18 absorvem como tripletos (δ_H 0,91;7,4 em 3 e 0,90;7,2 em 4), indicando grupo CH₃CH₂- ligado ao carbono C-20. Os compostos 3 e 4 se diferenciam, entre si, pela presença do grupo metoxila no carbono C-10 (δ_C 154,2) de 3. Assim, esses dados associados com aqueles obtidos da análise dos espectros bidimensionais e comparação com os da literatura,⁶ possibilitaram identificar os compostos como sendo a voacangina (3)² e a coronaridina (4),²Tabelas 1 e 2.

As substâncias 5 e 6 foram isoladas como mistura e revelaram absorções que as identificaram como alcaloides semelhantes aos anteriores (Tabelas 1 e 2). Nos espectros de RMN ¹³C e ¹H de 5 não apareceram os sinais em δ_C 179,9 e 53,0, assim como os sinais em δ_H 3,73, respectivamente, indicando a ausência do grupo carbometoxila, sendo esta a única diferença com relação à substância 2. No espectro de RMN ¹³C de 6, foram registrados dois sinais adicionais relativos a carbonos sp². Por sua vez, seu espectro de RMN ¹H mostrou, como distinção, sinais para um hidrogênio em δ_H 5,48 (q, J = 6,8) e para hidrogênios metílicos em δ_H 1,57 (d, J = 6,8), revelando, claramente, que os carbonos C-19 (δ_C 118,3) e C-20 (δ_C 136,2) constituem uma ligação olefínica exocíclica, tendo o grupo metila 3H-18 ligado no carbono C-19. Em adição, não há sinais para grupos metoxila e carbometoxila, porém com sinais em δ_C 65,7 (CH₂) e δ_H 3,41 (m, 2H) justificando a presença de um grupo hidroxi-metileno posicionado no C-16. Os valores dos deslocamentos químicos observados no espectro de RMN ¹H foram correlacionados com os dos espectros de RMN ¹³C (Tabela 1) que, associados aos dados da literatura, possibilitaram caracterizar os compostos 5 e 6 como sendo a mistura dos alcaloides iboxigaina (5)⁶ e afinisina (6).⁶ A estrutura 6 foi deduzida com base principalmente nos deslocamentos químicos dos átomos de carbono C-17 (δ_C 65,7), C-14 (δ_C 33,9) e C-20 (δ_C 136,2).

As substâncias 7 e 8 apresentaram-se com características espectroscópicas nos espectros de RMN ¹H e ¹³C de triterpenos acetilados compatíveis com a mistura triterpenoídica de acetatos de α/β-amirina.¹⁰ Apesar destes triterpenos terem registros em muitas espécies⁷ este é o primeiro relato em P. affinis.

Extratos e substâncias foram inicialmente avaliados quanto a sua atividade antioxidante usando o método qualitativo em CCD do β-caroteno⁸ comparado com padrões rutina e vitamina C. Extratos e substâncias foram aplicados em CCD e a placa foi borrifada com solução CHCl₃-β-caroteno 5% e realizada a leitura após 24 h, observando-se a descoloração da placa e aparecimento de halos amarelos semelhantes aos padrões. O teste foi realizado com o extrato etanólico das raízes, as frações alcaloídicas (PAFA) e não-alcaloídicas (PAFNA) e os compostos 1-6. O extrato etanólico, as frações e os compostos 1 e 3 apresentaram teste positivo. Estas amostras foram submetidas ao teste de atividade antioxidante utilizando o método do sequestro do radical DPPH.⁹ Através dessa metodologia foi observada atividade significativa para a fração alcaloídica (PAFA) com inibição de 76% na concentração de 1 mg/mL, voacangina (3) de 78% na concentração de 1 mg/mL, fração não-alcaloídica (PAFNA) de 82% na concentração de 1 mg/mL e extrato etanólico (EERPA) de 78% na concentração de 1 mg/mL e isovoacristina hidroxi-indolenina (1) de 50% na concentração de 1 mg/mL, cujos resultados são apresentados na Tabela 3, juntamente com os valores de IC₅₀. Os dados mostram que extratos e substâncias apresentaram uma significativa atividade antioxidante que pode ser atribuída à presença dos alcaloides nesta espécie, sendo este o primeiro registro de atividade antioxidante em alcaloides do tipo iboga.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, CAPES, FUNCAP, PRONEX e FAPERJ pelas bolsas e auxílios financeiros, ao CENAUREMN-UFC pelos espectros de RMN.

REFERÊNCIAS

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Recebido em 18/10/08; aceito em 5/3/09; publicado na web em 26/8/09

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Pesquisador Visitante 1 - CNPq/Programa de Pós-Graduação em Química Orgânica

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Out 2009
• Data do Fascículo
  2009

Histórico

• Aceito
  05 Mar 2009
• Recebido
  18 Out 2008