Citocalasinas produzidas por Xylaria sp., um fungo endofítico de Piper aduncum (piperaceae)

Cytochalasins produced by Xylaria sp., an endophytic fungus from Piper aduncum

Xylaria sp.; Piper aduncum; endophytic fungus

ARTIGO

Citocalasinas produzidas por Xylaria sp., um fungo endofítico de Piper aduncum (piperaceae)^#

Cytochalasins produced by Xylaria sp., an endophytic fungus from Piper aduncum

Geraldo H. Silva^I; Camila M. de Oliveira^I; Helder L. Teles^I; Vanderlan da S. Bolzani^I; Angela R. AraujoI, ^*; Ludwig H. Pfenning^II; Maria Claudia M. Young^III; Claudio M. Costa-Neto^IV; Renato Haddad^V; Marcos N. Eberlin^V

^IInstituto de Química, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara - SP, Brasil

^IIDepartamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, 37200-000 Lavras - MG, Brasil

^IIISeção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, CP 4005, 01061-970 São Paulo - SP, Brasil

^IVDepartamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14049-900 Ribeirão Preto - SP, Brasil

^VInstituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP, Brasil

ABSTRACT

A chemical study on the EtOAc extract produced by Xylaria sp., an endophytic fungus from Piper aduncum, resulted in the isolation of a new cytochalasin 1, along with five known 19,20-epoxycytochalasin D (2), C (3), N (4), Q (5), and R (6). The 1-6 were evaluated against the fungi C. cladosporioides and C. sphaerospermum and only 5 showed weak activity. The cytotoxicity in vitro against HeLA and CHO cells lines were investigated and the cytochalasins 2-4, and 6 showed a strong activity against HeLA. The DNAdamaging activity of 1-6 were also investigated against mutant strains of S. cerevisiae.

Keywords:Xylaria sp.; Piper aduncum; endophytic fungus.

INTRODUÇÃO

Aproximadamente um quarto de todos os produtos naturais biologicamente ativos conhecidos têm sido produzidos por fungos.¹ Estes são estimados em 1,5 milhões de espécies² distribuídos principalmente entre fungos micoparasitas, coprófilos, de solo, de água doce, epifíticos e endofíticos. Fungos endofíticos são micro-organismos que habitam o interior de um vegetal,³ em pelo menos por um período de seu ciclo de vida. Apesar de serem produtores de metabólitos secundários biologicamente ativos,⁴ são pouco explorados.

Dando continuidade aos estudos de prospecção química e biológica em fungos endofíticos isolados de espécies vegetais do cerrado, a espécie vegetal Piper aduncum foi selecionada, pois a medicina popular relata propriedades diurética, cicatrizante e anti-hemorrágica.^5-7 Dados fitoquímicos de P. aduncum relatam a ocorrência de amidas, fenilpropanoides, di-hidrochalconas e derivados prenilados com atividades moluscida, bactericida e citotóxica.^8,9 Estes fatos, associados às observações de que micro-organismos endofíticos podem mimetizar a química de seus respectivos hospedeiros e produzirem substâncias ou derivados com maior bioatividade,¹⁰ direcionaram o estudo químico/biológico dos fungos endofíticos associados à P. aduncum.

P. aduncum foi submetida ao isolamento e à purificação dos endófitos e conduziu a seis linhagens puras. Após triagem química/biológica, a linhagem PA-01 foi classificada como Xylaria sp. e selecionada para estudo, mediante atividade seletiva do extrato bruto AcOEt contra a linhagem mutante de Saccharomyces cerevisiae RS 321 e contra os fungos fitopatogênicos C. cladosporioides e C. sphaerospermum.

O fungo Xylaria sp. foi cultivado no meio de cultura PDB, em escala ampliada, para obtenção do extrato bruto que, após fracionamento cromatográfico por CLAE, levou ao isolamento de uma citocalasina inédita (1) e das 19,20-epoxicitocalasina conhecidas D (2), C (3), N (4), Q (5) e (6). A estrutura das substâncias isoladas foi determinada com base nas análises dos dados espectrométricos de IV, EM-ES, RMN de ¹H e ¹³C (1D e 2 D).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A fórmula molecular da citocalasina 1 foi estabelecida como C₃₀H₃₇NO₇ por ESI-EMAR (m/z 524,2729 [M + H]⁺) e com auxílio dos espectros de RMN de ¹³C e DEPT. O espectro no IV mostrou as absorções de hidroxila (3440 cm^-1) e uma absorção larga (1710 cm^-1) atribuída a estiramentos C=O. A análise dos dados de RMN de ¹H, ¹³C e DEPT indicou a presença de quatro átomos de carbono carbonílico (sendo dois de grupos cetona), um anel benzênico monossubstituído, cinco metilas, onze átomos de carbono de grupos metínicos (dois olefínicos e três carbinólicos), dois metilênicos e dois átomos de carbono quaternário, sendo um carbinólico. O índice de deficiência de hidrogênio calculado foi igual a 13. Estes dados são característicos de substâncias da classe das citocalasinas. A atribuição de todos os átomos de hidrogênio aos respectivos átomos de carbonos foi realizada com auxílio dos mapas de contorno do experimento gHMQC.

A análise dos espectros de gCOSY e TOCSY indicou os átomos de hidrogênios acoplados em série e permitiu identificar os quatro sistemas de spins da molécula H-2' a H-6'; H-10 a H-12; H-8 a H-22 e H-19 a H-21. A estereoquímica da ligação dupla entre C-13 e C-14, assim como o epóxido em C-19 e C-20 foi definida como trans pelas constantes de acoplamento (J = 15,5 e 2,0 Hz, respectivamente).¹¹ A correlação gHMBC de H-10a (δ_H 2,68) com C-1´ (δ_C 137,5) confirmou a presença do grupo fenil em C-10. As correlações de H-12 (δ_H 1,01) e H-8 (δ_H 3,42) com C-7 (δ_C 212,6) e comparação com dados de citocalasa-13(E),19(E)-dieno-1,7,17-triona,¹² possibilitaram a elucidação do núcleo isoindolona. As correlações de H-22 (δ_H 1,12) e H-23 (δ_H 1,44) com C-17 (δ_C 214,9) e entre H-21 (δ_H 5,43) e C-8 (δ_C 51,2) e comparação com 19,20-epoxicitocalasina C (3)¹³ permitiram elucidar o anel macrocíclico.

As configurações relativas do núcleo isoindolona e do anel macrocíclico de 1 foram estabelecidas pelo experimento NOESY, onde se observou correlação entre H-4 e H-21, valores dos deslocamentos químicos de RMN de ¹H e ¹³C, constantes de acoplamento e comparação com 18,21-di-hidroxi-16,18-dimetil-10-fenil-citocalasa-13(E),19(E)-dieno-1,7,17-triona ¹² e com 19,20-epoxicitocalasina C (3),¹³ respectivamente, Figura 1. Estas informações permitiram estabelecer a configuração relativa da inédita citocalasina 1.

As substâncias 2-6 foram identificadas pela análise por EM, RMN de ¹H e ¹³C, gHMQC, gHMBC, gCOSY e NOESY e por comparação com dados descritos na literatura.¹³

As citocalasinas 1-6 (Figura 1) foram avaliadas quanto à atividade antifúngica, frente aos fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum, usando-se o método da autobiografia direta.¹⁴ A substância 5 mostrou uma fraca atividade na concentração de 100 μg mL^-1, quando comparada com o padrão nistatina (1μg mL^-1). As outras citocalasinas apresentaram-se inativas.

As substâncias 1-6 foram ensaiadas frente à linhagem mutante de Saccharomyces cerevisiae RS 321 mostrando-se inativas, o que indica não serem as responsáveis pela bioatividade inicialmente observada no extrato bruto.¹⁵

A avaliação da atividade citotóxica de 1-6 foi realizada em células de mamíferos das linhagens HeLa (tumor de cérvix humano) e CHO (ovário de hamster chinês).¹⁶ Para a linhagem não cancerígena CHO, as substâncias 2, 3, 5 e 6 apresentaram IC₅₀ de 90,0; 120,0; 125,0 e 4,00 μmol L^-1, respectivamente. As citocalasinas 1 e 4 não apresentaram IC₅₀ nas concentrações testadas, sendo que 1 foi totalmente inativa. A cisplatina foi usada como padrão com IC₅₀ = 20 μmol L^-1.

Na linhagem cancerígena HeLa as substâncias 1-6 apresentaram IC₅₀ de 43,0; 1,0; 2,0; 1,0; 3,0; e 3,0 μmol L^-1, respectivamente. A cisplatina foi usada como padrão com IC₅₀ = 5,0 μmol L^-1.

A forte atividade apresentada pelas citocalasinas 2-5 contra a linhagem cancerígena HeLa e a fraca contra a linhagem não cancerígena CHO evidenciam uma seletividade destas substâncias para as linhagens tumorais HeLa.

Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relato de citocalasinas sendo produzidas por fungos endofíticos associados à Piper aduncum.

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentação

Os espectros de absorção na região do IV foram obtidos em um espectrômetro Perkin Elmer- FT-IR, utilizando-se pastilhas de KBr. Os espectros de massas foram registrados em espectrômetro de massas de baixa resolução da marca Fisons, modelo VG Platfform II, no modo de ionização electrospray (ESI). Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em espectrômetro QTOF (Micromass), utilizando-se como método de ionização electrospray no modo positivo.

Os espectros de RMN foram registrados em CDCl₃ e DMSO-d₆, no espectrômetro Varian Inova 500, usando TMS como padrão de referência.

O aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi um Varian Pro Star, com detectores UV-Vis. As colunas analíticas e preparativas utilizadas foram Phenomenex tipo Luna - C18 (250 x 4,60 mm, 5 μm) e (250 x 21,20 mm, 10 μm), respectivamente.

Os meios de cultura líquido e sólido foram submetidos à esterilização em autoclave a 121 °C e 1 atm de pressão por 20 min.

Material vegetal

Folhas saudáveis de Piper aduncum foram coletadas na Casa de Vegetação do Instituto de Química - UNESP- Araraquara em maio de 2001.

Isolamento dos fungos endofíticos

As folhas coletadas foram lavadas com água e sabão, a seguir esterilizadas por imersão em NaClO (1%) por 5 min, seguido de etanol 70% por 1 min e lavadas com água esterilizada 2 vezes por 10 min.^17-22 As folhas esterilizadas foram assepticamente seccionadas em segmentos de 1 cm² aproximadamente e colocados em placa de Petri, contendo o meio de cultura batata dextrose ágar (PDA), marca Difco, preparado na concentração de 39 g/L, acrescido do antibiótico sulfato de gentamicina e incubado a 25 ºC. O crescimento dos fungos foi monitorado diariamente e, após cada cultura atingir de 1-2 cm em diâmetro, foram submetidos a sucessivas repicagens até obtenção das linhagens puras. Foram obtidas seis linhagens puras, codificadas como PA-01, PA-02, PA-03, PA-04, PA-05 e PA-06 e depositadas na micoteca do Departamento de Química Orgânica, IQ-UNESP. O isolado PA-01 foi identificado como Xylaria sp. pelo Prof. Dr. L. H. Pfenning e depositado na Coleção Micológica de Lavras, Universidade Federal de Lavras sob registro CML 292.

Cultivo em meio líquido e obtenção dos extratos brutos

O fungo endofítico Xylaria sp. foi repicado para placas de Petri, contendo PDA e incubado por 8 dias. A seguir foi inoculado em 20 frascos de Erlenmeyers (500 mL) contendo 200 mL de meio de cultivo PDB (DIFCO), preparado na concentração de 24 g/L, os quais foram mantidos em mesa agitadora a 120 rpm e 25 °C por 28 dias. Após este período o caldo foi separado do micélio por filtração, extraído com AcOEt (3 X 2 L) e concentrado, fornecendo 1,7 g de extrato bruto. O extrato AcOEt foi extraído com CHCl₃ obtendo-se assim a fração CHCl₃ (0,7 g).

Isolamento das citocalasinas

A fração CHCl₃ (0,7 g) foi fracionada em CC de sílica gel em fase reversa C-18, usando H₂O:MeOH em gradiente, fornecendo cinco frações: PA-01-1 (28,0 mg, H₂O:MeOH, 9:1), PA-01-2 (90 mg, H₂O:MeOH, 7:3), PA-01-3 (320 mg, H₂O:MeOH, 5:5), PA-01-4 (42 mg, H₂O:MeOH 3:7) e PA-01-5 (8 mg, H₂O:MeOH, 0:1). Estas foram analisadas por CLAE-DAD (Si C-18, gradiente H₂O:CH₃CN 5 a 100% de CH₃CN, 40 min, fluxo de 1 mL/min), sendo detectada uma alta concentração de citocalasinas na fração PA-01-3.

A fração PA-01-3 foi submetida à CLAE-prep em fase reversa [λ = 220 nm, 10 mL/min CH₃CN:H₂O (68:32)], resultando nas citocalasinas 1 (5,5 mg, t_R = 71 min), 2 (17,5 mg, t_R = 32 min), 3 (30,0 mg, t_R = 54 min), 4 (15,0 mg, t_R = 26 min), 5 (15,5 mg, t_R = 74 min), e 6 (12,5 mg, t_R = 43 min).

Bioensaios

Teste de bioautografia com fungos

Para avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto AcOEt e das substâncias 1-6 frente aos fungos fitopatogênicos C. cladosporioides e C. sphaerospermum, utilizou-se a metodologia descrita anteriormente na literatura.¹⁴ Os ensaios foram realizados nas concentrações de 5, 10, 20, 50 e 100 μg mL^-1, usando nistatina como controle positivo.

Teste para avaliação preliminar da atividade citotóxica

Para a avaliação da atividade citotóxica do extrato bruto AcOEt e das substâncias 1-6, foram utilizadas três linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae (rad+, 52Y e RS 321), segundo metodologia descrita na literatura.¹⁵ Os extratos foram testados na concentração de 2 mg mL^-1 e as substâncias puras com 0,5 mg mL^-1, como padrões foram utilizados: camptotecina: rad⁺ 200 μg mL^-1 (16,0 mm; 16,0 mm) e 52Y (5 μg mL^-1; 21,0 mm) e estreptonigrina: RS-321 (4 μg mL^-1 20,0 mm).

Determinação da viabilidade celular

Para a determinação da citotoxicidade das citocalasinas 1-6, foram utilizadas as linhagens de células de mamíferos HeLa (tumor de cérvix humano) e CHO (ovário de hamster chinês) na densidade de 2 x 10⁴ células poços". As substâncias foram solubilizadas em dimetilsulfóxido em concentrações finais de 0,2; 2,0; 20,0 e 200,0 μM. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT de acordo com a literatura¹⁶ e cisplatina usada como padrão positivo.

19,20-Epoxicitocalasina (1) (5,5 mg), sólido branco amorfo, [α]²⁵_D -17,1 (c 0,19, CHCl₃), IV (KBr, ν_max cm^-1): 3440, 2923, 2856, 1710, 1220, 1033. ESI-EMAR: m/z 524,2729 [M+H]⁺ Calcd para C₃₀H₃₇NO₇, (523,2570), RMN de ¹H e ¹³C, Tabela 1.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP, programa Biota-FAPESP (Instituto Virtual da Biodiversidade, www.biota.org) pelo auxílio financeiro, à CAPES e ao CNPq pelas bolsas concedidas (G. H. Silva, H. L. Teles, V. da S. Bolzani e M. C. M. Young) e à Profa. Dra. M. Furlan por gentilmente ter cedido folhas de Piper aduncum.

Recebido em 30/4/10; aceito em 6/10/10; publicado na web em 8/11/10

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Artigo em homenagem ao Prof. Hans Viertler

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Dez 2010
• Data do Fascículo
  2010

Histórico

• Recebido
  30 Abr 2010
• Aceito
  06 Out 2010