Constituintes químicos de Hyptidendron canum (Pohl ex Benth.) R. Harley (Lamiaceae)

Chemical constituents of Hyptidendron canum (Pohl ex Benth.) R. Harley (Lamiaceae)

Hyptidendron canum; triterpenes; antifungal activity

ARTIGO

Constituintes químicos de Hyptidendron canum (Pohl ex Benth.) R. Harley (Lamiaceae)

Chemical constituents of Hyptidendron canum (Pohl ex Benth.) R. Harley (Lamiaceae)

Geralda de Fátima Lemes^I,*; Pedro Henrique Ferri^I; Márcia Nasser Lopes^II

^IInstituto de Química, Universidade Federal de Goiás, Campus Samambaia, CP 131, 74001-970 Goiânia - GO, Brasil

^IIInstituto de Química, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14800-900 Araraquara - SP, Brasil

ABSTRACT

Chemical investigation of Hyptidendron canum stems resulted in the isolation of betulinic, ursolic and euscaphic acids. From the leaves were isolated 3β-O-β-galactopiranosilsitosterol, ursolic aldehyde, and mixtures of maslinic acid and 2α-hydroxyursolic acid, α and β-amyrin, uvaol and erythrodiol, sitosterol and stigmasterol, spathulenol and globulol. Hexane and chloroform leave fractions as well as ursolic and betulinic acids showed antifungal activities against the yeast form of Paracoccidioides brasiliensis.

Keywords:Hyptidendron canum; triterpenes; antifungal activity.

INTRODUÇÃO

A família Lamiaceae possui aproximadamente 4000 espécies distribuídas em 220 gêneros, cujas espécies são representadas em geral por ervas, subarbustos ou arbustos e encontram-se distribuídas em quase todas as regiões do globo, especialmente na região do Mediterrâneo e Ásia central.¹ As espécies desta família acumulam substâncias com grande diversidade estrutural, tais como esteroides, flavonoides, iridoides e terpenoides, incluindo os triterpenos pentacíclicos.² Estes últimos são conhecidos por apresentarem atividades antitumoral, anti-HIV, anti-inflamátoria, antioxidante, antibacteriana, antifúngica, entre outras.³

O gênero Hyptidendron, com aproximadamente 18 espécies, foi proposto juntamente com o gênero correlato Hypenia, a partir de uma revisão taxonômica do gênero Hyptis Jacq. Neste estudo, além dos critérios tradicionais, avaliaram-se também a morfologia do pólen e ramos, bem como o número de cromossomos.⁴ A espécie Hyptidendron canum (Pohl ex Benth.) R. Harley (sinonímia: Hyptis cana Pohl ex Benth.) é encontrada principalmente no Planalto Central, abrangendo os estados de Goiás, Mato Grosso e Minas Gerais, ocorrendo mais habitualmente em sítios abertos e nas encostas de serras.⁵ Essa espécie é utilizada na medicina popular na forma de sucos, infusões e decocções das folhas e raízes, devido às propriedades citotóxica, antifúngica, anti-reumática, anti-inflamatória, antimalárica e antiulcerativa.⁶

A micose sistêmica humana paracoccidioidomicose atua como doença pulmonar primária, frequentemente assintomática, disseminável, e que resulta da inalação de conídios do fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, encontrados no solo e em plantas nas regiões subtropicais da América Latina. Esta doença acomete principalmente trabalhadores do sexo masculino em fase produtiva, especialmente em zonas rurais da região centro-oeste, considerada um centro de endemia de paracoccidioidomicose.⁷ As opções farmacêuticas atuais são tóxicas e em tratamento prolongado as linhagens têm apresentado resistência.⁸ Dessa forma, a busca de alternativas para o tratamento dessa micose constitui um problema relevante em saúde ambiental, especialmente nesta região. Estudos prévios demonstraram que o extrato etanólico das folhas de H. canum apresentou inibição de crescimento de leveduras de P. brasiliensis, a forma infectante do fungo.⁷ Neste contexto, o presente trabalho descreve o isolamento dos principais metabólitos secundários que ocorrem nas folhas e caule de H. canum, até o momento não investigadas, juntamente a avaliação de atividade antifúngica frente a leveduras de P. brasiliensis, visto que os trabalhos anteriores sobre H. canum descreveram a composição química do óleo essencial⁹ e a avaliação das atividades antimicrobiana e fungicida de extratos.¹⁰

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo químico do caule de H. canum permitiu o isolamento da mistura de sitosterol (1) e estigmasterol (2),¹¹ dos ácidos betulínico (3),^12,13 ursólico (4) e do 2α,3α,19α-tri-hidróxiurs-12-en-28-oico (ácido euscáfico) (5), além do 3β-O-β-galactopiranosilsitosterol (6).¹⁴ Já a investigação fitoquímica das folhas conduziu ao isolamento da mistura dos triterpenos ácidos 2α,3β-di-hidróxiurs-12-en-28-oico (7) e 2α,3β-di-hidróxiolean-12-en-28-oico (ácido maslínico) (8), α-amirina (10) e b-amirina (11),¹² da flavona salvigenina (9), e na mistura de espatulenol (12) e globulol (13),^15,16 do 3β-hidróxiurs-12-en-28-al (aldeído ursólico) (14), assim como na mistura de uvaol (15) e eritrodiol (16), e dos esteroides identificados no caule (Figura 1).

Com execeção dos sesquiterpenos espatulenol e globulol, os quais foram previamente identificados no óleo essencial das folhas da referida espécie, todas as substâncias isoladas neste trabalho são descritas pela primeira vez na espécie. A identificação estrutural baseou-se a partir dos dados espectroscópicos, particularmente RMN ¹H e ¹³C, e por comparação com os dados disponíveis na literatura.

A substância 4 foi obtida da fração acetato de etila das folhas como um sólido branco com ponto de fusão de 274-275 ºC. No espectro de RMN ¹H foram observados os sinais de hidrogênios metílicos em δ 0,78 (3H, s, H-25), 0,99 (3H, s, H-24), 1,08 (3H, s, H-26), 1,14 (3H, s, H-27), 1,26 (3H, s, H-23), 0,88 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-29), e 0,97 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-30). Foi observado também um duplo-dubleto em δ 3,19 (1H, J = 10 e 5 Hz, H-3), característico de hidrogênio carbinólico em triterpenos 3β-OH, um sinal em δ 5,24 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-12) típico de hidrogênio olefínico e um sinal em δ 2,20 (1H, J = 12,0 Hz) referente ao hidrogênio alílico H-18, permitindo sugerir uma estrutura triterpênica com esqueleto ursano. Esses dados em conjunto com a análise do espectro de RMN ¹³C e DEPT 135º (Tabela 1), no qual foram identificados os sinais em δ 124,5 e 137,6 referentes aos carbonos olefínicos C-12 e C-13, além dos sinais em δ 77,6 e 179,2 atribuídos aos carbonos carbinólico (C-3) e carboxílico (C-28), respectivamente, e em adição aos dados espectroscópicos descritos na literatura, permitiram constatar que a substância majoritária na fração acetato de etila é o ácido ursólico.¹⁷

O espectro de RMN ¹H de 5 apresentou os sinais em δ 3,15 (1H, sl, H-3) e 3,95 (1H, m, H-3) referentes a hidrogênios carbinólicos e um singleto em δ 5,15 correspondente ao hidrogênio olefínico (H-12), além dos sinais em δ 0,70-1,28, referentes a hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos. A análise dos dados de RMN ¹³C (Tabela 1) permitiu definir o esqueleto triterpênico, tipo ursano, principalmente pela presença dos sinais em δ 128,3 e 138,3 relativos aos carbonos olefínicos C-12 e C-13, respectivamente. Observaram-se também sinais referentes a carbonos hidroximetínicos em δ 65,8 e 78,4, além do sinal em δ 72,7 correspondente a carbono carbinólico terciário. Ao se comparar os dados de RMN ¹³C de 5 com os do ácido ursólico foi possível observar efeito de desblindagem sobre os deslocamentos químicos dos carbonos C-12, C-17 e C-20 de aproximadamente 3,8; 0,5 e 2,6 ppm, respectivamente, além do efeito γ (blindagem) em C-21 e C-30, sugerindo a presença de uma hidroxila em C-19. A localização das outras duas hidroxilas em C-2 e C-3 e as estereoquímicas relativas das mesmas foram atribuídas com base nos trabalhos de Kojima e Ogura.¹⁸ A análise dos dados de RMN ¹H e ¹³C de 5 com os valores registrados na literatura levaram a concluir que a substância isolada é o ácido 2α,3α,19α-tri-hidróxiurs-12-en-28-oico (ácido euscáfico).¹⁹

O espectro de RMN ¹H da mistura de 7 e 8 apresentou os sinais em δ 5,15 (1H, sl, H-12) e 5,30 (1H, sl, H-12), que correspondem a hidrogênios olefínicos, além dos sinais em δ 0,73-1,26 e 1,35 e 2,34, que foram atribuídos a prótons metílicos, metilênicos e metínicos, respectivamente. Os pares de sinais no espectro de RMN ¹³C (Tabela 1) em δ 124,4 e 137,9 e em 121,4 e 143,6, característicos de carbonos olefínicos, confirmam a mistura de triterpenos ursano e oleanano. Entre outros, os sinais em δ 67,3 e 82,3 e em 67,9 e 82,9 foram atribuídos a carbonos carbinólicos C-2 e C-3, respectivamente. Essas informações em conjunto com dados da literatura permitiram identificar os ácidos 2α,3δ-di-hidróxiurs-12-en-28-oico¹⁹ e o ácido 2α,3δ-di-hidróxiolean-12-en-28-oico (ácido maslínico).¹⁷

A estrutura da flavona 9 foi definida com base nos dados fornecidos pelos espectros de RMN ¹H e ¹³C, bem como através da comparação dos valores dos seus deslocamentos químicos com os descritos na literatura.²⁰ O espectro de RMN ¹H mostrou sinais em δ 7,02 (d, J = 8,8 Hz) e d 7,85 (d, J = 8,0 Hz), característicos de hidrogênios aromáticos, uma absorção em δ 12,77 indicando um próton hidroxílico envolvido em ligação de hidrogênio intramolecular, além dos singletos em δ 3,90; 3,93 e 3,97, indicando a presença de grupamento metoxílico aromático. A análise do espectro de RMN ¹³C evidenciou os sinais de absorção em δ 55,2; 55,5 e 59,3, referentes aos grupamentos metoxílicos, além dos sinais em δ 90,8; 104,1; 105,0; 114,5; 122,1; 127,9; 131,4; 152,5; 162,1 e 181,9 que confirmaram a estrutura da salvigenina para a substância 9.

O espectro de RMN ¹H da substância 14 mostrou-se semelhante ao do ácido ursólico. A principal diferença foi à presença de um singleto em δ 9,32 referente a um hidrogênio aldeídico. Observaram-se, ainda, sinais em δ 0,80-1,40 e 3,20 (m, H-3), atribuídos a hidrogênios metílicos e carbinólico, respectivamente, além de um multipleto em δ 5,29 (1H) referente ao hidrogênio olefínico H-12. No espectro de RMN ¹³C (Tabela 1) foi observado o sinal do carbono aldeídico em δ 207,5. Essa função foi localizada em C-28 e foi observada uma desblindagem nos deslocamentos químicos em C-17 e C-28 em aproximadamente 2,9 e 28,3 ppm, e uma blindagem em C-22 em 2,9 ppm, em comparação aos do ácido ursólico. A comparação de dados espectroscópicos de 14 com dados da literatura conduziu ao 3β-hidróxiurs-12-en-28-al (aldeído ursólico).¹⁷

O espectro de RMN ¹H da mistura de 15 e 16 apresentou os sinais em δ 3,21 (2H, dd, J = 10,5 e 3,5 Hz, H-3) referentes aos hidrogênios carbinólicos, além dos sinais em δ 5,13 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-12) e 5,18 (1H, J = 3,0 Hz, H-12) atribuidos a hidrogênios olefínicos. A análise do espectro de RMN ¹³C (Tabela 1) mostrou que se tratavam de triterpenos do tipo oleanano e ursano, pelos sinais em δ 125,5 e 139,2 e em δ 122,8 e 144,7 característicos de carbonos olefínicos. Essas informações em conjunto com dados espectroscópicos descritos na literatura conduziram à identicação das substâncias uvaol e eritrodiol.^12,21

As frações hexânica, clorofórmica e metanólica, oriundas do fracionamento do extrato etanólico das folhas, e a substância 4 foram avaliadas em ensaios antifúngicos frente a leveduras de P. brasiliensis (linhage Pb 01). As frações apresentaram uma porcentagem de inibição do crescimento (PIC) do fungo em 96,9; 100 e 37,5%, respectivamente, enquanto que o ácido ursólico (4) apresentou um PIC de 90,9% (1000 µg mL^-1). As frações clorofórmica e acetato de etila do extrato etanólico do caule de H. canum apresentaram uma moderada fungitoxicidade, com PIC de 50 e 43,7%, respectivamente, ambas na concentração de 1000 µg mL^-1, enquanto que o ácido betulínico (3), principal constituinte da fração acetato de etila do caule de H. canum, apresentou um valor de PIC de 53%, na concentração de 300 µg mL^-1. Esses resultados indicaram uma potencial fungitoxicidade das substâncias isoladas de H. canum, quando comparadas à opção terapêutica corrente, anfotericina B, utilizada como controle na concentração de 30 µg mL^-1 (PIC = 90%).

A investigação química das folhas e caules de H. canum evidenciou a predominância de triterpenos pentacíclicos. Os ácidos betulínico e ursólico foram os constituintes majoritários das frações acetato de etila do caule e das folhas, respectivamente. O ácido betulínico tem apresentado atividades anti-HIV-1,^22,23 antibacteriana, antifúngica, antiplasmódica e anti-inflamatória,^22,24 além de inibir o crescimento de células canceríginas, sem afetar as células normais. Por sua vez, o ácido ursólico tem apresentado atividades antitumoral, antioxidante, hepatoprotetora, antialérgica, gastroprotetora,²⁵ além de ação anti-inflamatória.²⁶

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN ¹H e ¹³C foram obtidos em um espectrômetro Brucker AC-200F, operando na frequência de 200 MHz para hidrogênio (¹H) e 50 MHz para carbono-13 (¹³C). Foi utilizado também um espectrômetro Inova-500, operando a 500 MHz. O TMS foi utilizado como padrão de referência em todas as aquisições de RMN, com os solventes CDCl₃ (Merck) e DMSO-d₆ (Aldrich). Para as separações cromatográficas em coluna de média pressão utilizou-se sílica gel (Merck, 230-400 mesh ASTM). Nas separações por cromatografia líquida sob vácuo (CLV) empregou-se sílica gel 60 (Merck, 70-230 mesh ASTM). Nas análises por CCDC e CCDP foram utilizadas placas de sílica gel 60 G F₂₅₄. As placas foram observadas sob luz UV 254 e 366 nm (Chromatovus) e reveladas com vapores de iodo ressublimado e solução de anisaldeído, seguida de aquecimento.

Material botânico

H. canum foi coletado em Pirenópolis/GO, em agosto de 1996, e identificado pelo Prof. Dr. H. D. Ferreira, do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás. A exsicata do material botânico encontra-se depositada no Herbário da UFG com o número de registro UFG18921.

Extração e isolamento dos constituintes químicos

O caule de H. canum (118 g) seco e moído foi submetido à extração exaustiva com etanol 96% à temperatura ambiente. Após filtração e evaporação sob pressão reduzida, em evaporador rotativo, obtiveram-se 6 g do extrato bruto do caule (EBC) seco. Parte deste extrato (5,5 g) foi submetida à cromatografia líquido sob vácuo (CLV) empregando sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM), como fase estacionária e como solventes hexano, CHCl₃, AcOEt e MeOH. Após as evaporações dos solventes em evaporador rotativo, obtiveram-se as frações clorofórmica (C: 0,2 g), acetato de etila (AC: 2,4 g) e metanólica (M: 3,0 g).

A fração AC (2,4 g) foi fracionada em uma coluna de sílica gel eluída com hexano:AcOEt e AcOEt:CH₃OH em gradiente de polaridade, da qual foram coletadas 100 subfrações de 10 mL cada, e 30 subfrações de 50 mL, que após análise por CCDC foram agrupadas em 30 subfrações. A subfração 8, eluída com Hex:AcOEt 20%, forneceu uma mistura das substâncias 1 e 2 (27,5 mg). A substância 3 foi obtida da subfração 12-16 (1,6 g), após recristalização em metanol. A subfração 28 (78,1 mg) foi submetida à purificação por CCDP (sílica gel; CHCl₃:MeOH 10%), fornecendo a substância 6 (20,1 mg).

A subfração 18-24 (1,7 g) foi fracionada em coluna de sílica gel com um gradiente da mistura CHCl₃:MeOH fornecendo 10 subfrações, após análise por CCDC. A subfração 4-7, eluída com CHCl₃:MeOH 10%, forneceu a substância 4 (80,5 mg). A subfração 8-10 (586,9 mg) foi refracionada em coluna de sílica gel empregando-se um gradiente de CHCl₃:MeOH. Desta coluna foram obtidas 8 subfrações. A substância 5 (19 mg) foi isolada da subfração 3, eluída com CHCl₃:MeOH 5%.

As folhas de H. canum (275 g) foram secas, pulverizadas e extraídas exaustivamente com etanol 96% à temperatura ambiente. Após filtração e evaporação do solvente sob pressão reduzida, obtiveram-se 9,2 g do extrato bruto das folhas (EF). Desse total, 9 g foram fracionadas em uma coluna de sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM) utilizando como eluentes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol que, após a eliminação do solvente em evaporador rotativo, forneceram as frações hexânica (HF: 0,2 g), clorofórmica (CF: 1,9 g), acetato de etila (ACF: 6,3 g) e metanólica (MF: 0,5 g).

Parte da fração ACF (2,8 g) foi fracionada em coluna de sílica gel utilizando misturas de hexano:AcOEt e AcOEt:MeOH, obtendo-se 30 subfrações. A subfração 4-17, eluída com hexano:AcOEt 50%, forneceu a substância 4 (490, 8 mg). A subfração 18-20 (123,4 mg) foi refracionada em coluna de sílica gel com gradiente de CHCl₃:MeOH. A mistura de 7 e 8 (16,2 mg) foi obtida da subfração 13 e, na subfração 19-21, isolou-se a substância 6 (6,2 mg). Posterior refracionamento do extrato bruto das folhas por CLV forneceu a fração CHCl₃:AcOEt 20% (3,9 g), a qual foi submetida a fracionamento em coluna de sílica gel, utilizando misturas de hexano:AcOEt e AcOEt:MeOH em ordem crescente de polaridade. As 110 primeiras subfrações foram reagrupadas por similaridade, após análise por CCD, em 43 subfrações. A purificação das subfrações 26 (67 mg) e 30 (28 mg) por CCDP (sílica gel; hexano:AcOEt 10%; com duas eluíções) forneceu a substância 9 (9 mg) e a mistura de 10 e 11 (14,3 mg), respectivamente. A subfração 31-32 (56 mg) foi submetida à CCDP (sílica gel; hexano:AcOEt 10%) resultando na mistura de 12 e 13 (17,7 mg), enquanto que a subfração 34 (60 mg) forneceu a substância 14 (9,3 mg), após purificação por CCDP (sílica gel; hexano:AcOEt 20%). Finalmente, a subfração 40 (125 mg) após fracionamento em coluna de sílica gel empregando como eluente CHCl₃:MeOH 2% conduziu a uma mistura das substâncias 15 e 16 (16,2 mg).

Micro-organismo

Para a avaliação da atividade antifúngica foram utilizadas leveduras de P. brasiliensis provenientes do isolado clínico de paciente com paracoccidioidomicose (Pb01), recentemente depositada na ATTC (MYA 826). As leveduras foram cultivados em tubos de ensaio, em ágar Sabouraud acrescido de dextrose e cloranfenicol (2,7 mg mL^-1) e incubado a 37 ºC por 10 dias.

Avaliação da susceptibilidade antifúngica

As frações e as substâncias teste foram previamente dispersas em DMSO (1 mL) e água destilada estéril (1 mL), incorporada ao meio Sabouraud, fornecendo concentrações de 300 e 1000 µg mL^-1. Colônias jovens (duas colônias; 3 mm de diâmetro) de P. brasiliensis foram transferidas para o centro do meio de cultura e incubadas durante 15 dias a 37 ºC. A inibição do crescimento das leveduras foi avaliada pela medida (mm) do diâmetro das colônias, a cada 5 dias, e os resultados foram expressos como porcentagem de inibição de crescimento (PIC), obtidos pela expressão: [(1 - φTratamento/φControle)] ' 100, onde φ é a variação do diâmetro em relação à colônia inicial.¹⁰ Todos os experimentos foram realizados em duplicata e comparados ao controle, anfotericina B (Bristol-Myers Squibb, USA), na concentração de 30 µg mL^-1, submetido ao mesmo procedimento das amostras.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. H. D. Ferreira (ICB/UFG) pela coleta e identificação botânica e à Profa. Dra. M. do R. R. Silva (IPTSP/UFG) pela realização dos bioensaios com P. brasiliensis. Ao IQ/UFG pela licença concedida a um dos autores (G. de F. Lemes).

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Recebido em 14/12/09; aceito em 2/7/10; publicado na web em 16/11/10

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Fev 2011
• Data do Fascículo
  2011

Histórico

• Aceito
  02 Jul 2010
• Recebido
  14 Dez 2009