Glicoalcaloides antifúngicos, flavonoides e outros constituintes químicos de Solanum asperum

Antifungal glycoalkaloids, flavonoids and other chemical constituents of Solanum asperum Rich (Solanaceae)

Resumo

Two glycoalkaloids: solamargine and solasonine; three flavonoids: tiliroside, 7-O-α-L-ramnopyranosyl-kaempferol and 3-O-[ß-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-ramnopyranosyl]-7- O-α-L-ramnopyranosyl-kaempferol, in addition to the tripeptide Leu-Ile-Val, the aminoacid proline and the eicosanoic acid were isolated from Solanum asperum (Solanaceae). The structures of all compounds were determined by interpretation of their spectra (IR, MS, ¹H and 13C NMR) and comparison with the literature data. All compounds, except the glycoalkaloids, are being reported for the first time for S. asperum. Solasonine showed strong activity (MIC < 0.24 μg/mL) against four filamentous fungi species of the genera Microsporum and Trichophyton.

Solanum asperum; antifungal glycoalkaloids; flavonoids

Solanum asperum; antifungal glycoalkaloids; flavonoids

ARTIGO

Glicoalcaloides antifúngicos, flavonoides e outros constituintes químicos de Solanum asperum

Antifungal glycoalkaloids, flavonoids and other chemical constituents of Solanum asperum Rich (Solanaceae)

Francisco das Chagas L. Pinto^I; Daniel Esdras de A. Uchoa^I; Edilberto R. Silveira^I; Otília Deusdênia L. PessoaI, ^*; Raimundo Braz-FilhoI, ^#; Fernanda M. e Silva^II; Phellipe N. E. T. Theodoro^II; Laila S. Espíndola^II

^IDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, CP 12200, 60021-940 Fortaleza - CE, Brasil

^IIFaculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, CP 4478, 70919-970 Brasília - DF, Brasil

ABSTRACT

Two glycoalkaloids: solamargine and solasonine; three flavonoids: tiliroside, 7-O-α-L-ramnopyranosyl-kaempferol and 3-O-[ß-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-L-ramnopyranosyl]-7- O-α-L-ramnopyranosyl-kaempferol, in addition to the tripeptide Leu-Ile-Val, the aminoacid proline and the eicosanoic acid were isolated from Solanum asperum (Solanaceae). The structures of all compounds were determined by interpretation of their spectra (IR, MS, ¹H and ¹³C NMR) and comparison with the literature data. All compounds, except the glycoalkaloids, are being reported for the first time for S. asperum. Solasonine showed strong activity (MIC < 0.24 μg/mL) against four filamentous fungi species of the genera Microsporum and Trichophyton.

Keywords:Solanum asperum; antifungal glycoalkaloids; flavonoids.

INTRODUÇÃO

A família Solanaceae é representada por aproximadamente 2000 espécies distribuídas em 95 gêneros, sendo o taxon Solanum o mais representativo, com aproximadamente 1500 espécies e 5000 epítetos. As plantas que representam este gênero estão distribuídas preferencialmente nas áreas tropicais e subtropicais do planeta, sendo a América do Sul, o centro de maior diversidade e distribuição.¹ Uma grande fração do total de espécies descritas pode ser encontrada no Brasil, particularmente, na região Nordeste, onde são catalogadas cerca de 350 espécies.² Várias plantas deste gênero são popularmente conhecidas como "jurubebas", muitas das quais são largamente utilizadas na medicina popular, especialmente no tratamento de doenças da pele ou doenças relacionadas ao fígado e baço.^3,4

As plantas do gênero Solanum destacam-se pela capacidade de biossintetizar esteroides e alcaloides, livres ou na forma de heterosídeos, metabólitos secundários estruturalmente diversificados e complexos.^5,6 Estes compostos, em geral, são de interesse terapêutico, visto que apresentam um grande leque de atividades, como citotóxica,⁵ anticâncer,⁷ anti-inflamatória,⁸ antiulcerogênica⁹ e moluscicida.¹⁰ Além disso, são também responsáveis pela resistência natural das espécies em seu ecossistema.¹¹ Compostos fenólicos, principalmente flavonas e flavonóis, incluindo seus heterosídeos, são também identificados com frequência em espécies de Solanum.^1,12

Como parte de um estudo multidisciplinar, cujo objetivo é investigar plantas da família Solanaceae, na busca por compostos bioativos, especialmente com atividade anticâncer, já foram isoladas várias lactonas esteroidais.^13,14 Neste trabalho é relatado o resultado obtido com a prospecção química de Solanum asperum Rich, popularmente conhecido como "coça-coça" ou "russara". As plantas desta espécie apresentam porte arbustivo e todas as suas partes são pulverulentas, isto é, ricas em pelos urticantes que se desprendem facilmente e que, em contato com a pele, provocam intensa coceira, daí o nome popular. Concomitante ao estudo químico foi ainda investigado o potencial antifúngico de algumas das substâncias isoladas.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os pontos de fusão foram obtidos em equipamento de microdeterminação digital da Mettler Toledo com placa aquecedora FP82HT e central de processamento FP90. As determinações foram realizadas a uma velocidade de aquecimento de 2 ºC/min e não foram corrigidas. Os espectros no infravermelho foram registrados em espectrômetro Perkin - Elmer Spectrum 1000 FTIR, utilizando pastilhas de KBr. Os espectros de RMN ¹H e ¹³C, uni e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro Bruker Avance DRX-500 (500 MHz para ¹H e 125 MHz para ¹³C). Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em espectrômetro de massa Shimadzu, QP 5000/DI-50, por impacto eletrônico a 70 eV. Nas cromatografias de adsorção utilizou-se gel de sílica 60 da Vetec (Ø μm, 70-230 mesh) e Merck (Ø μm, 230-400 mesh), enquanto nos fracionamentos cromatográficos por exclusão molecular foi empregado Sephadex LH-20 (Pharmacia). As cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) foram realizadas em cromatoplaca de sílica gel (Merck) com indicador de fluorescência (F₂₅₄). As substâncias foram reveladas pela exposição a vapores de iodo, ou por aspersão de solução de vanilina/ácido perclórico/EtOH, seguida de aquecimento em estufa (≈ 100 ºC), ou ainda por imersão em solução do reagente Dragendorff.

Material vegetal

As folhas e frutos de S. asperum foram coletados no município de Guaramiranga, Ceará, em agosto de 2007. A autenticação do material vegetal foi realizada pelo Prof. E. P. Nunes do Departamento de Biologia - UFC. Uma exsicata representando a coleta da planta encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra (EAC) da Universidade Federal do Ceará, sob o número de registro 29232.

Extração e isolamento

Os frutos (74,6 g) e folhas (500 g) de S. asperum, secos e triturados, foram separadamente submetidos à maceração exaustiva com EtOH (3 x 0,5 L para os frutos e 3 x 6 L para as folhas). Após evaporação do solvente, sob pressão reduzida, foram obtidos 6,0 g (8%) de extrato dos frutos e 40,0 g (8%) de extrato das folhas. Os resíduos vegetais de frutos e folhas, foram em seguida, extraídos com uma mistura de EtOH/H₂O/AcOH 90:7:3 (8 L). As soluções resultantes de cada extração foram reduzidas em evaporador rotativo a 1/3 do volume inicial e, em seguida, submetidas à partição liquido/líquido. A solução dos frutos (500 mL) foi extraída com CH₂Cl₂ (3 x 50 mL), resultando em 720,0 mg de extrato, enquanto a fase aquosa depois de neutralizada com NH₄OH forneceu um precipitado (300,0 mg) que, em CCDA, mostrou teste positivo com o reagente Dragendorff. A cromatografia por exclusão molecular em Sephadex LH-20 deste precipitado, usando MeOH como eluente, resultou no isolamento de um sólido branco amorfo, o qual foi identificado como sendo o glicoalcaloide solamargina (1; 26,0 mg; p.f. 278-279 °C). O extrato etanólico dos frutos (6,0 g) foi dissolvido em MeOH/H₂O (7:3) e particionado com hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt (3 x 100 mL para cada solvente). As soluções de cada solvente foram reunidas, secas com Na₂SO₄ anidro, filtradas e concentradas sob pressão reduzida fornecendo as seguintes frações: hexano (800,0 mg), CH₂Cl₂ (410,0 mg) e AcOEt (169,6 mg). Estas frações, juntamente com a fração hidrometanólica, foram submetidas ao teste de Dragendorff, porém, somente a fração hidrometanólica (4,4 g) apresentou teste positivo. Deste modo, este material foi submetido à cromatografia em Sephadex LH-20, utilizando MeOH como eluente. Ao final, foram obtidas 26 frações de 20 mL que, após serem monitoradas por CCDA, foram reunidas em 6 frações (A-I a A-VI). A fração A-II (489 mg), após cromatografia flash, usando o sistema de eluição AcOEt/MeOH 6:4, resultou no isolamento de um sólido branco amorfo, identificado como solasonina (2; 40,0 mg; p.f. 286-287 °C).

O extrato etanólico das folhas (40,0 g) foi dissolvido em 120 mL de uma mistura MeOH/H₂O (7:3) e extraído (3 x 100 mL) com os solventes hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt. As frações obtidas foram secas com Na₂SO₄ anidro, filtradas e concentradas, obtendo-se as frações hexano (11,26 g), CH₂Cl₂ (3,43 g) e AcOEt (1,24 g). A fase hidrometanólica, após ser concentrada, resultou em (23,04 g) de material. Da fração hexânica (11,26 g), após sucessivas cromatografias em coluna usando como eluente misturas de hexano/AcOEt, foi isolado o ácido eicosanoico (8,0 mg), por eluição com hexano/AcOEt 7:3. A fração CH₂Cl₂ (3,34 g) foi submetida à cromatografia em gel de sílica, empregando o sistema de solventes CH₂Cl₂/MeOH, sozinhos ou em gradiente de polaridade crescente. Foram coletadas 40 frações de 10 mL, as quais após monitoramento em CCDA foram reunidas em 8 frações (B-I a B-VIII). A fração B-VII (268,0 mg), obtida por eluição com CH₂Cl₂/MeOH 1:1, foi submetida à cromatografia de exclusão molecular em Sephadex LH-20 e por eluição com MeOH, fornecendo o heterosídeo tilirosídeo (3; 21,0 mg; p.f. 264-265 °C). A fração AcOEt (1,24 g), após ser fracionada em Sephadex LH-20, usando MeOH com eluente, resultou em 22 frações que, depois de monitoradas em CCDA, foram reunidas em 6 frações (C-I a C-VI). A fração C-VI (63,6 mg), após cromatografia flash, empregando como eluente AcOEt/MeOH 9:1, forneceu outro heterosídeo, o 7-O-α-L-ramnopiranosil-kanferol (4; 15,0 mg; p.f. 206-207 °C). A fração AcOEt (1,64 g), proveniente da extração com EtOH/H₂O/AcOH 90:7:3 das folhas, após cromatografia de exclusão molecular, utilizando MeOH como fase móvel, resultou no isolamento de um outro heterosídeo flavonoídico, o 3-O-[ß-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7- O-α-L-ramnopiranosil-kanferol (5, 40 mg; p.f. 197-198 °C). A fração hidrometanólica (23,0 g), remanescente da partição do extrato EtOH das folhas, foi submetida à cromatografia gravitacional utilizando como fase móvel os sistemas de solventes CH₂Cl₂/MeOH/H₂O 8:2:0,1/ 7:3:0,1/ 6:4:0,1 e Me₂CO/MeOH 1:1 (200 mL para cada sistema de solventes). Da fração CH₂Cl₂/MeOH/H₂O 7:3:0,1 (1,8 g), após sucessivos fracionamentos cromatográficos, empregando Sephadex LH-20 e MeOH como eluente, foi isolado um sólido branco amorfo, caracterizado como sendo um tripeptídeo (6, 9,3 mg, p.f. 181-182 °C). Da fração CH₂Cl₂/MeOH/H₂O 6:4:0,1 (3,5 g), após sucessivas cromatografias usando Sephadex LH-20, foi obtido o aminoácido, prolina (7, 50,0 mg; p.f. 133-134 °C).

Ensaio da atividade antifúngica

Micro-organismos

Os fungos utilizados na avaliação da atividade foram isolados clínicos de dermatófitos das espécies Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis e M. gypseum, e duas leveduras American Type Culture Collection (ATCC), Candida albicans ATCC 10231 e C. parapsilosis ATCC 22019. Os fungos foram mantidos em tubos de ensaio com meio Agar batata dextrose a 35 °C (CLSI Documento M27-A2 e M38-A).^15,16

Concentração inibitória mínima

Para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) foram utilizados os protocolos M27-A2¹⁵ para leveduras e o M38-A¹⁶ para fungos filamentosos do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Utilizando-se a técnica de microdiluição em placas de 96 poços foram realizados os cálculos de CIM, sendo utilizado o meio de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 (Sigma^®) como controle negativo e o itraconazol e fluconazol como controles positivos. As amostras foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO). Os testes foram realizados em triplicata, sendo a concentração de DMSO inferior a 5%. O tempo de incubação foi de 48 h para leveduras e de 72 h para dermatófitos, à 35 ºC. A menor concentração capaz de inibir totalmente o crescimento do fungo foi considerada o valor de CIM.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A prospecção química dos frutos de S. asperum culminou no isolamento dos glicoalcaloides, solamargina (1)¹⁷ e solasonina (2),¹⁸ os quais foram recentemente publicados a partir da espécie em estudo, incluindo sua propriedade moluscicida.¹⁰ Das folhas de S. asperum foram isolados os flavonoides, tilirosídeo¹⁹ (3), 7-O-α-L-ramnopiranosil-kanferol (4) e 3-O-[ß-D-glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7- O-α-L-ramnopiranosil-kanferol^20,21 (5), um tripeptídeo (6) e o aminoácido prolina²² (7), Figura 1. Além dos compostos indicados acima, foi isolado o ácido eicosanoico, cuja estrutura foi identificada por CG-EM. As estruturas de 1-6 foram determinadas por RMN ¹H e ¹³C, incluindo experimentos bidimensionais, como COSY, HSQC e HMBC, além de IV e EM.

O composto 6 foi isolado como um sólido branco amorfo, p.f. 181-182 °C. A fórmula molecular C₁₇H₃₃N₃O₄ foi determinada por combinação dos dados de RMN e espectrometria de massa de baixa resolução, que revelou o pico correspondente ao íon molecular m/z 343. O espectro no infravermelho apresentou uma banda larga centrada em 3448 cm^-1 compatível com vibrações de deformação axial de ligações N-H e O-H que, quando associadas às absorções em 1610, 1548 e 1514 cm^-1, podem ser atribuídas tanto a amidas como a grupamentos carboxilatos de aminoácidos. O espectro de RMN ¹H (500 MHz, D₂O) apresentou sinais em δ 3,72 (dd, J = 8,4 e 5,1 Hz, H-2), 3,66 (d, J = 3,9 Hz, H-2´) e 3,60 (d, J = 4,3 Hz, H-2´´) compatíveis com a presença de átomos de hidrogênio ligados a carbonos α-carbonílicos nitrogenados, uma série de multipletos em δ 2,27 (H-3´´); 1,98 (H-3´); 1,73 (H-4); 1,72 (H-3a), 1,69 (H-3b); 1,46 (H-4´a) e 1,25 (H-4´b), referentes a hidrogênios metínicos e metilênicos, além dos sinais em 0,98 (d, J = 7,0 Hz, 3H-4´´); 1,00 (d, J = 7,0 Hz, 3H-6´); 1,03 (d, J = 7,0 Hz, 3H-5´´); 0,96 (d, J = 5,9 Hz, 3H-6); 0,95 (d, J = 5,8 Hz, 3H-5) e 0,93 (t, J = 7,4 Hz, 3H-5´) correspondentes a seis grupos metilas. No espectro COSY, foram observados correlações que revelaram claramente três sistemas de acoplamentos separados. O espectro de RMN ¹³C (125 MHz, D₂O) apresentou sinais correspondentes a dezessete átomos de carbono, incluindo três grupos carboxilas em δ 174,3 e 174,2 (2 x C=O), seis carbonos metínicos, dos quais três (δ 60,4; 59,6 e 53,5) são nitrogenados, além de dois grupos metilênicos e seis metilas (Tabela 1). A atribuição inequívoca dos sinais correspondentes aos grupos metilas foi realizada através do experimento TOCSY 1D seletivo, no qual a excitação na frequência do sinal em δ 3,72 (H-2) exibiu correlação com os hidrogênios metilênicos δ 1,72 (H-3a)/1,69 (H-3b) e metínico δ 1,73 (H-4), além dos dois metilas em δ 0,96 (3H-6) e 0,95 (3H-5); a irradiação do sinal em δ 3,66 (H-2') mostrou correlação com os hidrogênios metínicos δ 1,98 (H-3') e metílico δ 1,00 (3H-6'). De maneira semelhante, a excitação do sinal em δ 3,60 (H-2'') revelou a correlação com os sinais dos hidrogênios metílicos em δ 1,03 (3H-4'') e 0,98 (3H-5´´). A sequência das três unidades de aminoácidos foi confirmada por espectrometria de massa, através dos fragmentos m/z 326 (6a), 272 (6b), 242 (6c), 213 (6d), 129 (6e) e 100 (6f) Daltons, cujas estruturas encontram-se esboçadas na Figura 2. Com estes dados, incluindo-se aqueles obtidos dos espectros HSQC e HMBC (Tabela 1), chegou-se à estrutura do tripeptídeo L-Valil-L-Isoleucil-L-leucina (Leu-Ile-Val), o qual foi previamente relatado de fonte animal (músculo de salmão).²³

Neste trabalho, os compostos 1 e 2 foram avaliados sobre as leveduras Candida albicans e C. parapsilosis e em fungos filamentosos Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes (Tabela 2). O glicoalcaloide 1 apresentou valores de CIM de 125 μg/mL para leveduras e 62,5 μg/mL para os filamentosos, enquanto o glicoalcaloide 2 foi mais ativo, com valores de 62,5 μg/mL sobre as leveduras e 0,24 μg/mL, sobre os filamentosos. Esses compostos possuem estruturas semelhantes, entretanto o espectro de atividade é diferente. A potente atividade do glicoalcaloide 2 para dermatófitos é bastante promissora, sobretudo considerando-se que o controle positivo itraconazol apresentou valores de CIM entre 0,5-8,0 μg/mL. Esses resultados são de importância clínica, uma vez que, cerca de 22% dos pacientes HIV positivos apresentam micoses promovidas principalmente por dermatófitos^24,25 e 40% das manifestações cutâneas em transplantados renais são promovidas por fungos.²⁶ Este é o primeiro relato da atividade dos glicoalcaloides 1 e 2 em fungos patógenos humanos, pois são descritos apenas pela ação em fungos endofíticos.²⁷ Existe uma predominância de T. rubrum como principal agente etiológico em várias regiões geográficas do mundo, como Japão, Estados Unidos, México e Brasil.²⁸ No entanto, alguns estudos mostram o aparecimento de outros dermatófitos como principais agentes causadores de infecção, entre eles o T. mentagrophytes e o M. canis.^29,30 A efetividade do tratamento tópico de infecções fúngicas continua sendo um importante desafio em dermatologia. Apesar do amplo espectro de ação dos antifúngicos tópicos, em dermatófitos e leveduras, altas taxas de recidiva e recorrência de sintomas continuam sendo problemas clínicos importantes.³¹ Infecções nas unhas, difíceis de erradicar, podem apresentar níveis de recorrência de 25 a 40% dos casos, mesmo em uso de antifúngicos sistêmicos.³² Compostos como o glicoalcaloide 2 poderiam ser uma alternativa de opção para o desenvolvimento de formulação tópica para o tratamento de micoses.

CONCLUSÃO

A prospecção química das folhas e frutos de S. asperum resultou no isolamento de uma série de metabólitos secundários pertencentes a classes estruturais distintas como glicoalcaloides, flavonoides e peptídeos. Com exceção dos glicoalcaloides, os demais compostos estão sendo relatados pela primeira vez a partir da espécie, constituindo-se interessante contribuição para o conhecimento químico do gênero. Este é o primeiro relato da atividade dos glicoalcaloides solamargina e solasonina em fungos patógenos humanos. Esse estudo demonstra a importância da investigação antifúngica de produtos naturais de origem vegetal, aliada à preservação da biodiversidade. Soma-se a isto que alternativas quimioterápicas para o tratamento de infecções fúngicas são de fundamental relevância para a saúde pública.

MATERIAL SUPLEMENTAR

As Figuras 1S a 6S estão disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com aceso livre.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro das instituições de apoio à pesquisa CNPq, CAPES, PRONEX, FUNCAP e FAPDF.

Recebido em 7/6/10; aceito em 11/8/10; publicado na web em 26/11/10

• ¹
  Sarmento Silva, T. M.; Carvalho, M. G.; Braz-Filho, R.; Agra, M. F.; Quim. Nova 2003, 26, 517.
• ²
  Agra, M. F.; Bhattacharyya, J. Em Solanaceae IV. Advances in Biology and Utilization; Nee, M.; Symon, D. E.; Lester, R. N.; Jessop, J. P., eds.; Royal Botanic Gardens: Kew, 1999.
• ³
  Matos, F. J. A.; Plantas da Medicina Popular do Nordeste, Edições UFC: Fortaleza, 1999.
• ⁴
  Lorenzi, H.; Matos, F. J. A.; Plantas Medicinais do Brasil: Nativas e Exóticas Cultivadas, Instituto Plantarum: Nova Odessa, 2002.
• ⁵
  Ikeda, T.; Tsumagari, H.; Nohara, T.; Biol. Pharm. Bull 2003, 26, 1198.
• ⁶
  Distl, M.; Wink, M.; Potato Res 2009, 52, 79.
• ⁷
  Friedman, M.; Lee, K-R.; Kim, H-J.; Lee, I-S.; Kozukue, N.; J. Agric. Food Chem 2005, 53, 6162.
• ⁸
  Edwin, J. E.; Edwin, S.; Saini, V.; Deb, L.; Gupta, V. B.; Wate, S. P.; Busari, K. P.; Nat. Prod. Res 2008, 22, 269.
• ⁹
  Mallika, J.; Shyamala, D. C. S.; J. Ethnopharmacol 2006, 104, 156.
• ¹⁰
  Silva, T. M. S.; Camara, C. A.; Freire, K. R. L.; Silva, T. G.; Agra, M. F.; Bhattacharyya, J.; J. Braz. Chem. Soc 2008, 19, 1048.
• ¹¹
  Friedman, M.; J. Agric. Food Chem 2006, 54, 8655.
• ¹²
  Hale, A. L.; Reddivari, L.; Nzaramba, M. N.; Bamberg, J. B.; Miller Jr, J. C.; Am. J. Pot. Res 2008, 85, 332.
• ¹³
  Veras, M. L.; Bezerra, M. Z. B.; Lemos, T. L. G.; Uchoa, D. E. A.; Braz-Filho, R.; Chai, H. B.; Cordell, G. A.; Pessoa, O. D. L.; J. Nat. Prod. 2004, 67, 710.
• ¹⁴
  Veras, M. L.; Bezerra, M. Z. B.; Braz-Filho, R.; Pessoa, O. D. L.; Montenegro, R. C.; Pessoa, C.; Moraes, M. O.; Costa-Lotufo, L. V.; Planta Med 2004, 70, 551.
• ¹⁵
  CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute; Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Approved Standard, 2^nd ed., Document M27-A2, CLSI: Pennsylvania, 2002.
• ¹⁶
  CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute; Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi, Approved Standard, Document M38-A, CLSI: Pennsylvania, 2002.
• ¹⁷
  Wanyonyi, A. W.; Chhabra, S. C.; Mkoji, G.; Eilert, U.; Njue, W. M.; Phytochemistry 2002, 59, 79.
• ¹⁸
  Ridout, C. L.; Price, K. R.; Coxon, D. T.; Fenwick, G. R.; Pharmazie 1989, 44, 732.
• ¹⁹
  Lencina, C.; Pires, V. S.; Gosmann, G.; Taketa, A. T. C.; Schenkel, E. P.; Rev. Bras. Farmacog 2001, 11, 89.
• ²⁰
  Agrawal, P. K.; Carbon-13 NMR of Flavonoids, Elsevier: Amsterdan, 1989.
• ²¹
  Silva, T. M. S.; Carvalho, M. G.; Braz-Filho, R.; Quim. Nova 2009, 32, 1119.
• ²²
  Pretsch, E.; Bühlmann, P.; Affolter, C.; Structure Determination of Organic Compounds. Tables of Spectral Data, Spring-Verlag: Berlin, 2000.
• ²³
  Enari, H.; Takahashi, Y.; Kawarasaki, M.; Tada, M.; Tatsuta, K.; Fisheries Sci 2008, 74, 911.
• ²⁴
  Porro, A. M.; Yoshioka, M. C. N.; Anais Bras. Dermatol 2000, 75, 665.
• ²⁵
  Souza, L. B.; Pinto, L. P.; Medeiros, A. M. C.; Junior, R. F. A.; Mesquita, O. J. X.; Pesqui. Odontol. Bras 2000, 14, 79.
• ²⁶
  Vettorato, G.; Carvalho, A. V. E.; Lecompte, S. M.; Trez, E. G.; Garcia, V. D.; Keitel, E.; Anais Bras. Dermatol 2003, 78, 282.
• ²⁷
  Gipollini, M. L.; Levey, D. J.; Ecology 1997, 78, 799.
• ²⁸
  Welsh, O.; Welsh, E.; Ocampo-Candiani, J.; Gomez, M.; Vera-Cabrera, L.; Mycoses 2006, 49, 119.
• ²⁹
  Dolenc-Voljc, M.; Mycoses 2005, 48, 181.
• ³⁰
  Panasiti, V.; Devirgiliis, V.; Borrni, R. G.; Mancini, M.; Curzio, M.; Rossi, M.; Bottoni, U.; Calvieri, S.; Med. Mycol 2007, 45, 57.
• ³¹
  Pfaller, M. A.; Sutton, D. A.; Diagn. Microbiol. Infect. Dis 2006, 56, 147.
• ³²
  Woodfolk, J. A.; Clin. Microbiol. Rev 2005, 18, 30.

#

Prof.

Honoris causa - UFC, Pesquisador Visitante Emérito

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Mar 2011
• Data do Fascículo
  2011

Histórico

• Recebido
  07 Jun 2010
• Aceito
  11 Ago 2010