Uso da técnica HRICP-MS na avaliação dos isótopos de boro em eucalipto

Use of the HRICP-MS technique for the evaluation of boron isotopes in eucalitpus plants

isotope ratio; micronutrients; translocation

NOTA TÉCNICA

Uso da técnica HRICP-MS na avaliação dos isótopos de boro em eucalipto

Use of the HRICP-MS technique for the evaluation of boron isotopes in eucalitpus plants

Edson Marcio MattielloI, ^*; Hugo Alberto Ruiz^I; Ivo Ribeiro da Silva^I; Jorge Eduardo de Souza Sarkis^II

^IDepartamento de Solos, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000 Viçosa - MG, Brasil

^IIInstituto de Pesquisas Energética e Nucleares, 05580-000 São Paulo - SP, Brasil

ABSTRACT

The ¹⁰B isotope tracer technique is essential to study the B mobility in plants. Factors that can influence the quality of measured B isotope ratios were optimized experimentally using High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (HRICP-MS). An isotopically certified standard (NIST SRM-951) was used. The best combination was obtained using a resolution of 400, a RF power of 1250 W, followed by 15 measurements over a 10-s integration period each (15*10). Utilizing this approach it was possible to obtain a precision of 0.3 % in standard material and 2z % in the experimental samples. The results show the importance of establishing optimized work conditions before carrying out the analytical series.

Keywords: isotope ratio; micronutrients; translocation.

INTRODUÇÃO

O boro (B) é um elemento quimicamente complexo; depois do carbono, deve ser o elemento de característica físico-química mais intrigante.¹ É um elemento essencial para as plantas e sua deficiência afeta o crescimento e produção das culturas em diversas regiões do mundo.² No solo, os teores disponíveis para as plantas variam entre 0,1 e 2 mg dm^-3 de B (B extraído pelo método água quente),³ e teores foliares entre 20 e 100 mg kg^-1 são considerados adequados para a maioria das plantas cultivadas.⁴ Os teores de B encontrados em tecido vegetal têm sido usados como indicativo do estado nutricional desse elemento nas plantas.

Diversas técnicas têm sido usadas para determinação de B no solo e em tecido vegetal.⁵ O método colorimétrico é o mais difundido e baseia-se na formação de complexo colorido com acido bórico a pH 5,1, utilizando azometina-H. A intensidade da cor é medida a 420 nm, em espectrofotômetro ou colorímetro. É um método simples, de rápida execução e com sensibilidade apropriada para a maioria dos estudos de fertilidade do solo e nutrição de plantas. A determinação de elementos-traços, entre eles o B, tem sido facilitada após a introdução dos espectrofotômetros de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), sobretudo pelo baixo limite de detecção, pela ampla faixa de linearidade e pela determinação múltipla de elementos.⁶ No entanto, a determinação do teor total de B em tecido vegetal não permite o conhecimento da redistribuição ou remobilização do nutriente entre os órgãos da planta. Também não permite distinguir a origem do B nos estudos de fertilização e absorção do nutriente pelas plantas. Assim, estudos da razão isotópica de B em amostras vegetais são de fundamental importância para a compreensão da absorção e do transporte do nutriente internamente na planta, sendo relevante na distinção dos genótipos quanto à aquisição e utilização do nutriente⁷ e na orientação de técnicas mais apropriadas de fertilização.

As técnicas tradicionalmente empregadas na determinação de razões isotópicas de B em amostras vegetais são a espectrometria de massas termoiônica (TIMS) e a espectrometria de massas de íon secundário (SIMS).^8,9 A TIMS é a técnica mais precisa e sensível e permite a análise por meio de íons positivos¹⁰ ou negativos.¹¹ A grande desvantagem desta técnica se deve a interferências isobáricas, exigindo a separação química do elemento de interesse. A técnica SIMS possui a vantagem de permitir a determinação simultânea da concentração e composição isotópica do B nas amostras em estudo sem nenhum tratamento prévio, porém a precisão dos resultados é inferior à da técnica anterior (cerca de 3-4%), o que torna difícil a observação de pequenas variações na intensidade isotópica a ser medida.

A partir de meados da década de 1970 surgiu uma nova instrumentação analítica, resultante do acoplamento de uma fonte de íon extremamente eficiente (plasma indutivamente acoplado-ICP) com uma técnica de análise iônica extremamente seletiva (espectrometria de massas-MS). Essa técnica, denominada espectrometria de massas com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), rapidamente se popularizou e tem sido utilizada nas mais diversas áreas do conhecimento.^12-14 Atualmente, duas categorias de equipamentos dessa natureza estão disponíveis: os chamados de baixa resolução, cuja separação iônica é feita, fundamentalmente, por filtros quadrupolos; e aqueles conhecidos como de alta resolução ou setor magnético, nos quais a análise do feixe iônico é realizada por meio de um sistema conhecido como Nier-Johnson invertido, no qual um analisador magnético está acoplado a um setor elétrico.¹⁵

Ambas as técnicas têm sido utilizadas nos estudos de isótopos de B.¹⁶ Técnicas de determinação dos dois isótopos estáveis de B, ¹⁰B e ¹¹B, com abundância natural aproximada de 19,9 e 80,1%, respectivamente, permitem o monitoramento do B em sistemas biológicos. O baixo limite de detecção é uma grande vantagem em relação aos demais métodos, podendo variar de 1 a 3 mg L^-1 de B em extratos biológicos digeridos.^17,18 A determinação de B por meio da diluição isotópica em ICP-MS é considerada a mais exata técnica para análises quantitativas.¹⁹

Análises isotópicas de B normalmente não sofrem interferências espectroscópicas. Entretanto, vários outros fatores podem influenciar a qualidade dos resultados analíticos, entre os quais: tempo morto dos detectores, efeito espaço/carga, eficiência de transmissão iônica, estabilidade da corrente iônica e resolução espectral.¹² Todos esses parâmetros podem ser otimizados experimentalmente, por meio da análise de material de referência certificado isotopicamente; contudo, são poucos os relatos na literatura sobre as condições analíticas adequadas para análise da razão isotópica do B em material vegetal, por meio de espectrometria de massas de alta resolução com fonte de plasma ativado indutivamente (HRICP-MS).

A utilização de técnicas sensíveis e capazes de determinação de B com alta precisão e exatidão é fundamental para avaliações de razões isotópicas de B nos estudos de fertilização e absorção de B²⁰ e de mobilidade do nutriente em plantas.^7,21 Neste trabalho, objetivou-se avaliar a técnica HRICP-MS na determinação da razão isotópica de B em amostras de tecido de plantas de eucalipto submetidas à aplicação de ¹⁰B e sua aplicação para estudos de mobilidade de B em plantas. Para isso, foram avaliados os principais fatores que influenciam a qualidade das medidas da razão isotópica do B, como a estatística de contagem, a potência da radiofrequência, a qualidade do espectro e o ajuste do sistema óptico do aparelho.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes e soluções

Todos os reagentes utilizados apresentavam pureza analítica. O ácido nítrico (Merck, Darmstadt, Germany) foi preparado com água com resistividade de 18,2 MW cm^-1, obtida em sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). A solução de B, enriquecida com ¹⁰B (99 atom% ¹⁰B), foi preparada a partir de H₃BO₃ (Aldrich). A solução estoque de 1.000 mg L^-1 de B foi preparada a partir de material de referência certificado NIST SRM-951, com 19,827% de ¹⁰B e 80,173% de ¹¹B. Padrões contendo 91,85 mg L^-1 de B foram preparados a partir da solução estoque padrão e usados na fase de calibração e durante as séries analíticas. A concentração do padrão era próxima das concentrações esperadas nos extratos diluídos das amostras a serem analisadas.

Obtenção do material vegetal

Mudas de dois clones comerciais de eucalipto, codificados sob os números 68 e 129, foram cultivadas em solução nutritiva,²² ½ força, com 10 mmol L^-1 de B (abundância natural), sendo a fonte H₃BO₃ (Merck, Darmstadt, Germany), durante 21 dias, em casa de vegetação. Após esse período, selecionaram-se plantas uniformes de cada clone. Dois terços das plantas foram cultivados na ausência de B, e o terço restante, na presença de 20 mmol L^-1 de B (abundância natural). Decorridos 45 dias nessas condições, uma única folha madura das plantas crescidas na ausência e de outras crescidas na presença de B foi imersa em solução de H₃BO₃ enriquecido com 99 atom % ¹⁰B, na concentração de 1,64 g L^-1 de ¹⁰B, durante 1 min. Outras plantas cultivadas na ausência de B não receberam a solução de ¹⁰B, permanecendo como testemunhas. Precauções foram tomadas para a não contaminação de outras partes da planta e da solucão nutritiva. Dessa forma, podia-se verificar qualitativa e quantitativamente a translocação de B da folha madura para outras partes da planta.

Nos tempos de 1, 5, 12 e 17 dias após a imersão da folha madura em solução contendo ¹⁰B, foram retiradas amostras de tecidos jovens (folhas jovens e ápices dos ramos), dos três tratamentos impostos. Previamente à imersão da folha madura em solução contendo ¹⁰B foram retiradas amostras de tecidos jovens para referenciar o tempo zero.

Preparo das amostras

As amostras dos tecidos jovens foram secas em estufa de circulação forçada a 65 ºC por 96 h. Elas foram trituradas e, aproximadamente, 0,2 g do material foram calcinados a 550 °C em cadinhos de porcelana; em seguida, o resíduo foi dissolvido em 5 mL de ácido nítrico, na concentração de 1,59 mol L^-1. O resíduo foi passado por filtro de náilon de 0,45 mm e armazenado em microtubos plásticos em ultrafreezer.

Procedimento analítico e obtenção dos dados

Para a determinação da razão isotópica de ¹⁰B:¹¹B utilizou-se um espectrômetro de massa de alta resolução com fonte de plasma ativado indutivamente (HRICP-MS, Element-Thermo Finnigan, Bremen, Germany), nas condições de operação apresentadas na Tabela 1.

Soluções padrão NIST SRM-951, de razão ¹⁰B/¹¹B equivalente a 0,247, foram analisadas em diferentes combinações de potência da radiofrequência, focus e método de contagem. Também foi avaliada a estabilidade da leitura ao longo do tempo. A melhor combinação, a que mais se aproximasse do padrão certificado NIST SRM-951 e com menores valores de coeficiente de variação (CV), foi considerada apropriada para realização das séries analíticas.

Uma vez estabelecidas as condições de trabalho mais adequadas para as análises (calibração), procedeu-se à determinação da razão isotópica de B (¹⁰B:¹¹B) em tecido de eucalipto. As amostras foram diluídas 10 vezes com água deionizada 18,2 MW cm^-1 e colocadas em amostrador automático, determinando-se a razão isotópica de ¹⁰B:¹¹B nos extratos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Inicialmente, foram estudados os principais fatores que poderiam influenciar a qualidade da razão isotópica: estatística de contagem, potência da radiofrequência, qualidade do espectro e ajuste do sistema óptico do aparelho. As amostras analisadas nessa fase (padrão certificado NIST 951) representaram diferentes combinações de fatores interferentes na razão isotópica de B. Os resultados mostraram que a qualidade da determinação da razão isotópica (exatidão e precisão) depende de ajustes específicos do aparelho e do método adotado (Figura 1). A aproximação dos valores medidos no aparelho ao padrão NIST 951 foi possível quando se adotaram canais de 400 (resolução de massa, M/DM).

A potência da radiofrequência foi a variável de maior influência na razão ¹⁰B/¹¹B, e o melhor ajuste, em relação ao padrão NIST 951, foi obtido utilizando valores de 1.250 W (Figura 1). A seleção de valores de resolução de massa mais elevados (3800) em HRICP-MS resultou em interferências do ion ⁴⁰Ar⁴⁺ na leitura do ¹⁰B devido à pequena diferença entre o número de massa de ambos. Essa interferência foi reduzida com a adoção de uma menor resolução (350) e menor valor de potência da radiofrequência (1200 W).²³ Operando em condições de menor resolução o sinal geralmente tem maior intensidade e os picos tem formato de topo achatado, resultando em maior precisão da medição da razão isotópica do B.²³

O focus utilizado também influenciou a razão isotópica de B. Valores menores que -650 se mostraram mais apropriados para determinação da razão isotópica (Figura 1).

A calibração do aparelho em relação ao padrão NIST 951 foi possível apenas quando se adotou estatística de contagem de 15*10 (15 medições com 10 períodos de integração) (Figura 1). As demais combinações foram pouco exatas e precisas, sendo, portanto, descartadas nas determinações posteriores à fase de calibração.

O coeficiente de variação também foi influenciado pelas diferentes combinações na fase de calibração (Figura 2). Considerando como satisfatório nessa fase um CV menor que 1,5%, percebe-se que uma ampla faixa de potência da radiofrequência atende a essa pré-condição. Foi possível obter CV menor que 0,3% durante essa fase, evidenciando elevada precisão nas leituras do padrão. Em relação ao focus utilizado, foi possível obter CV menor que 1,5% em uma ampla faixa de trabalho.

Na Figura 3 é apresentada a razão ¹⁰B/¹¹B em amostras de tecidos jovens de dois clones de eucalipto que receberam uma única aplicação de ¹⁰B numa folha madura. A técnica usada mostrou-se precisa e exata, possibilitando a detecção do enriquecimento de ¹⁰B nos órgãos jovens da planta, com destaque para o clone 129, que se mostrou mais eficiente na translocação do B. Portanto, essa técnica, sob condições analíticas definidas, será extremamente valiosa em estudos futuros que envolvam a absorção ou redistribuição floemática de B em eucalipto,⁷ ou mesmo auxiliar no isolamento de possíveis complexos orgânicos de B no floema, conforme já relatado para outras espécies.²⁴

CONCLUSÕES

Há necessidade do uso e correção por padrão certificado para correção das pequenas variações encontradas nas rotinas de trabalho.

Com o equipamento e as condições estabelecidas foi possível atingir coeficientes de variação de 0,3% para os padrões e de 2% para as amostras.

Por meio da determinação da razão isotópica de B em HRICP-MS, foi possível verificar a mobilidade de B em plantas de eucalipto.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre. A razão isotópica de B do material de referência NIST SRM 951 foi ligeiramente afetada pelo tempo de duração da série analítica (Figura 1S). Os resultados mostraram variação da razão ¹⁰B/¹¹B de 0,230 a 0,248, sendo a média de 0,240. Em média, a exatidão foi de 97,2% ao longo da série analítica. Os valores de razão ¹⁰B/¹¹B para o material de referência no presente estudo são comparáveis com a faixa de 0,238-0,252 reportado anteriormente.²³

AGRADECIMENTOS

Ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares-IPEN, pela realização das análises e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico- CNPq, pelo apoio financeiro.

Recebido em 26/2/10; aceito em 21/9/10; publicado na web em 7/1/11

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Abr 2011
• Data do Fascículo
  2011

Histórico

• Aceito
  21 Set 2010
• Recebido
  26 Fev 2010