Síntese, caracterização e estudo da atividade inibitória de novas dialquilfosforilarilidrazonas sobre o crescimento de tripanossomatídeos

Synthesis, caracterization and study of activity inhibitory of new dialkylphosphoryl-hydrazones on the growth of trypanosomatids

Resumo

A new series of dialkylphosphorylhydrazones was synthesized through the condensation of aromatic aldehydes with different phosphorylhydrazines. All synthesized compounds were characterized by IR, ¹H-NMR, 13C-NMR and 31P-NMR spectroscopies. The in vitro investigation of the activity of these compounds against Leishmania amazonensis promastigotes and epimastigotes of T. cruzi, showed an efficient inhibition of proliferation, at non toxic concentrations to mammalian cells. The results have shown some derivatives as potential antiparasitic agents against trypanosomatids.

leishmaniases; Chagas disease; dialkylphosphorylhydrazones

leishmaniases; Chagas disease; dialkylphosphorylhydrazones

ARTIGO

Síntese, caracterização e estudo da atividade inibitória de novas dialquilfosforilarilidrazonas sobre o crescimento de tripanossomatídeos

Synthesis, caracterization and study of activity inhibitory of new dialkylphosphoryl-hydrazones on the growth of trypanosomatids

Andréa Janaina M. Nogueira^I; Marco Edilson F. de Lima^I; João Batista N. DaCostaI, ^*; Eliomara Sousa Sobral Alves^II; Danielle Oliveira dos Anjos^II; Marcos André Vannier-Santos^II; Adriana Lanfredi-Rangel^II

^IDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Antiga Rod. Rio/SP, km 47, 23890-000 Seropédica - RJ, Brasil

^IICentro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, R. Waldemar Falcão, 121, 40296-710 Salvador - BA, Brasil

ABSTRACT

A new series of dialkylphosphorylhydrazones was synthesized through the condensation of aromatic aldehydes with different phosphorylhydrazines. All synthesized compounds were characterized by IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR and ³¹P-NMR spectroscopies. The in vitro investigation of the activity of these compounds against Leishmania amazonensis promastigotes and epimastigotes of T. cruzi, showed an efficient inhibition of proliferation, at non toxic concentrations to mammalian cells. The results have shown some derivatives as potential antiparasitic agents against trypanosomatids.

Keywords: leishmaniases; Chagas disease; dialkylphosphorylhydrazones.

INTRODUÇÃO

As doenças tropicais, como malária, doença de Chagas, doença do sono, leishmaniose visceral, filariose linfática, dengue e esquistossomose, continuam sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Essas doenças são consideradas negligenciadas por representarem importantes agravos à saúde e ainda permanecerem não solucionados.^1,2

A leishmaniose é uma doença causada por mais de 20 espécies do protozoário kinetoplastida Leishmania spp., é transmitida por cerca de 30 espécies de vetores flebótomos, atingindo cerca de 12 milhões de pessoas em 88 países.³

A tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma infecção causada pelo parasita kinetoplastida Trypanosoma cruzi e é transmitida de forma vetorial através de insetos conhecidos como barbeiros, por transfusão de sangue, por transplante de órgãos e através das vias congênita e oral, tendo esta última forma aumentada nos últimos anos. Apresenta cerca de 8 milhões de casos com 14.000 mortes por ano e é endêmica em 21 países da América Latina, inclusive no Brasil.^2,4

A quimioterapia disponível para a doença de Chagas no Brasil resume-se ao uso do benzonidazol (Figura 1) que apenas é ativo na fase aguda da doença e, para a leishmaniose, os fármacos de primeira escolha são os antimoniais pentavalentes (Glucantime) (Figura 1) e os de segunda escolha são a pentamidina e a Anfotericina B; além desses, é utilizada a paromomicina, porém geralmente apresenta alta toxidez e já apresenta casos de resistência.^5,6

Considerando este cenário, a descoberta de novos fármacos, preferencialmente de administração oral, seguros, efetivos e de baixo custo, é um desafio colocado aos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de novos protótipos de fármacos aplicáveis na quimioterapia antiparasitária.⁷

Com o objetivo de se encontrar novas alternativas quimioterápicas para o combate dessas doenças e com base na similaridade do Trypanosoma cruzi com os patógenos causadores das leishmanioses, já que são tripanossomatídeos, uma nova série de dialquilfosforilidrazonas foi planejada e sintetizada segundo os conceitos de hibridação molecular dos grupos funcionais hidrazônico do nifurtimox, que é um antichagásico não mais utilizado no Brasil⁷ e fosfato da miltefosina, uma droga anticâncer alquilfosfolipídica, ativa contra Leishmania⁶ (Figura 1).

PARTE EXPERIMENTAL

Todos os reagentes usados eram de grau analítico e os solventes utilizados nas reações e nos procedimentos de purificação foram previamente destilados e, quando necessário, tratados e secos de acordo com os métodos usuais descritos na literatura.⁸

Todos os pontos de fusão, não corrigidos, foram determinados em um aparelho Buchi 510.

Os aparelhos utilizados para a caracterização dos compostos foram: espectrômetro de infravermelho Perkin-Elmer modelo 1600 FT - os espectros foram obtidos utilizando-se um filme sobre células de NaCl, nas amostras líquidas e pastilhas de KBr, nas amostras sólidas. As absorções foram medidas em centímetros recíprocos (cm^-1); cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (CG/EM), em espectrômetro modelo Saturn 2000-Varian equipado com coluna VF-5 ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm); espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ¹H (200 MHz), ¹³C (50 MHz) e ³¹P (162 MHz) Bruker, modelo AC-200. Os espectros foram obtidos utilizando-se tetrametilsilano (TMS), ou o próprio solvente como referência para os núcleos de ¹H e ¹³C. Para o núcleo de ³¹P foi utilizado o ácido fosfórico 85% como referência externa. Os solventes deuterados são especificados em cada caso, sendo os deslocamentos químicos medidos em ppm e as constantes de acoplamento em Hertz (Hz).

Os experimentos foram realizados nas seguintes condições: ionização por impacto de elétrons a 70 eV; hélio como gás de arraste e fluxo de 1 mL/min; injetor no modo split (1:80); gradiente crescente de temperatura de 10 ºC/min, de 150 a 290 ºC. A temperatura do injetor foi de 270 ºC; EM trap 220 ºC, manifold 60 ºC trxline 250 ºC.

Síntese dos fosfonatos de dialquila (1 e 2)

Os fosfonatos de dialquila (1 e 2) foram sintetizados através do tratamento de tricloreto de fósforo com três mols do respectivo álcool.^9-11

Síntese das dialquilfosforilidrazinas (3 e 4)

As dialquilfosforilidrazinas foram sintetizadas através da fosforilação da hidrazina em meio aquoso em reação bifásica com fosfonato de dialquila (1 e 2), em quantidades equimolares, em tetracloreto de carbono.^12,13

Síntese das dialquilfosforilarilidrazonas (3a-e e 4a-h)

Procedimento geral

Em um balão monotubulado de 50 mL adicionam-se quantidades equimolares de dialquilfosforilidrazina solubilizada em 3 mL de EtOH e do aldeído correspondente, previamente dissolvido em 3 mL de EtOH seguidos de aproximadamente duas 2 gotas de HCl 37%. Mantém-se a mistura reacional sob agitação em temperatura ambiente. Terminado o tempo de reação (3 h para as reações em que o aldeído tem substituintes retiradores de elétrons na posição 4 do anel aromático e 24 h quando o substituinte é doador de elétrons), a mistura reacional é vertida em água destilada gelada e deixada em banho de gelo por 30 min. Com exceção dos compostos 4c e 4h, que foram extraídos com cloreto de metileno (CH₂Cl₂) no funil de separação, os demais produtos foram filtrados e recristalizados em etanol.

Síntese da dibutilfosforilfenilidrazona (3a)

Aspecto físico: sólido branco; rend.: 81%; p.f.: 55-58 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3398 e 3168 (νNH); 2960 e 2873 (νCH₂ e CH₃); 1240 (νP=O); 1029 (νP-O-C); 1064 (νP-N); 1606 (νC=N); 1477 (δas.CH₂ e CH₃); 1380 (δsim.CH₃); 698 e 763 (aromático). RMN ¹H (DMSO-d₆/ppm) δ: 0,84 (t, 6H, CH₃), 1,36 (m, 4H, CH₂), 1,58 (m, 4H, CH₂); 3,97 (m, 4H, CH₂), 7,91 (s, 1H, -N=CH]; 7,53-7,91 (m, 5H arom.); 9,60 (d, J = 28,12 Hz, 1H, -P-NH-). RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 13,43; 18,26; 31,80; 65,95; 143,77; 129,15; 128,76; 126,52; 134,78. RMN ³¹P (CDCl₃/ppm): 2,33 dq (acoplado).

Síntese da dibutilfosforil-4-nitrofenilidrazona (3b)

Aspecto físico: sólido amarelo; rend.: 80%; p.f.: 225-228 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3434 e 3085 (νNH); 2958 e 2933 (νCH₂ e CH₃); 1240 (νP=O); 1035 (νP-O-C); 1076 (νP-N); 1596 (νC=N); 1515 e 1346 (νNO₂(arom.)). RMN ¹H (Piridina-d₅/ppm) δ: 0,83 (t, 6H, CH₃), 1,40 (m, 4H, CH₂), 1,71 (m, 4H, CH₂); 4,36 (m, 4H, CH₂); 7,92 e 8,26 (2d, 4H arom.); 8,37 (s, 1H, -N=CH]; 11,32 (d, J = 28,63 Hz, 1H, -P-NH-). RMN ¹³C (Piridina-d₅/ppm) δ: 13,61; 18,97; 32,61; 67,06; 141,85; 141,79; 148,79; 124,22; 127,26. RMN ³¹P (Piridina-d₅/ppm): 2,12 dq (acoplado).

Síntese da dibutilfosforil-2-nitrofenilidrazona (3c)

Aspecto físico: sólido branco; rend.: 75%; p.f.: 58-61 ºC; RMN ¹H (DMSO/ppm) δ: 0,84 (t, 6H, CH₃), 1,32 (m, 4H, CH₂), 1,59 (m, 4H, CH₂); 3,97 (m, 4H, CH₂); 7,58-8,01 (m, 4H arom.); 8,29 (s, 1H, -N=CH]; 9,97 (d, J = 28,88 Hz, 1H, -P-NH-). RMN ¹³C (DMSO-d₆/ppm) δ: 13,37; 18,20; 31,75; 66,07; 138,97; 147,58; 124,51-133,44. RMN ³¹P (DMSO-d₆/ppm): 1,25 dq (acoplado).

Síntese da dibutilfosforil-4-cianofenilidrazona (3d)

Aspecto físico: sólido amarelo; rend.: 49%; p.f.: 265-270 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3434 e 3085 (νNH); 2960 e 2927 (νCH₂ e CH₃); 2227 (νCN(arom.)); 1241 (νP=O); 1033 (νP-O-C); 1066 (νP-N); 1594 (νC=N); 835 (aromático). RMN ¹H (DMSO-d₆/ppm) δ: 0,84 (t, 6H, CH₃), 1,34 (m, 4H, CH₂), 1,58 (m, 4H, CH₂); 3,97 (m, 4H, CH₂), 7,91 (s, 1H, -N=CH]; 9,89 (d, J = 28,37 Hz, 1H, -P-NH-) 7,62-7,85 (2d, 4H arom.).

Síntese da dibutilfosforil-4-carboxifenilidrazona (3e)

Aspecto físico: sólido branco; rend.: 58%; p.f.: 115-118 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3436 e 3089 (νNH); 2960 e 2930 (νCH₂ e CH₃); 1679 (νC=O); 1245 (νP=O); 1033 (νP-O-C); 1064 (νP-N); 1598 (νC=N); 835 (aromático). RMN ¹H (DMSO-d₆/ppm) δ: 0,83 (t, 6H, CH₃), 1,34 (m, 4H, CH₂), 1,58 (m, 4H, CH₂); 3,98 (m, 4H, CH₂); 7,65-7,94 (2d, 4H arom.); 7,96 (s, 1H, -N=CH]; 9,81 (d, J = 28,63 Hz, 1H, -P-NH-); 12,94 (s, 1H, OH). RMN ¹³C (DMSO-d₆/ppm) δ: 13,79; 18,63; 32,20; 66,42; 142,66; 139,23; 126,49; 131,26; 130,14; 166,97. RMN ³¹P (DMSO-d₆/ppm): 1,85 dq (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforilfenilidrazona (4a)

Aspecto físico: sólido branco; rend.: 82%; p.f.: 101-105 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3409 e 3178 (νNH); 2960 (νCH₂ e CH₃); 1236 (νP=O); 1018 (νP-O-C); 1060 (νP-N); 1606 (νC=N); 1471 (δas.CH); 1396 e 1369 (δsim.CH); 700 e 765 (aromático). RMN ¹H (DMSO-d₆/ppm) δ: 0,87 (d, 12H, CH₃), 1,89 (m, 2H, CH), 3,75 (m, 4H, CH₂); 7,53-8,36 (d, 4H, arom.); 7,91 (s, 1H, -N=CH]; 9,56 (d, J = 28,38 Hz, 1H, -P-NH-). RMN ¹³C (DMSO-d₆/ppm) δ: 18,96; 28,96; 72,50; 143,73; 129,48; 128,91 a 134,76 (C arom.). RMN ³¹P (DMSO-d₆/ppm): 1,93 dq (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforil-4-nitrofenilidrazona (4b)

Aspecto físico: sólido amarelo; rend.: 85%; p.f.: 132-135 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3446 e 3091 (νNH); 2932 e 2834 (νCH₂ e CH₃); 1243 (νP=O); 1033 (νP-O-C); 1090 (νP-N); 1580 (νC=N); 1480 (δas.CH); 1516 e 1343 (νNO₂(arom.)); 863 (aromático). RMN ¹H (DMSO-d₆/ppm) δ: 0,94 (d, 12H, CH₃), 2,00 (m, 2H, CH), 3,88 (m, 4H, CH₂); 7,72-8,20 (2d, 4H arom.); 7,92 (s, 1H, -N=CH]; 9,35 (d, J = 29,75 Hz, 1H, -P-NH-). RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 18,68; 29,03; 73,53; 142,04; 147,81; 123,97; 126,94; 140,85. RMN ³¹P (CDCl₃/ppm): 1,55 dq (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforil-4-metoxifenilidrazona (4c)

Aspecto físico: óleo amarelo; rend.: 48%; IV (KBr/cm^-1): 3410 e 3150 (νNH); 2961 e 2840 (νCH₂, CH₃); 1270 (νP=O); 1172 (νP-N); 1024 (νP-O-C); 1607 (νC=N); 1467 (δas.CH); 1395 e 1370 (δsim.CH); 866 (aromático); RMN ¹H (CDCl₃/ppm): 0,95 (d, 12H, CH₃); 2,00 (m, 2H, CH); 3,81 (s, 3H, OCH₃); 3,88 (m, 4H, CH₂); 7,83 (s, 1H, =CH); 8,64 (d, 1H, J = 28,44 Hz, NH); 6,88 e 7,54 (2d, 4H, arom.); RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 18,56; 28,85; 55,10; 73,03; 144,27; 129,95; 113,82; 127,83; 160,30.

Síntese da di-isobutilfosforil-4-carboxifenilidrazona (4d)

Aspecto físico: sólido branco; rend.: 78%; p.f.: 179-181 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3788 e 3663 (νOH); 3432 e 3123 (νNH); 2961 (νCH₂, CH₃); 1243 (νP=O); 1089 (νP-N); 1029 (νP-O-C); 1600 (νC=N); 1691 (νC=O); 1471 (δas.CH); 1422 e 1313 (δsim.CH); 858 (aromático). RMN ¹H (CDCl₃/ppm) δ: 0,98 (d, 12H, CH₃), 2,03 (m, 2H, CH), 3,92 (m, 4H, CH₂), 7,94 (s, 1H, -N=CH]; 8,97 (d, J = 28,75 Hz, 1H, -P-NH-) 7,71-8,12 (d, 4H, arom.); 9,53 (s, 1H, OH). RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 18,70; 29,02; 73,66; 126,49; 130,43; 139,14; 144,66; 170,27. RMN ³¹P (CDCl₃ / ppm): 1,88 dq (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforil-4-clorofenilidrazona (4e)

Aspecto físico: sólido branco; end.: 85%; p.f.: 83-86 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3376 e 3160 (νNH); 2961 (νCH₂, CH₃); 1234 (νP=O); 1087 (νP-N); 1029 (νP-O-C); 1604 (νC=N); 1484 (δas.CH); 1471 (δsim.CH); 692 (νC-Cl_(arom.)); 854 (aromático). RMN ¹H (CDCl₃/ppm) δ: 0,94 (d, 12H, CH₃), 2,00 (m, 2H, CH), 3,88 (m, 4H, CH₂), 7,82 (s, 1H, -N=CH]; 8,69 (d, J = 27,24 Hz, 1H, -P-NH-) 7,32-7,53 (d, 4H arom.). RMN ¹³C (DMSO-d₆/ppm) δ: 18,73; 29,02; 73,34; 143,52; 133,23; 127,72; 128,80; 134,92. RMN ³¹P (CDCl₃/ppm): 1,97 dq (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforil-4-N,N-dimetilaminofenilidrazona (4f)

Aspecto físico: sólido vermelho; rend.: 80%; p.f.: 58-61 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3394 e 3167 (νNH); 2959 e 2893 (νCH₂, CH₃); 1236 (νP=O); 1172 (νP-N); 1025 (νP-O-C); 1610 (νC=N); 1473 (δas.CH); 1361 e 1184 (νC-N(CH₃)_2(arom.) ); 871 (aromático). RMN ¹H (DMSO-d₆/ppm) δ: 0,87 (d, 12H, CH₃), 1,87 (m, 2H, CH), 3,75 (m, 4H, CH₂), 7,78 (s, 1H, -N=CH]; 9,17 (d, J = 27,49 Hz, 1H, -P-NH-) 6,68-7,35 (d, 4H arom.). RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 18,47; 28,62; 39,84; 71,94; 144,38; 111,04; 127,21; 111,93; 122,59. RMN ³¹P (CDCl₃/ppm): 2,61 dt (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforil-4-cianofenilidrazona (4g)

Aspecto físico: sólido amarelo; rend.: 87%; p.f.: 81-85 ºC; IV (KBr/cm^-1): 3359 e 3156 (νNH); 2958 (νCH₂, CH₃); 2227 (νCN_(arom.)); 1243 (νP=O); 1091 (νP-N); 1025 (νP-O-C); 1596 (νC=N); 1471 (δas.CH); 854 (aromático). RMN ¹H (CDCl₃/ppm) δ: 0,94 (d, 12H, CH₃), 2,00 (m, 2H, CH), 3,87 (m, 4H, CH₂), 7,87 (s, 1H, -N=CH); 9,14 (d, J = 29,76 Hz, 1H, -P-NH-) 7,62-7,69 (d, 4H arom.). RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 18,70; 29,52; 73, 74; 143,52; 139,01; 126,83; 132,39; 112,20; 118,72. RMN ³¹P (CDCl₃/ppm): 1,17 dt (acoplado).

Síntese da di-isobutilfosforil-3,4-dioximetilenofenilidrazona (4h)

Aspecto físico: sólido pastoso branco; rend.: 75%; IV (KBr/cm^-1): 3359 e 3156 (νNH); 2958 (νCH₂, CH₃); 1243 (νP=O); 1129 (νP-N); 1017 (νP-O-C); 1608 (νC=N); 1477 (δas.CH); 1450 e 1396 (δsim.CH); 872 (aromático). RMN ¹H (CDCl₃/ppm) δ: 0,94 (d, 12H, CH₃); 2,00 (m,2H, CH); 3,90 (m, 4H, CH₂); 6,03 (d, 2H,-OCH₂O-); 7,77 (s, 1H, =CH); 8,41 (d, 1H, NH, J = 26,33 Hz); 6,78, 6,93 e 7,23 (2d e s 3H arom). RMN ¹³C (CDCl₃/ppm) δ: 18,71; 28,53; 73,21; 144,29; 18,31; 129,19; 105,20; 108,02; 122,40; 148,08; 148,66; 101,20.

Ensaios biológicos

Parasitos

Promastigotas da cepa Josefa (MHOM/Br/75/Josefa) de Leishmania (L.) amazonensis foram mantidos em meio Warren e as formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT - Liver Infusion Tryptose, ambos os meios suplementados com 10% de soro fetal bovino e mantidos a 26 °C.

Medidas de proliferação celular

Foram utilizados inóculos de 5 x 10⁵ parasitos/mL. Os parasitos na fase estacionária de crescimento axênico foram centrifugados e lavados duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril. Após a última lavagem, o sobrenadante foi desprezado, as células foram ressuspensas em 1 mL de solução de formaldeído 5% e contadas em câmara de Neubauer. Os parasitos foram incubados, a 27 ºC, na presença de soluções de 50 µM em DMSO das substâncias sintetizadas, na ausência das substâncias e em DMSO (0,05%) para controle e o crescimento verificado após 72 h (Leishmania) e 120 h (T. cruzi). Os dados apresentados são representativos de ao menos 3 experimentos independentes realizados em triplicata.

Citotoxidade em linfócitos

O efeito citotóxico dos compostos foi determinado através da redução do MTT [brometo de (3-(4, 5-Dimetiltiazol-2-il) - 2,5 difenil tetrazolio], que fornece informações sobre a integridade mitocondrial em que há redução enzimática da formazana pela ação das desidrogenases mitocondriais. Inóculos de 1 x 10⁶ esplenócitos de camundongos Balb/C foram incubados em meio RPMI completo, suplementado com 10% de soro fetal bovino na presença das substâncias na concentração de 50 µM. Após 24 h, adicionaram-se 20 µL de MTT e as amostras foram incubadas por 3 h, a 36 ºC, a 5% de CO₂. Após esse intervalo, adicionou-se DMSO (dimetilsulfóxido) e a absorbância foi determinada em 540 nm em leitor de ELISA (Molecular Devices), Sunnyvale, California (EUA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As dialquilfosforilidrazonas foram obtidas em três etapas. Na primeira etapa da síntese o PCl₃ reage, via S_N2,^14,15 com 3 mols do álcool correspondente para formar o fosfonato de dialquila (Esquema 1). Os fosfonatos de dialquila foram utilizados sem a necessidade de destilação.

Esses fosfonatos foram caracterizados por espectroscopia de infravermelho, no qual apresentaram bandas de absorções nas faixas de 2426 e 2434 cm^-1, 1216 e 1255 cm^-1 e 1006 e 983 cm^-1, que são, respectivamente, vibrações de deformações axiais das ligações P-H, P=O e P-O.¹⁴

Nos espectros de RMN ¹H dos fosfonatos de dialquila foram observados sinais em duas regiões características, uma em torno de 4,0 ppm, que corresponde aos hidrogênios do carbono ligado aos oxigênios do grupo fosforila e a outra, um dupleto referente ao H ligado diretamente ao átomo de fósforo centrado em, aproximadamente, 6,70 ppm com uma constante de acoplamento P-H elevada, em torno de 690 Hz.

Na etapa seguinte os fosfonatos de dialquila reagem, em um sistema bifásico, segundo a reação de Todd-Atherton modificada,^12,15-18 com hidrazina mono-hidratada formando as dialquilfosforilidrazinas (Esquema 1).

O sinal característico das dialquilfosforilidrazinas, observado na espectrometria de RMN de ¹H, é um simpleto largo em aproximadamente 3,6 ppm, correspondente aos hidrogênios ligados aos átomos de nitrogênio.

A partir das dialquilfosforilidrazinas sintetizadas os derivados fosforilidrazônicos foram obtidos explorando a clássica condensação catalisada por ácido com os respectivos aldeídos benzoicos orto ou para-substituídos, à temperatura ambiente^19,20 (Esquema 1).

A natureza dos substituintes (R e X) foi eleita em função de suas propriedades eletrônicas e hidrofóbicas, de maneira a permitir que se avaliassem suas distintas contribuições para o perfil de atividade desejado.

Embora em derivados hidrazônicos de aldeídos ou cetonas, pode-se obter dois diastereoisômeros configuracionais, Z e E. A análise dos espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H e ¹³C destes compostos permitiu evidenciar apenas um dos dois possíveis diastereoisômeros. O experimento de RMN de ¹H NOESY evidenciou, quando comparado com trabalhos anteriores, ser o diastereoisômero E, por ser a configuração termodinamicamente mais estável.^13,19

Para a cadeia lateral foram escolhidos o butanol e o isobutanol a fim de propiciar maior lipofilicidade aos novos compostos, quando comparados aos compostos sintetizados por nosso grupo em trabalho anterior.¹³

Podemos observar no Esquema 2, onde está demonstrado simplificadamente o mecanismo de obtenção das dialquilfosforilidrazonas, que há possibilidade de ataque do par de elétrons do nitrogênio pelas duas faces da carbonila levando, a princípio, a um par de enantiômeros que, por sua vez, em cada estereoisômero, elimina água para gerar a hidrazona correspondente. Assim, existem duas possibilidades de eliminação, em um a fenila se encontra entre um hidrogênio e o par de elétrons livres do nitrogênio (1a) e em outro a fenila está entre a fosforila, que é um grupo volumoso tetraédrico, e o par de elétrons livres (1b), resultando em um acentuado impedimento estérico. Assim, o ataque pelo caminho a é preferencial e apenas o diastereoisômero E é formado.

Os espectros de infravermelho das dialquilfosforilidrazonas apresentam bandas de absorções bem definidas, sendo as principais correspondentes às frequências de estiramento das ligações P=O, P-O-C e C=N. Nos compostos de fósforo pentavalente, onde o átomo de fósforo está ligado a um átomo de nitrogênio e a dos grupamentos alcóxidos, a faixa de frequência de estiramento da ligação P=O é, geralmente, de 1198 a 1274 cm^-1.¹⁵ Já a ligação P-O-C, como citado, absorve na faixa de 950 a 1018 cm^-1, enquanto que a ligação C=N possui frequência de estiramento na faixa de 1580 a 1690 cm^-1.²¹

Na análise por espectrometria de RMN ¹H, esses compostos apresentam como característica principal um dupleto com deslocamento químico centrado em 8,41 a 11,32 ppm, referente ao hidrogênio ligado ao nitrogênio, com constante de acoplamento (J) com o fósforo variando de 26,33 a 29,76 Hz e um simpleto com deslocamento químico (δ) em 7,77 a 8,37, referente ao hidrogênio imídico. Na análise por espectrometria de RMN ¹³C, são característicos desses compostos um dupleto com deslocamento químico em aproximadamente 143 ppm, relativo ao carbono imídico, com constante de acoplamento de 19 a 20 Hz.

Atividade anti-Leishmania (L.) amazonensis e anti-T. cruzi

As dialquilfosforilidrazonas foram avaliadas in vitro sobre promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis e epimastigotas de T. cruzi por contagem direta em câmara de Neubauer, na concentração de 50 µM em DMSO, que foi utilizado no controle e também contra a célula do hospedeiro (linfócitos de murine). Os resultados dos experimentos estão na Tabela 1.

Pelos dados mostrados na Tabela 1 observa-se, em linhas gerais, um maior percentual de inibição dos compostos testados contra a Leishmania amazonensis, exceto no caso de 3e e 4d, que foram mais ativos contra epimastigotas do T. cruzi. Não houve correlação entre as atividades tóxicas frente aos dois protozoários.

Apesar dos dados obtidos não nos permitirem traçar uma relação entre o efeito eletrônico dos substituintes e as atividades tóxicas observadas, nota-se que a presença do grupamento NO₂ (3b, 3c e 4b) gera compostos com acentuada toxicidade, provavelmente devido à geração de espécies radicalares citotóxicas.²²

Cabe ressaltar que todos os derivados quando avaliados frente a linfócitos do hospedeiro não apresentaram efeitos tóxicos na dose testada (50 µM).

CONCLUSÕES

As treze dialquilfosforilidrazonas são inéditas e foram obtidas com bons rendimentos. Por se tratar de reações relativamente simples e seu método de obtenção ser extremamente eficaz, isto é um passo inicial importante para a síntese de novos derivados com outros diferentes substituintes a fim de se estabelecer uma relação estrutura atividade.

O estudo preliminar in vitro desses compostos sobre promastigotas de Leishmania amazonensis e epimastigotas de T. cruzi evidenciou uma eficiente atividade inibitória de sua proliferação, em concentrações não tóxicas para células de mamíferos. Os resultados obtidos apontam alguns derivados como potenciais agentes antiparasitários contra tripanossomatídeos, em especial, Leishmania amazonensis. Estão sendo realizados processamentos ultraestruturais para elucidar os sítios-alvo destes compostos nos parasitos.

AGRADECIMENTOS

À CAPES, ao CNPQ e à FAPERJ pelo apoio financeiro.

Recebido em 26/11/10; aceito em 1/4/11; publicado na web em 10/6/11

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  http://www.dndi.org.br/pt/doencas-negligenciadas/, acessada em Novembro 2010.
  » link
• ³
  Organização Mundial de Saúde; http://www.who.int/leishmaniasis/, acessada em Novembro 2010.
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• ⁴
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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Out 2011
• Data do Fascículo
  2011

Histórico

• Recebido
  26 Nov 2010
• Aceito
  01 Abr 2011