Quantificação sérica de vitamina C por CLAE-UV e estudo de estabilidade

Serum quantification of vitamin C by HPLC-UV and stability study

Resumo

Vitamin C, an exogenous antioxidant, is essential to human health. In this study, a method was validated to serum vitamin C quantification by HPLC-UV. Its stability with and without the use of tris [2-carboxy-ethyl] phosphine hydrochloride (TCEP), at -20 and -80 °C, in serum and supernatant were also evaluated. Analysis showed r² > 0.99, precision CV% < 15% and % bias < 15%, being linear, precise and accurate. The stability test revealed that using TCEP in serum storage at -20 and -80 °C or in supernatant at -80 °C the vitamin C levels remain stable for 30 and 12 days, respectively.

HPLC; vitamin C; stability

HPLC; vitamin C; stability

NOTA TÉCNICA

Quantificação sérica de vitamina C por CLAE-UV e estudo de estabilidade

Serum quantification of vitamin C by HPLC-UV and stability studY

Marília Baierle; André de Bairros; Ana Paula Moreira; Rachel Bulcão; Miguel Roehrs; Fernando de Freitas; Juliano Durgante; Natália Brucker; Mariele Charão; Solange Cristina Garcia^*

Departamento de Análises, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga, 2752, 90610-000 Porto Alegre - RS, Brasil

ABSTRACT

Vitamin C, an exogenous antioxidant, is essential to human health. In this study, a method was validated to serum vitamin C quantification by HPLC-UV. Its stability with and without the use of tris [2-carboxy-ethyl] phosphine hydrochloride (TCEP), at -20 and -80 °C, in serum and supernatant were also evaluated. Analysis showed r² > 0.99, precision CV% < 15% and % bias < 15%, being linear, precise and accurate. The stability test revealed that using TCEP in serum storage at -20 and -80 °C or in supernatant at -80 °C the vitamin C levels remain stable for 30 and 12 days, respectively.

Keywords: HPLC; vitamin C; stability.

INTRODUÇÃO

A vitamina C (L-ácido ascórbico) é um dos nutrientes hidrossolúveis mais importantes da dieta humana,¹ pois esta substância não é sintetizada pelo organismo do homem devido à ausência da enzima L-gulonolactona oxidase, a qual catalisa a etapa final da síntese de ácido ascórbico.^2,3 Diante da incapacidade de síntese endógena de vitamina C, o organismo adquire esta substância através da dieta ou de suplementos vitamínicos.^4-6

Os efeitos benéficos da vitamina C em humanos ocorrem devido a sua cofunção em processos enzimáticos^7,8 e atividade antioxidante através da captura de ânions superóxido (-O₂^.) para formação do radical semideidroascorbato, o qual é reduzido pela glutationa reduzida (GSH).^9,10 Já foi verificado que as concentrações de vitamina C no sangue são positivamente relacionadas à saúde, e inversamente com morbidade e mortalidade, pois esta vitamina está associada positivamente com os níveis de colesterol c-HDL¹¹ e hemoglobina,^5,7 além de contribuir com a regeneração da vitamina E oxidada, predizer o risco de acidente vascular cerebral,¹² auxiliar na terapia da diálise¹³ e prevenir complicações gestacionais.^14,15 Isso demonstra que a vitamina C pode ser um biomarcador tanto do estado de saúde, como também do status nutricional de um indivíduo.^5,7,15-19 Entretanto, baixas ou elevadas concentrações desta vitamina no organismo apresentam ações oxidantes.^20-22 Diante disso, a quantificação de níveis circulantes de vitamina C também é considerada um biomarcador do estresse oxidativo em humanos.^18,23-26

Existem vários métodos para a quantificação dos níveis de vitamina C sanguíneos.^27-32 Os métodos espectrofotométricos são baseados na derivatização da vitamina C ou no seu caráter redutor, apresentando como vantagens o seu baixo custo e rapidez de análise.^33-35 Porém outras substâncias presentes em amostras biológicas, tais como íons de ferro ou cobre, açúcares ou ácido glicurônico, citrato e peróxido de hidrogênio, podem interferir significativamente na sua quantificação.³⁶ Nesse sentido, o método padrão para quantificar a vitamina C é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), pois se trata de uma técnica mais sensível e específica que os métodos espectrofotométricos e não necessita de derivatização.³² Os principais detectores utilizados para quantificação desta vitamina são os detectores ultravioleta (UV) e eletroquímico (EC).^{8,16,32,37,38} A dosagem de vitamina C também pode ser realizada utilizando detectores de fluorescência ou, ainda, por espectrometria de massa, porém estes métodos não são muito difundidos devido ao alto custo da análise.³²

Outro aspecto peculiar da vitamina C é a sua instabilidade. Em pH biológico, a principal forma desta substância é o ascorbato, o qual é rapidamente oxidado a de-hidroascorbato e, então, depletado no fluido biológico extracelular. A oxidação da vitamina C no plasma é influenciada pela temperatura, luz, pH, saturação de oxigênio, solventes e presença de enzimas oxidantes ou de íons ferro.⁸ Por isso, vários estudos indicam o uso de ditiotreitol (DTT),³⁹ ácido meta-fosfórico (AMP),^16,23 cisteína³¹ ou tris [2-carboxietil] hidrocloridrato de fosfina (TCEP)^8,40 para evitar a oxidação da vitamina C ex vivo em amostras de sangue. Neste sentido, Lykkesfeldt⁴⁰ demonstrou que o TCEP mantém os níveis de vitamina C em pH ácido melhor do que o DTT.

Portanto, o objetivo do presente estudo foi validar um método simples e rápido para a quantificação sérica de vitamina C através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando coluna de fase reversa com detecção ultravioleta (UV) e usando TCEP como agente redutor. Além disso, foi avaliada também a sua estabilidade em soro a -20 e -80 °C no decorrer de 30 dias, com e sem o uso de TCEP.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiais e reagentes

L-ácido ascórbico, fosfato de sódio di-hidrogênio (NaH₂PO₄), azida sódica (NaN₃), 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH), ácido perclórico (HClO₄) e hidróxido de sódio (NaOH) foram adquiridos da Vetec^® (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Tris [2-carboxietil] hidrocloridrato de fosfina (TCEP) foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Filtro de acetato de celulose 0,22 micra foi adquirido da Sartorius^® (Alemanha). Soluções aquosas foram preparadas empregando água purificada através do sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.

Condições cromatográficas

O sistema de cromatografia líquida consistiu de uma bomba modelo K 1001, com injetor manual e amostrador de volume fixo de 20 µL, um degasser online modelo K 5004 e um detector UV/VIS modelo K 2501, Knauer^® (Alemanha).

A separação cromatográfica foi realizada utilizando coluna de fase reversa C18 Eurospher-100^® 250 x 4,6 mm com poro de 5 µm de diâmetro de partícula e pré-coluna Eurospher-100^®, 5 x 4 mm, 5 µm de diâmetro de partícula. O controle cromatográfico e o processamento dos dados foram realizados usando o programa Eurochrom 2000 Software^®, edição básica 2.05 para Windows, Knauer^® (Alemanha).

A fase móvel contendo 25 mM de NaH₂PO₄ e 0,00125% de NaN₃ foi ajustada a pH 2,5 com ácido orto-fosfórico e filtrada através de um filtro de 0,22 micra sob vácuo, previamente à sua utilização na cromatografia. As análises foram realizadas em temperatura ambiente, com fluxo de 1 mL/min, sendo a absorbância monitorada a 245 nm.

Soluções

As soluções de vitamina C e a curva de calibração foram preparadas diariamente com água purificada, sempre ao abrigo da luz. O TCEP foi diluído a 9% em água milli-Q e utilizado em todas as soluções. A solução estoque de vitamina C apresentava uma concentração de 1 g L^-1 com adição de 10 µL de TCEP 9% em um balão de 50 mL. A partir desta solução, foi feita uma solução de trabalho de vitamina C com concentração final de 20 mg L^-1, contendo também 10 µL de TCEP 9%.

A curva de calibração aquosa foi preparada em balões volumétricos de 5 mL com concentrações de 2, 4, 8, 16 e 20 mg L^-1 de vitamina C, na qual todos os pontos receberam 10 µL de TCEP 9%. Posteriormente, 100 µL de cada ponto foram transferidos para o seu respectivo eppendorf âmbar contendo 10 µL de TCEP 9%. A análise foi feita em duplicata. O conteúdo dos eppendorfs foi homogenizado em vórtex por 10 s e, em seguida, incubados no gelo em ambiente escuro por 15 min.

Após esse período, as alíquotas de cada ponto da curva receberam 100 µL de uma solução de ácido perclórico 10% (v/v), que também continha em sua composição 10 µL de TCEP a 9%; todos os pontos foram novamente homogeneizados por 10 s e mantidos no banho de gelo até sua injeção no cromatógrafo (CLAE-UV).

Preparo das amostras

Amostras de sangue coletadas por venopunção em tubos Vacutainer^® sem anticoagulante foram imediatamente centrifugadas a 1500 g por 10 min em uma centrífuga refrigerada a 4 °C (Minifuge Heraus^®, Alemanha), sendo 100 µL de soro posteriormente separados em eppendorfs âmbar já contendo uma alíquota de 10 µL de TCEP 9%, em duplicata. Essa etapa foi realizada em ambiente parcialmente escuro, assim como todo o procedimento de análise da vitamina C. Em seguida, procedeu-se à homogeneização em vórtex por 10 s e os eppendorfs permaneceram em banho de gelo por 15 min. Então, para a desproteinização da amostra, foram adicionados em cada eppendorf 100 µL de ácido perclórico 10% (1:1), mantido em banho de gelo e, após ser realizada nova homogeneização em vórtex por 10 s, o material foi centrifugado por 4 min a 2800 g em uma centrífuga de eppendorfs (HT Centrifuge^®, Taiwan). O sobrenadante foi separado e 20 µL foram injetados diretamente no sistema de CLAE, ou mantidos por até 2 h em banho de gelo ao abrigo da luz, até o momento da injeção no cromatógrafo.

Curvas de calibração com adição de padrão no soro

Curvas de calibração com adição de padrão foram preparadas com pool de soro humano, sendo a concentração de vitamina C encontrada no soro sem adição de padrão quantificada como nível basal. Soluções padrões foram feitas partindo-se de uma solução de trabalho de vitamina C com concentração de 250 mg L^-1. Todos os pontos foram feitos em balões volumétricos (5 mL) nas seguintes concentrações: 20, 40, 80, 160 e 200 mg L^-1, visto que houve uma diluição do padrão com o soro (1:10) resultando em concentrações finais de 2, 4, 8, 16 e 20 mg L^-1em um volume final de 100 µL. A partir daí, procedeu-se como descrito no preparo das amostras.

Validação do método

Linearidade

A linearidade corresponde à capacidade do método em mostrar que os resultados são diretamente proporcionais às concentrações do analito na amostra, dentro de um intervalo.⁴¹ Para isso foram utilizadas 5 curvas analíticas aquosas de vitamina C com antioxidante TCEP nas concentrações 2, 4, 8, 16 e 20 mg L^-1 e 5 curvas analíticas de soro com adição de padrão nas mesmas condições. O soro sem adição de vitamina C foi considerado como basal. As curvas foram preparadas em 5 dias diferentes, com pool de soro e a linearidade foi avaliada através da equação da reta e do coeficiente de regressão (r²) das curvas, o qual deve ser superior a 0,98.^41,42

Precisão e exatidão

A precisão do método é determinada pelo grau onde múltiplas injeções de padrões se assemelham e a exatidão é o grau para o qual os resultados gerais se aproximam do valor real, podendo ser obtida pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente.^41,42 A exatidão e as precisões intra e interdia foram determinadas em 5 dias diferentes através da análise em triplicata de pool de soro com adição de vitamina C em concentrações na faixa de 2 a 20 mg L^-1. As precisões intra e interdia foram calculadas através do coeficiente de variação (CV%) das áreas relativas obtidas, já a exatidão foi expressa pela tendenciosidade (% bias).

Recuperação

A recuperação foi relatada como a eficiência da desproteinização sem perdas do analito, sendo os resultados expressos em porcentagem. A recuperação foi guiada pela relação entre as áreas dos picos de replicatas de soro com adição de vitamina C (2-20 mg L^-1) e as respectivas áreas de padrões aquosos.

Sensibilidade

O limite de detecção (LD) representa a menor concentração do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, já o limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração do analito que pode ser medida, utilizando-se um determinado método analítico.^41,42 Neste estudo, LD e LQ foram calculados com base em uma relação sinal-ruído de 3:1 e 10:1, respectivamente.⁴²

Robustez

A robustez de um método mede a sua sensibilidade diante de pequenas variações;^41,42 foi testada pela variação de parâmetros como analista, fluxo e uso de padrões de vitamina C de diferentes marcas.

Estabilidade

A estabilidade da vitamina C pelo método cromatográfico foi avaliada em pool de soro. Para isso, parte do soro foi separada em alíquotas de 100 µL em duplicatas com e sem adição de 10 µL de TCEP como antioxidante. Então, estas alíquotas foram previamente desproteinizadas com a adição de 100 µL de HClO₄ 10% (1:1) e homogeneização em vórtex por 10 s. Após esta etapa, os eppendorffs foram centrifugados por 4 min a 2800 g. O sobrenadante foi então separado e armazenado em um novo eppendorf âmbar para cada dia de análise. Outra parte do soro, aliquotada com e sem adição de 10 µL de TCEP, não foi previamente desproteinizada, sofrendo este procedimento apenas no dia de cada análise. A estabilidade foi avaliada imediatamente após a coleta (dia 0), 1 dia após (dia 1), 3 dias após (dia 2), 6 dias após (dia 6), 9 dias após (dia 9), 12 dias após (dia 12) e 30 dias após a coleta (dia 30). O material preparado nas diferentes condições descritas acima foi armazenado à -20 e à -80 °C, sendo descongelado somente momentos antes da injeção no sistema cromatográfico.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada pelo software Statistica^® 6.0 através de teste t de Student, sendo que valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Além disso, amostras com variação máxima de 15% foram consideradas estáveis, de acordo com a ANVISA.⁴²

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A quantificação de vitamina C sérica é de interesse clínico, pois alterações em seus níveis podem refletir o acesso desta biomolécula aos tecidos.^8,43 Além disso, é sabido que a vitamina C sérica é considerada um biomarcador do estresse oxidativo com suas concentrações alteradas em um grande número de patologias, tais como doença de Alzheimer e outras desordens neurológicas, especialmente aquelas relacionadas à cognição.^12,18,24,44

A separação cromatográfica de vitamina C sérica foi satisfatória com a fase móvel contendo 25 mM de NaH₂PO₄ e 0,00125% de NaN₃, pois apresentou uma boa separação em relação a outros componentes do soro como ácido úrico. Um típico cromatograma da quantificação de Vitamina C em nível basal de uma amostra de soro é mostrado na Figura 1. O tempo de retenção para vitamina C foi de 5,7 min e o tempo total de corrida cromatográfica foi de 18 min, devido ao ácido úrico que tem um tempo de retenção de 15 min, cujo pico é mostrado também na Figura 1. O método não apresentou interferências no tempo de retenção da vitamina C quando se compararam as análises de padrões aquosos com análises de pool de soro, além disso, os picos cromatográficos apresentaram-se simétricos e com excelente resolução da linha de base.

A equação da reta obtida para curvas com adição de padrão no soro (n=5) foi y = 0,6338x - 0,122 e para curvas aquosas (n=5) y = 0,597x - 0,0146, e os coeficientes de regressão (r²) foram 0,9989 e 0,9998 para as curvas com adição e aquosa, respectivamente. As curvas analíticas mostraram excelente linearidade e paralelismo no intervalo de concentração de 2-20 mg L^-1, incluindo toda a faixa de concentração provável de vitamina C em um indivíduo, com um coeficiente de correlação > 0,995, estando de acordo com a literatura.^41,42 Neste sentido, as curvas de soro com adição de padrão e aquosa apresentaram comportamento semelhante, o que indica que é possível determinar este analito sem a necessidade de matriz para eliminar prováveis resultados falso-positivos na sua quantificação.

As precisões intra e interdia (expressa por % coeficiente de variação) e a exatidão (% bias) estão representadas na Tabela 1. A precisão intradia foi menor que 7% e a precisão interdia de todas as concentrações foi menor que 15%. A exatidão expressa pela tendenciosidade apresentou valores satisfatórios segundo a literatura, inferiores a ± 15%.^41,42 Como pode ser visto ainda na Tabela 1, a análise de recuperação demonstrou que a vitamina C foi preservada durante todos os procedimentos de pré-tratamento da amostra, pois os valores encontrados estão dentro da faixa preconizada que é de 100 ± 15%.^41,42

O limite de detecção (LD) encontrado foi de 0,51 mg L^-1 e o limite de quantificação (LQ) foi de 1,71 mg L^-1. Os valores de referência para a vitamina C no soro variam de 6 a 16 mg L^-1, concentrações na faixa de 2 a 6 mg L^-1 indicam deficiência moderada e abaixo de 2 mg L^-1 representam uma deficiência grave,^45,46 sendo assim o limite de quantificação (LQ) do presente método mostrou-se adequado à análise de vitamina C nas amostras de soro.

O método mostrou ser robusto frente a diferentes condições como analista e uso de padrões de vitamina C de diferentes marcas. O fluxo variou de 0,9 a 1,1 mL/min e os resultados mostraram que quanto maior o fluxo, menor é o tempo de corrida, sem perda da vitamina.

Os parâmetros de especificidade, sensibilidade, linearidade, precisão e exatidão obtidos permitem a utilização do método analítico desenvolvido para quantificação de vitamina C em amostras de soro, o qual não incluiu o uso de solventes orgânicos como fase móvel, sendo esta composta apenas por NaH₂PO₄ e NaN₃, tornando o método mais barato. O emprego de água e metanol na solução de limpeza previne danos no sistema cromatográfico após o trabalho. Além disso, de acordo com os resultados encontrados, apenas a desproteinização com ácido perclórico 10% é suficiente como tratamento pré-analítico, não sendo necessário o uso de solventes orgânicos ou outras etapas de extração, o que poderia aumentar o custo da análise e/ou prejudicar a quantificação de vitamina C.

A estabilidade da vitamina C é um problema chave na análise desta biomolécula, pois vários fatores atuam negativamente sobre a mesma, como luz, calor, pH elevado, presença de oxigênio ou íons metálicos, por isso é necessário diminuir a influência destas variáveis ao mínimo.³²

A análise da estabilidade em amostras armazenadas a -20 °C, com e sem o antioxidante TCEP, previamente desproteinizadas (sobrenadante) e desproteinizadas somente antes da injeção cromatográfica (soro) pode ser vista na Figura 1S (material suplementar). Os resultados mostraram que houve diferença significativa entre as concentrações de vitamina C das amostras com e sem TCEP (p<0,05), sendo que as amostras sem TCEP não apresentaram quantidades quantificáveis no 30º dia, último dia de análise, o que indica a necessidade de antioxidante para evitar a queda brusca nos níveis de vitamina C, como descrito em outros trabalhos.^8,40,47 Além disso, quando armazenado com TCEP, o soro demonstrou ser favoravelmente mais estável que o sobrenadante (p<0,05), mantendo sua concentração por 30 dias (variação < 15%) a -20 °C, resultado contrário às amostras armazenadas sem TCEP, as quais não se mostraram estáveis nem por 24 h (variação > 15% na área do pico já no 1º dia).

Na Figura 2 são apresentados os resultados da estabilidade em soro e em sobrenadante armazenados a -80 °C, ao longo de 30 dias. Mais uma vez foram encontradas diferenças significativas entre os níveis de vitamina C das amostras armazenadas com e sem TCEP (p<0,05).

As amostras sem TCEP apresentaram uma queda constante ao longo das análises realizadas em 30 dias, sendo que o soro não se mostrou estável e o sobrenadante permaneceu estável por somente 24 h (variação < 15%).

A adição de TCEP evitou a diminuição dos níveis de vitamina C, mantendo a concentração do analito no soro íntegro por todos os dias em que houve análise. Lykkesfeldt⁴⁰ já havia demonstrado que TCEP mantém os níveis de vitamina C em baixo pH. Já o sobrenadante foi estável até o 12º dia (variação < 15%), ou seja, apenas após esse dia é que houve diferença estatística entre o soro e o sobrenadante.

Em resumo, com o uso de TCEP a concentração inicial de vitamina C em pool de soro encontrada imediatamente após a coleta foi de 4,04 ± 1,02 mg L^-1, enquanto que após 30 dias, armazenado a -80 ºC, foi de 4,01 ± 0,38 mg L^-1 e armazenado a -20 °C foi de 4,64 ± 0,11 mg L^-1, confirmando a necessidade de antioxidante em ambas as temperaturas de armazenamento.

Alguns estudos já demonstraram que a prévia desproteinização da amostra biológica e posterior armazenamento, com a presença ou ausência de algum antioxidante, garantia uma relativa estabilidade da vitamina C,^8,17,32 porém, os resultados encontrados aqui para o sobrenadante (soro previamente desproteinizado) demonstraram um comportamento similar ao soro sem desproteinização prévia somente na presença de TCEP e temperatura de armazenamento de -80 °C e, ainda assim foi estável por um número menor de dias se comparado ao soro. Já na ausência de TCEP, e também nas análises das amostras armazenadas a -20 ºC, a prévia desproteinização não favoreceu a estabilidade, não apresentando nenhuma vantagem. Conforme o exposto, a estabilidade da vitamina C parece estar relacionada à temperatura de armazenamento, ou seja, ela aumenta à medida que a temperatura diminui.⁴⁸

Diante disso, foi possível verificar que as melhores condições de armazenamento de amostras para posterior quantificação de vitamina C por CLAE foram o soro com adição de TCEP tanto a -20 quanto a -80 °C. No entanto, ainda são necessários mais estudos relacionados à estabilidade da vitamina C em diferentes temperaturas e condições, uma vez que este analito pode ser afetado por diversos fatores, como mencionado anteriormente.

CONCLUSÃO

O presente método de quantificação de vitamina C por CLAE em material biológico mostrou excelente sensibilidade analítica, especificidade, precisão, recuperação e linearidade havendo suficiente separação da vitamina C dos demais constituintes do soro, ou seja, todos os parâmetros avaliados estão de acordo com as recomendações internacionais e com a legislação vigente no país.^41,42

Em relação à estabilidade da vitamina C, conclui-se que é dependente da temperatura de armazenamento, porém se houver adição de TCEP 9% ao soro logo após a coleta, este pode ser armazenado tanto a -20 quanto a -80 °C, mantendo-se as concentrações ao longo de 30 dias. Isto demonstra que há necessidade de antioxidante para quantificação desta vitamina no soro sem a necessidade de prévia desproteinização para armazenamento da amostra. Enfim, o método proposto é simples, de baixo custo quando comparado a outros métodos por CLAE e aplicável à rotina laboratorial. Por outro lado, pode-se sugerir ainda que para trabalhos científicos utilizando amostras de soro de animais de laboratório onde a coleta é, normalmente, no mesmo período para todos os animais, o soro ou sobrenadante poderiam ser utilizados com pequenas perdas, mas praticamente constantes, até 30 dias, se mantidas a -80°C.

MATERIAL SUPLEMENTAR

O material suplementar, disponível gratuitamente na forma de arquivo PDF em http://quimicanova.sbq.org.br, apresenta a Figura 1S. Estabilidade da vitamina C em soro* e em sobrenadante armazenados a temperatura de -20 °C, com e sem adição do antioxidante TCEP, mostrada em dias. *As amostras de soro congeladas foram desproteinizadas somente no momento da quantificação cromatográfica.

AGRADECIMENTOS

À CAPES/DAAD (PROBRAL 352/10) e ao CNPq - Edital Universal 2009 (concedida à S. C. Garcia) pelo apoio financeiro. Ao CNPq pela bolsa de doutorado (cota do pesquisador) concedida à M. Baierle e pela bolsa de pesquisadora concedida à S. C. Garcia.

Recebido em 13/4/11; aceito em 4/7/11; publicado na web em 19/8/11

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Abr 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  13 Abr 2011
• Aceito
  04 Jul 2011