Determinação de glicerol livre e total em amostras de biodiesel por método enzimático com detecção colorimétrica

Free and total glycerol determination in biodiesel samples by enzymatic method with colorimetric detection

glycerol content; biodiesel; enzymatic-colorimetric method

NOTA TÉCNICA

Determinação de glicerol livre e total em amostras de biodiesel por método enzimático com detecção colorimétrica

Free and total glycerol determination in biodiesel samples by enzymatic method with colorimetric detection

Higor da Cal Valdez^I; Roberto Salgado Amado^I; Flávia Carvalho de Souza^I; Eliane D'EliaI, ^*; Eduardo de Castro Vieira^II

^IInstituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Athos da Silveira Ramos, 149, Centro de Tecnologia, Bl. A, Cidade Universitária, 21941-909 Rio de Janeiro - RJ, Brasil

^IICENPES/PETROBRAS, Av. Horacio Macedo 950, Cidade Universitária, 21941-915 Rio de Janeiro - RJ, Brasil

ABSTRACT

A method based on enzymatic activities was developed using three enzymes (glycerokinase, glycerol-3-phosphate oxidase and peroxidase) and colorimetric detection for the determination of glycerol in biodiesel. The enzymatic conversion of glycerol produces H₂O₂ that is eliminated by the action of peroxidase, an oxygen acceptor and 4- aminoantipirine, producing water and a colored compound, which was analyzed. This method showed good linear correlation coefficient (r = 0.9937) in the concentration range of 4.95 x 10^-5 to 3.96 x 10^-4% (w/w) and had experimental limits of detection and quantitation of 7.10 x 10^-6 and 2.10 x 10^-5% (w/w), respectively.

Keywords: glycerol content; biodiesel; enzymatic-colorimetric method.

INTRODUÇÃO

Atualmente, o biodiesel é encontrado misturado ao óleo diesel nos postos de abastecimento. O biodiesel é obtido a partir da reação de transesterificação de óleos vegetais com alcoóis primários, na presença de catalisador ácido ou básico.¹

Esta reação produz um sistema bifásico com uma fase não polar de ésteres de ácidos graxos e outra mais densa constituída por glicerol e outros componentes residuais do processo. Após a decantação e separação, o biodiesel é purificado através de um processo de lavagem com água para retirar resíduos de glicerol livre e outros contaminantes.

A presença de glicerol livre (GL) e de glicerídeos, quantificados indiretamente pelo glicerol total (GT), no produto final pode, em níveis elevados, levar à formação de depósitos no motor, daí a necessidade de serem monitorados e controlados.^2,3 Para tanto, a Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) baixou a resolução Nº 4 de 2010 onde limita o teor máximo de GL em 0,02% e de GT em 0,25% m/m.⁴

Dentre todos os procedimentos disponíveis para análise de GL e GT, os métodos cromatográficos e enzimáticos oferecem os melhores desempenhos analíticos. Até o momento, a cromatografia a gás (CG) é a técnica recomendada pela ANP para a determinação de glicerol livre e total em biodiesel, pois apresenta boa precisão para a quantificação de componentes minoritários, podendo ser realizada em modalidade inteiramente automatizada, o que a torna o método preferido para aplicações industriais.

O primeiro trabalho sobre o uso de CG para a quantificação de ésteres totais, bem como de mono-, di- e triglicerídeos utilizou amostras de biodiesel de soja. As amostras foram tratadas com N,O-bis(trimetilsilil) trifluoracetamina (BSTFA) para converter grupamentos hidroxílicos em seus trimetilsilil derivados (TMS) correspondentes. Este tipo de transformação química foi o procedimento utilizado para a quantificação de glicerídeos em biodiesel por CG nos artigos subsequentes.⁵

Um método para análise de GL foi desenvolvido utilizando CG acoplada a um injetor em fluxo.⁶ Neste método, a determinação é feita sem extração e derivatização, tendo um limite de detecção de aproximadamente 0,02% m/m, que parece ser insuficiente para o controle de qualidade do biodiesel, que contém concentrações menores de glicerol. Uma etapa de concentração usando extração de glicerol com água e separação cromatográfica em uma coluna capilar carbowax conduziu a um limite de detecção de aproximadamente 0,002% m/m.⁶ A maioria dos trabalhos sobre a utilização de CG no controle de qualidade do glicerol em amostras de biodiesel emprega a análise por injeção em fluxo.^7-9 No entanto, existem trabalhos com CG acoplada a um espectrômetro de massas.¹⁰

Outra técnica utilizada para análise de GL é a espectrofotometria na região do ultravioleta-visível (UV-Vis). O glicerol, neste caso, após a sua extração, é oxidado a formaldeído com metaperiodato de sódio, seguido da reação Hantzsch com acetilacetona, formando o composto 3,5-diacetil-1,4-di-hidrolutidina, que apresenta absorvância máxima em 410 nm.¹¹

Um método utilizando a eletroforese capilar (EC) foi desenvolvido para a quantificação de GL em diferentes amostras de biodiesel. O procedimento consistiu em, antes da análise, reagir o glicerol, inicialmente extraído da amostra de biodiesel, com periodato de sódio.¹² Nessa reação, o glicerol sofre uma clivagem oxidativa produzindo formaldeído, ácido fórmico, água e iodato de sódio. O teor de glicerol é obtido indiretamente, determinando-se a concentração de iodato formado nesta reação por EC.

O teor de GT foi determinado por meio de saponificação de biodiesel com posterior determinação de glicerol por análise fotométrica utilizando enzimas.¹³ O método, entretanto, mostrou baixa precisão, que pode estar associada ao processo de saponificação do biodiesel.

Com um procedimento parecido, a Sigma-Aldrich desenvolveu um kit (BQP-02), baseado no método Greenhill descrito numa patente, para a determinação enzimática de GL e GT em biodiesel.¹⁴ O método baseia-se num procedimento fotoenzimático, semelhante ao usado nas análises de triglicerídeos no sangue, usando duas enzimas na leitura de GL e contém uma etapa de saponificação para a determinação de GT. Em algumas amostras, a presença de produtos voláteis (os solventes usados como aditivos) pode causar interferência na determinação do glicerol livre.¹¹ O método é rápido, preciso, de baixo custo, pouco complicado no manuseio e não tóxico, por não utilizar piridina, solvente usado na etapa de derivatização na determinação de glicerol por CG. As reações enzimáticas envolvidas neste método podem ser vistas na Figura 1.

O glicerol, na presença da adenosina trifosfato (ATP) e da enzima glicerol-quinase (GK), produz adenosina difosfato (ADP) e glicerol-3-fosfato (G-3-P) (reação 1) que, na presença de glicerol-3-fosfato oxidase (GPO) e oxigênio, produz di-hidroxiacetonafosfato (DAP) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) (reação 2). Finalmente, na presença de uma peroxidase, um aceptor de oxigênio (AO) e a 4-aminoantipirina (4-AAP), são formados a água e um composto colorido (CC) (reação 3), que pode ser determinado espectrofotometricamente.

É possível, também, determinar glicerol livre e total em biodiesel a partir do consumo de oxigênio produzido durante a reação enzimática em uma célula eletroquímica, conforme indicado nas reações 1 e 2, utilizando-se para isso a célula de Clark, a qual gera uma corrente catódica que é proporcional à concentração de oxigênio presente na solução.²

A determinação de glicerol pode ainda ser feita a partir da análise amperométrica do H₂O₂ produzido na reação 2 utilizando, neste caso, um eletrodo de trabalho de platina polarizado em +0,65 V_Ag/AgCl de modo a oxidar o peróxido formado a oxigênio molecular.¹⁵ Este tipo de análise também foi realizado para determinação de triglicerídeo, utilizando-se um biossensor amperométrico construído a partir de uma membrana de acetato de celulose na qual foram imobilizadas três enzimas: uma lipase comercial, a GK e a GPO, sobre o eletrodo de trabalho de platina e, também, para análise de glicerol livre e total em amostras de biodiesel.^16,17

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um método analítico de baixo custo, sensível, rápido e com instrumentação simples para a determinação do teor de GL e GT em amostras de biodiesel. Para isso, foi utilizado um kit enzimático comercial para determinação de triglicerídeos com detecção colorimétrica. Pretende-se que este método atenda às especificações de qualidade da ANP, no intuito de substituir o método vigente que utiliza CG, devido principalmente ao seu alto custo.

PARTE EXPERIMENTAL

Todas as amostras de biodiesel foram previamente analisadas por CG, no CENPES/PETROBRAS, para obtenção dos valores de referência seguindo o procedimento da norma ASTM D6584.¹⁸ Neste método, a amostra é analisada por cromatografia a gás com detecção por ionização em chama após a sinalização com N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA). A separação cromatográfica é realizada através de uma coluna tubular aberta (5% fenil-polidimetilsiloxano) com 10 ou 15 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 0,1 μm de espessura do filme. Hélio ou hidrogênio pode ser utilizado como gás de arraste, com fluxo de 3 mL/min. Uma alíquota de 1 μL de amostra é injetada na coluna que é então aquecida a 50 °C. A seguinte programação do forno foi utilizada: temperatura inicial de 50 °C (1 min), seguida de aumento de 15 °C/min até 180 °C, e posterior aumento da temperatura de 7 °C/min até 230 °C e de 30 °C/min até 380 °C. A temperatura final permaneceu por 10 min. A temperatura do detector foi de 380 °C. Para a calibração foram utilizados dois padrões internos: 1,2,4-butanotriol para glicerol e tricaprina para mono, di e triglicerídeos, além de glicerol, monooleína, dioleína e trioleína como padrões para calibração externa.

No método enzimático com detecção colorimétrica, o teor de GL foi obtido realizando-se primeiro a sua extração a partir de 400 μL de biodiesel em uma mistura de 800 μL de etanol absoluto, 800 μL de água destilada e 1600 μL de heptano. Esta mistura foi agitada em vortex por 1 min, obteve-se a separação das fases em centrífuga por 2 min e a fase mais densa foi analisada.²

Para análise do teor de GT, uma etapa de transesterificação foi realizada no intuito de liberar todo glicerol ainda combinado nas moléculas de mono, di e triglicerídeos presentes na amostra de biodiesel. Para isso, 0,50 g de biodiesel e 2 mL de uma solução de KOH a 3% em etanol absoluto foram adicionados em um tubo com agitação e aquecimento a 65 °C por 30 min. Uma alíquota de 70 µL de ácido acético glacial foi adicionada no intuito de neutralizar a amostra. Esta mistura foi agitada em vortex por 1 min, sendo o glicerol então extraído com 2,0 mL de água destilada e 2 mL de heptano, com posterior agitação em vortex e centrifugação para separação de fases por 2 min.² A fase mais densa contendo o glicerol total foi analisada por colorimetria. Neste trabalho, o método de transesterificação e de extração do glicerol livre seguiu o mesmo procedimento desenvolvido em trabalhos anteriores.^2,17

O método enzimático com detecção colorimétrica utilizado em todas as análises baseou-se na dosagem do substrato pelo método de ponto final. A análise colorimétrica foi realizada em 505 nm, sendo que um volume de 30 μL (para GL) ou 10 μL (para GT) do extrato aquoso e 1 mL do kit enzimático foram adicionados à cubeta de análise.

Utilizou-se um kit enzimático comercial, fornecido pela Bioclin (Quibasa), que inclui ATP a 0,250 mmol L^-1, cloreto de magnésio a 15 mmol L^-1, GK >1500 U/L e GPO>4000 U/L, tampão PIPES pH 7,0 (100 mmol L^-1), entre outros reagentes. Heptano e etanol absoluto foram obtidos da Merck.

O efeito da temperatura na cinética das reações enzimáticas foi avaliado realizando-se análises colorimétricas com 1 mL de kit enzimático contendo 0,02 mmol L^-1 de glicerol em três temperaturas diferentes: 25, 37 e 50 °C.

As curvas de calibração para leituras de glicerol livre e total foram obtidas utilizando-se solução padrão de glicerol em faixas de concentração de 0,005 mmol L^-1 (4,95 x 10^-5% m/m) a 0,038 mmol L^-1 (3,96 x 10^-4% m/m) e 0,004 mmol L^-1 (1,25 x 10^-3% m/m) a 0,145 mmol L^-1 (5,33 x 10^-3% m/m), respectivamente, sendo cada ponto analisado em triplicata, a 25 °C. Os resultados foram submetidos ao teste de Grubbs (G) para a retirada de qualquer valor aberrante.

Para o cálculo do limite de detecção (LD) foi utilizado o critério da inclinação da reta (LD = 3 Δ/b), onde Δ é o desvio padrão das leituras dos brancos e b é a inclinação da reta obtida a partir da curva de calibração. O limite de quantificação (LQ) foi calculado como sendo igual a três vezes o LD.¹⁹

Amostras de biodiesel foram analisadas para determinação de GL e GT em triplicata a 25 °C, sendo os resultados submetidos ao teste de Grubbs (G), sendo que os valores rejeitados não foram utilizados nas análises estatísticas e as médias foram obtidas para fins de comparação com os valores de referência.

A validação do método incluiu o estudo da linearidade, homocedasticidade (teste Cochran), recuperação, precisão intradia e precisão interdias.

O estudo de recuperação foi realizado a partir da quantificação de GL e GT em amostras de biodiesel previamente analisadas por CG, onde os testes F e t foram aplicados para fins de comparação entre os dois métodos - cromatográfico e colorimétrico.

Além disso, realizou-se também o estudo de recuperação de GL e GT em amostras de biodiesel fortificadas com valores conhecidos de glicerol e de triglicerídeos, respectivamente. Para isso, uma amostra de biodiesel de soja com teor de glicerol livre abaixo de 0,01% (m/m) foi fortificada com 0,02; 0,03; 0,04 e 0,05% em massa de glicerol para análise de GL. A recuperação do método para análise de GT foi feita fortificando-se uma amostra de biodiesel de soja, que apresentava 0,068% em massa como valor original de GT, com 0,3% em massa de triglicerídeo, utilizando-se para isso uma amostra de óleo de soja.

O estudo da precisão intradia e interdias foi realizado pela análise quantitativa de triplicatas para duas amostras distintas de biodiesel em um mesmo dia e em dois dias diferentes, respectivamente.

Todas as análises colorimétricas foram feitas em um espectrofotômetro UV-Vis Lambda XLS da Perkin Elmer.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise colorimétrica também é uma técnica bastante utilizada na determinação clínica de triglicerídeos. Os kits enzimáticos utilizados neste trabalho baseiam-se na ação acoplada de 4 enzimas: lipoproteína lípase (LPL), glicerol-quinase (GK), glicerol-3-fosfato oxidase (GPO) e uma peroxidase (POD). A LPL hidrolisa os triglicerídeos, produzindo ácidos graxos e glicerol, que é convertido a di-hidroxiacetona fosfato pela ação das enzimas GK e GPO, conforme as reações 1 e 2. O peróxido de hidrogênio formado na reação 2, na presença de 4-aminoantipirina, 4-clorofenol (aceptor de oxigênio) e POD, produz um composto colorido, cuja absorvância máxima pode ser medida em 505 nm, conforme a reação 3. Neste trabalho a lipoproteína lipase não desempenhou o seu papel, já que foram analisados somente extratos de glicerol em mistura de água:etanol para as análises de glicerol livre e total.

O efeito da temperatura foi avaliado com o objetivo de verificar o possível aumento da velocidade da reação enzimática e consequente diminuição do tempo de análise com o aumento da temperatura. A Figura 2 apresenta os resultados obtidos para as temperaturas de 25, 37 e 50 °C. O tempo necessário para alcançar o ponto final da reação foi de aproximadamente 4 min. Observou-se que não há uma variação significativa na velocidade da reação e, portanto, no tempo de análise com a mudança de temperatura. Além disso, constatou-se uma diminuição da resposta do sistema com o aumento da temperatura (a 50 °C), que pode estar relacionada à desnaturação das enzimas. Como nenhuma diferença significativa foi observada entre as temperaturas de 25 e 37 °C, todas as análises foram realizadas a 25 °C.

A determinação de glicerol livre e total utilizando a técnica colorimétrica foi realizada com base na linearidade do método, que foi avaliada através da construção de uma curva de calibração com glicerol, como analito, na presença do kit enzimático. O GL foi quantificado na faixa de concentração de 0,005 mmol L^-1 (4,95 x 10^-5% m/m) a 0,038 mmol L^-1 (3,96 x 10^-4% m/m). A curva de calibração apresentou linearidade com excelente coeficiente de correlação linear (r = 0,9937).

Os limites de detecção e quantificação determinados pelo critério da inclinação da reta foram de 9,33 x 10^-6 e 2,80 x 10^-5% m/m, respectivamente. Já o limite de detecção obtido experimentalmente foi de 7,10 x 10^-6% m/m, equivalendo a 2,10 x 10^-5% m/m de limite de quantificação, valores estes próximos dos calculados.

Foi observado que o valor de Cochran calculado (0,654) é menor que o tabelado (0,684) para se avaliar o desvio bilateral das variâncias a um nível de significância de 5%, mostrando variâncias homogêneas, conforme o aumento da concentração. Este resultado caracteriza, portanto, um comportamento homocedástico dos dados.

Para verificar a eficiência do modelo de regressão linear proposto, foi analisado o gráfico de resíduo correspondente à curva de calibração. O resíduo é obtido pela diferença do valor previsto pela reta utilizada para a quantificação e os valores obtidos experimentalmente. Os valores obtidos para cada análise estão apresentados na Figura 3.

A partir da análise do gráfico de resíduos construído foi possível avaliar que o modelo de regressão linear proposto se mostra adequado, visto que os resíduos encontrados para as análises não ultrapassaram 0,032 de absorvância, que equivale a 3,83 X 10^-6% m/m, valor este abaixo dos limites de detecção calculados pelo critério de inclinação da reta e obtido experimentalmente. Além disso, observa-se que o método pode ser considerado como livre de tendências, mostrando um comportamento homocedástico dos dados, corroborando o resultado obtido pelo teste de Cochran.

Pode-se confirmar, portanto, que este método enzimático com detecção colorimétrica pode ser usado na determinação de glicerol.

Com base nesses resultados, foram avaliadas 12 amostras de biodiesel, no intuito de quantificar colorimetricamente o teor de GL. Os valores médios obtidos podem ser vistos na Tabela 1 junto com o desvio padrão para cada amostra. Para efeito de comparação, os valores obtidos por CG também são apresentados, além da recuperação do método e o erro relativo ao valor obtido por CG.

As amostras apresentaram recuperação de 94 a 111% e um baixo erro relativo em relação ao valor obtido por CG. Sobre a homogeneidade dos resultados de GL quantificado pelos dois métodos (cromatográfico e colorimétrico), foi observado que o valor calculado de F (1,04) é menor que o valor de F crítico (2,82) considerando 95% de confiança, podendo-se concluir que as variâncias dos dois métodos são equivalentes. Deste modo, um segundo cálculo foi feito para o valor de t (bilateral) para os dois métodos presumindo variâncias equivalentes. Pelos resultados, obteve-se o valor de t calculado (0,98) menor que o de t crítico (2,07) considerando 95% de confiança, o que mostra que as médias para os dois métodos são equivalentes entre si. Ou seja, o método enzimático de determinação de glicerol livre em diferentes amostras de biodiesel com detecção colorimétrica proposto neste trabalho pode ser usado, pois apresenta resultados equivalentes ao método padrão (CG).

A Figura 4 apresenta a correlação entre os métodos enzimático com detecção colorimétrica e CG. O coeficiente angular foi de 0,9836 e o valor obtido para o coeficiente de correlação linear foi de 0,9999, mostrando uma excelente correlação entre os resultados obtidos pelos dois métodos.

Para duas amostras distintas de biodiesel, determinou-se a precisão intradia e interdia, conforme pode ser visto na Tabela 2. Os resultados de precisão intra e interdia para a amostra 1 são 0,0150 ± 0,0003 e 0,014 ± 0,001, e para a amostra 2 são 0,0095 ± 0,0003 e 0,0096 ± 0,0001, respectivamente. Não houve, portanto, variação significativa dos resultados obtidos no mesmo dia e em dias diferentes, mostrando que o método enzimático colorimétrico é preciso na análise de glicerol livre em amostras de biodiesel.

A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos de recuperação em amostras de biodiesel fortificadas com valores conhecidos de glicerol. Observa-se nesta tabela bons resultados de recuperação, variando de 105 a 108%, sendo possível concluir que o procedimento de extração do glicerol livre proposto em trabalhos anteriores pode ser utilizado como método padrão na quantificação de glicerol livre em amostras de biodiesel.^2,17

A Tabela 4 apresenta os valores médios obtidos de glicerol total junto com o desvio padrão das amostras, assim como os valores obtidos por CG, a recuperação do método e o erro relativo da amostra.

Os resultados do teor de glicerol total determinado pelo método enzimático colorimétrico apresentaram recuperação na faixa de 80 a 119% e um baixo erro relativo em relação ao valor obtido por CG. Quanto à homogeneidade dos resultados de glicerol total quantificado pelos métodos cromatográfico e colorimétrico, verificou-se que o valor calculado de F (1,35) é menor que o valor de F crítico (3,18) considerando 95% de confiança, podendo-se concluir que as variâncias dos dois métodos são iguais. Deste modo, foi realizado um segundo cálculo para o valor de t (bilateral) para os dois métodos, presumindo-se variâncias iguais. Pelos resultados, foi verificado que o valor de t calculado (0,889) é menor que o de t crítico (2,101) considerando 95% de confiança, podendo-se afirmar que as médias para os dois métodos são equivalentes entre si. Ou seja, o método proposto neste trabalho pode ser usado na determinação de glicerol total em amostras de biodiesel, pois apresenta resultados equivalentes ao método padrão (CG).

Na Figura 5 é possível ver a correlação entre os resultados obtidos pelos métodos: enzimático colorimétrico e CG, apresentados na Tabela 4. O coeficiente angular da reta foi de 0,8304 e o valor obtido de coeficiente de correlação linear foi de 0,9645, mostrando uma razoável correlação entre os resultados obtidos pelos dois métodos.

Também para a análise de glicerol total, determinou-se a precisão intradia e interdia, conforme apresentado na Tabela 5. Os resultados de precisão intradia e interdias para a amostra 1 são 0,28 ± 0,01 e 0,29 ± 0,01, e para a amostra 2 são 0,138 ± 0,008 e 0,134 ± 0,007, respectivamente. Não houve variação significativa dos resultados obtidos no mesmo dia e em dias diferentes, mostrando que o método enzimático colorimétrico envolvendo a reação de transesterificação também é preciso na análise de glicerol total em amostras de biodiesel.

A Tabela 6 apresenta os valores de recuperação de GT em uma amostra de biodiesel de soja fortificada com teor de triglicerídeo de 0,3% (m/m). Observa-se nesta tabela excelente recuperação com um valor médio de 101%.

CONCLUSÕES

O método enzimático colorimétrico utilizando-se kits comerciais para análise de triglicerídeos é simples, rápido e viável na determinação do teor de glicerol livre e total em amostras de biodiesel.

O método mostrou ser linear, apresenta comportamento homocedástico e valores de limites de detecção e de quantificação de 7,10 x 10^-6 e 2,10 x 10^-5% m/m, respectivamente, determinados pelo método experimental.

A análise de glicerol livre foi precedida de uma etapa de extração do glicerol em uma mistura de água:etanol e mostrou correlação de 98% com os resultados obtidos pela técnica de cromatografia a gás, além de boa precisão intradia e interdia e recuperações variando de 105 a 108%, quando amostras foram fortificadas com diferentes concentrações de glicerol.

A análise de glicerol total foi precedida de uma reação de transesterificação e de uma etapa de extração do glicerol livre e mostrou correlação de 83% com os resultados obtidos pela técnica de cromatografia a gás, além de boa precisão intradia e interdia e excelente recuperação (101%), quando uma amostra de biodiesel foi fortificada com óleo de soja.

AGRADECIMENTOS

Ao CENPES/PETROBRAS e CNPq pelo apoio financeiro e ao CNPq e CAPES pelas bolsas de pesquisa concedidas.

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Recebido em 11/4/11

Aceito em 20/9/11

Publicado na web em 6/12/11

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Abr 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  11 Abr 2011
• Aceito
  20 Set 2011