Fitoquímica e quimiossistemática de Euxylophora paraensis (Rutaceae)

Phytochemical and chemosystematic studies of Euxylophora paraensis (Rutaceae)

Euxylophora paraensis; Rutaceae; chemosystematics

ARTIGO

Fitoquímica e quimiossistemática de Euxylophora paraensis (Rutaceae)^#

Phytochemical and chemosystematic studies of Euxylophora paraensis (Rutaceae)

Marsele Machado Isidoro^I; Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva^I,*; João Batista Fernandes^I; Paulo Cezar Vieira^I; Alberto C. Arruda^II; Sebastião da Cruz Silva^II

^IDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13565-905 São Carlos - SP, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Federal do Pará, 66075-900 Belém - PA, Brasil

ABSTRACT

Phytochemical studies of the leaves and stem have led to the identification of the known coumarins isooxypeucedanin, oxypeucedanin hydrate, xanthotoxin, isopimpinellin, 8-methoxymarmesin and marmesin, flavonoids quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside, myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside and hesperidin, alkaloids skimmianine and N-methylflindersine and limonoid limonin. The compounds isolated and the chemical profile of Euxylophora obtained from the literature clearly indicate its phytochemical affinities with other Rutoideae species.

Keywords:Euxylophora paraensis; Rutaceae; chemosystematics.

INTRODUÇÃO

A família Rutaceae constitui o maior grupo de plantas da ordem Sapindales, possuindo cerca de 160 gêneros, com 1900 espécies amplamente distribuídas nas regiões tropicais e temperadas do globo terrestre, sendo mais abundante na América tropical, sul da África e Austrália.^1,2 No Brasil existem cerca de 200 espécies já descritas.² As plantas desta família são muito conhecidas pela presença de uma ampla diversidade de metabólitos secundários, destacando-se os alcaloides, especialmente aqueles derivados do ácido antranílico, as cumarinas, as lignanas, os flavonoides e os limonoides.^1,3,4 Existem relatos de largo espectro de atividades biológicas associadas a estas classes de metabólitos.^1,3

O gênero Euxylophora é monotípico, apresentando somente a espécie Euxylophora paraensis de ocorrência no norte do Brasil.⁵ Ela é conhecida popularmente como pau-amarelo devido à cor de sua madeira, a qual é de excelente qualidade, encontrando aplicação na confecção de diversos móveis. Suas árvores de grande porte constam na lista de espécies da flora brasileira ameaçadas de extinção desde 1993.⁶ Segundo a literatura, foram isolados de E. paraensis somente alcaloides do tipo 2(1H)-quinolinona, 4(1H)-quinolinona,^7-9 indolopiridoquinazolínico e bis-2(1H)-quinolinona.^8-16 Estas substâncias resultaram do estudo químico da casca do caule e do cerne, não havendo, até o momento, citação sobre fitoquímica das folhas de E. paraensis. As cumarinas são de ocorrência ampla nos gêneros de Rutaceae, ou seja, são marcadores químicos da família. A ausência de citações destes compostos para este gênero despertou o interesse no estudo de outros órgãos na tentativa de se buscar as cumarinas. A análise preliminar via cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE-UV) de extratos das folhas de E. paraensis indicou a presença das cumarinas, o que levou ao presente estudo. Assim, este trabalho relata o primeiro estudo químico das folhas de E. paraensis que levou ao isolamento das cumarinas iso-oxipeucedanina, oxipeucedanina hidratada, xantotoxina, isopimpenilina, dos flavonoides quercetina-3- O-a-L-ramnopiranosídeo, miricetina-3-O-a-L-ramnopiranosídeo e hesperidina e do alcaloide esquimmianina. O caule foi reestudado, mas foram analisadas somente as frações que em análise de RMN ¹H mostraram a presença de substâncias não isoladas anteriormente. Duas cumarinas 8-metóxi-marmesina e marmesina, o limonoide limonina e o alcaloide N-metilflindersina foram isolados do caule. Exceto N-metilflindersina, as demais substâncias estão sendo relatadas pela primeira vez no gênero.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN ¹H e ¹³C (uni e bidimensionais) foram obtidos em espectrômetro Bruker DRX 400 MHz, utilizando-se CDCl₃, CD₃OD e DMSO como solventes e TMS como padrão interno. As separações cromatográficas foram realizadas em colunas utilizando-se gel de sílica 60, 70-230, 230-400 mesh e Sephadex LH-20. As separações por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram realizadas em coluna semipreparativa C-18 Phonomenex^® Luna (h x d_c = 250 x 4,6 mm; 10 µm), utilizando equipamento Shimadzu LC-8A com válvula de reciclo, injetor Rheodyne 7123 com loop de 500 µL e detector UV/VIS Shimadzu SPD-6AV. Os fracionamentos por cromatografia líquida de média pressão (CLMP) foram realizados em equipamento Amersham bioscience P-900 equipado com bomba binária, loop de 500 µL, coletor automático de 7 mL por fração com fluxo de 10 mL min^-1 e detector UV/VIS. As análises cromatográficas em camada fina foram realizadas em cromatoplacas de sílica gel F-254 sobre placa de alumínio Merck, de 0,2 mm de espessura, empregando-se como revelador a solução ácida de vanilina (5 g de vanilina em 9 mL de metanol, 0.5 mL de H₂SO₄ e 3 gotas de ácido acético).

Material vegetal

As folhas de E. paraensis foram coletadas e identificadas pelo Prof. Dr. A. C. Arruda, do Departamento de Química da Universidade Federal do Pará, no dia 05/04/2005 na Fazenda Paulo Maria no Município de Marituba (PA). A exsicata do espécime coletado encontra-se depositada no herbário da EMBRAPA Amazônia Oriental, sob o número 181030.

Preparação dos extratos

As folhas (1,3 kg) e caule (1,0 kg) de E. paraensis foram submetidas à secagem em estufa de ar circulante a 40 ºC, por aproximadamente 48 h e pulverizadas em moinho; a extração foi feita com etanol em temperatura ambiente e em repouso, durante 5 dias. Após este período, o solvente foi evaporado em evaporadores rotativos, obtendo-se o extrato bruto.

Isolamento das substâncias de E. paraensis

O extrato etanólico das folhas foi fracionado através de uma partição líquido-líquido gerando 4 extratos: hexânico, diclorometânico, acetato de etila e metanol. Para o estudo do extrato hexânico foi utilizada cromatografia em coluna (h x d_c = 45,0 x 4,0 cm) de gel de sílica (230-400 mesh) e eluída em gradiente com hexano, hexano/AcOEt 9:1, hexano/AcOEt 1:1, AcOEt e MeOH em eluição gradiente, fornecendo 42 subfrações. As subfrações de 1-10 continham em mistura os esteroides sitosterol, estigmasterol e campesterol, os quais foram identificados por CG-EM. Das subfrações agrupadas 11-24 (128 mg) foi isolada a substância 3 (11,1 mg) através de refracionamento em Sephadex LH-20 com eluição em CH₂Cl₂:MeOH (1:1). As demais frações foram analisadas por RMN ¹H (200 MHz) e indicaram a presença de hidrocarbonetos e ácidos graxos, os quais não eram de interesse quimiossistemático, com isto não foram estudadas.

O extrato diclorometânico das folhas foi submetido à cromatografia em coluna de gel de sílica (70-230 mesh) e uma pequena camada de florisil (h x d_c = 60,0 x 5,0 cm), utilizando-se como eluente hexano/diclorometano/acetona/metanol, levando a 13 frações obtidas após reunião daquelas que mostraram R_f similares em cromatoplacas de sílica gel (CCD). A análise destas por RMN ¹H (200 MHz) mostrou que somente em 3 delas havia substâncias de interesse quimiossistemático, sendo estas definidas como frações 1-3. A fração 1 foi submetida à cromatografia líquida de média pressão (CLMP) utilizando coluna preparativa Gemini C-18 (h x d_c = 250 x 21 mm; 10 µm). Após eluição gradiente com H₂O/CH₃CN (5-100% B), 56 subfrações de 7 mL foram coletadas e reunidas após análise por CCD. Esse procedimento resultou no isolamento das substâncias 1 (21 mg) e 2 (11,2 mg), coletadas nos frascos 18 e 21, respectivamente.

O refracionamento da fração 2 foi feito em coluna Sephadex LH-20 eluída com MeOH/CH₂Cl₂ 7:3, levando a outras subfrações. As subfrações 11 e 12 continham o composto 8 puro, e as subfrações 16-19 foram reunidas em uma única fração que foi reanalisada posteriormente via CLAE semipreparativa. Foi utilizada uma coluna C-18 Phonomenex^® Luna (h x d_c = 250 x 4,6 mm; 10 µm) e eluição com MeOH/CH₂Cl₂ (7:3), fornecendo a substância 4 (5,9 mg).

O extrato hidroalcoólico foi submetido à cromatografia em coluna de vidro (h x d_c = 50,0 x 4,5 cm), tendo como fase estacionária Sephadex LH-20 e eluição isocrática (MeOH 100%). Com a reunião das frações semelhantes foram obtidas 16, sendo que a fração 7 continha o composto 7 (43,4 mg) puro. O refracionamento de uma segunda fração através de CLMP, utilizando coluna preparativa Gemini C-18 (h x d_c = 250 x 21 mm; 10 µm) e eluição gradiente com H₂O/MeOH (5-100% B) levou a 51 subfrações de 7 mL, onde as subfrações 16 e 17 corresponderam aos compostos 5 (10,3 mg) e 6 (12,6 mg), respectivamente. As demais frações foram analisadas por RMN ¹H (200 MHz), o que indicou a presença de carboidratos, os quais não eram de interesse quimiossistemático e, por isto, não foram estudadas.

O extrato etanólico (2,7 g) do caule foi submetido à cromatografia em coluna de vidro (h x d_c = 50,0 x 4,5 cm), tendo como fase estacionária Sephadex LH-20 e eluição isocrática (MeOH 100%). Com a reunião das frações semelhantes, foram obtidas 18 frações. A análise destas por RMN ¹H (200 MHz) mostrou que somente em 3 delas havia substâncias de interesse quimiossistemático, sendo estas definidas como frações 1-3. A fração 1 foi submetida à cromatografia em coluna de vidro (h x d_c = 25,0 x 3,5 cm), tendo como fase estacionária gel de sílica (230-400 mesh) e usando hexano/diclorometano/acetona/metanol em eluição gradiente, chegou-se a 6 subfrações obtidas após reunião daquelas que mostraram R_f similares em CCD. O refracionamento da subfração 5 em cromatografia em camada delgada preparativa em placa de vidro (sílica gel, h = 25,0 x 25,0 cm), eluída com acetona/hexano 4:6 forneceu os compostos 9 (1,6 mg) e 10 (2,2 mg). A fração 2 também foi submetida à cromatografia sob as mesmas condições da fração 1, obtendo-se uma subfração a qual foi recromatografada, utilizando-se Sephadex LH-20 em coluna de vidro (h x d_c = 25,0 x 3,5 cm), fornecendo 6 subfrações obtidas após reunião daquelas que mostraram R_f similares em CCD. Somente a subfração 5 foi reestudada por CLAE semipreparativa, utilizando uma coluna C-18 Phenomenex^® Luna (h x d_c = 250 x 4,6 mm; 10 µm) e eluição com MeOH/CH₂Cl₂ (7:3), fornecendo a substância 11 (50,1 mg). A fração 3 foi submetida à cromatografia líquida de média pressão (CLMP), utilizando coluna preparativa Gemini C-18 (h x d_c = 250 x 21 mm; 10 µm), gradiente H₂O/CH₃CN (5-100% B), detector UV (365, 254 e 217 nm), loop de 2,5 mL e vazão 10,0 mL/min. Após a eluição foram obtidas 34 subfrações de 14 mL e a subfração 14 continha 20,6 mg da substância 12. As demais frações não foram estudas, pois não continham substâncias de interesse quimiossistemático.

Xantotoxina (1)

Sólido branco. RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃), δ_H (mult., J em Hz, H): 7,75 (d, 9,5, H-4), 7,68 (d, 2,5, H-2'), 7,34 (s, H-5), 6,80 (d, 2,5, H-3'), 6,35 (d, 9,5, H-3), 4,28 (s, 8-OCH₃). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 160,3 (C-2), 147,8 (C-7), 146,6 (C-2'), 144,2 (C-4), 146,6 (C-2'), 143,1 (C-8a), 132,9 (C-8), 126,1 (C-6), 116,5 (C-4a), 114,8 (C-3), 112,9 (C-5), 61,3 (8-OCH₃).

Isopimpenilina (2)

Sólido branco. RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃), δ_H (mult., J em Hz, H): 8,11 (d, 9,3, H-4), 7,61 (d, 2,5, H-2'), 6,99 (d, 2,5, H-5), 6,28 (d, 9,3, H-3'), 4,16 (s, 5-OCH₃), 4,16 (s, 8-OCH₃). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 160,5 (C-2), 150,0 (C-7), 145,2 (C-2'), 144,3 (C-5), 145,2 (C-2'), 143,7 (C-8a), 139,4 (C-4), 128,3 (C-8), 114,8 (C-6), 107,7 (C-4a), 112,9 (C-3), 105,1 (C-3'), 60,8 (8-OCH₃), 61,7 (5-OCH₃).

Iso-oxipeucedanina (3)

Sólido branco. RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃), δ_H (mult., J em Hz, H): 8,33 (dd, 9,6 e 0,6, H-4), 7,61 (d, 2,4, H-2'), 7,21 (dd, 0,8 e 0,6, H-8), 6,84 (dd, 2,4 e 0,8, H-3'), 6,35 (d, 9,6, H-3), 5,08 (s, H-1''), 2,87 (m, H-3''), 1,19 (d, 6,8, H-4''), 1,19 (d, 6,8, H-5''). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 161,0 (C-2), 158,0 (C-7), 145,5 (C-2'), 147,0, (C-5), 145,5 (C-2'), 152,0 (C-8a), 139,1 (C-4), 95,1 (C-8), 114,0 (C-6), 108,0 (C-4a), 113,3 (C-3), 104,1 (C-3'), 75,0 (C-1''), 209,0 (C-2''), 37,4 (C-3''), 17,9 (C-4''), 29,5 (C-5'').

Oxipeucedanina hidratada (4)

Sólido branco. RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃), δ_H (mult., J em Hz, H): 8,18 (dd, 9,6 e 0,8, H-4), 7,61 (d, 2,5, H-2'), 7,19 (dd, 0,8 e 0,6, H-8), 6,99 (dd, 2,5 e 0,6, H-3'), 6,31 (d, 9,5, H-3), 4,45 (dd, 10,0 e 3,0 2''a), 4,45 (dd, 10,0 e 3,0 2''b), 3,91 (m, H-3''), 2,81 (sl, OH-3''), 1,31 (s, H-5''), (s, H-6''). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 160,8 (C-2), 157,7 (C-7), 145,5 (C-2'), 148,9 (C-5), 145,5 (C-2'), 153,7 (C-8a), 139,1 (C-4), 95,1 (C-8), 113,5 (C-6), 107,8 (C-4a), 113,3 (C-3), 104,1 (C-3'), 74,8 (C-2''), 72,1 (C-3''), 76,9 (C-4''), 24,6 (C-5''), 26,2 (C-6'').

Quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (5)

Sólido amarelo. RMN ¹H (400 MHz, CD₃OD), δ_H (mult., J em Hz, H): 7,34 (d; H-2'), 7,31 (dd, 8,0 e 2,0, H-6'), 6,91 (d, 8,0, H-5'), 6,37 (d, 2,0, H-8), 6,20 (d, H-6), 5,34 (d, 1,8, H-1''), 4,22 (dd, 3,2 e 1,8, H-2''), 3,74 (dd, 9,4 e 3,2, H-3''), 3,41 (m, H-5''), 3,33 (m, H-4''), 0,94 (d, 5,6, H-6''). RMN ¹³C (50 MHz, CD₃OD) δ_C: 179,5 (C-4), 165,8 (C-7), 163,2 (C-5), 158,9 (C-2), 159,0 (C-9), 149,8 (C-4'), 146,2 (C-3'), 136,0 (C-3), 122,1 (C-1'), 123,0 (C-6'), 116,5 (C-2'), 116,4 (C-5'), 105,9 (C-10), 103,5 (C-1''), 99,8 (C-6), 94,7 (C-8), 73,0 (C-4''), 72,2 (C-3''), 71,2 (C-2''), 71,8 (C-5''), 17,9 (C-6'').

Miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (6)

RMN ¹H (CD₃OD), δ_H (mult., J em Hz, H): δ 0,94 (3H, d, 5,6, H-6''), 3,33 (t, 9,2, H-4''), 3,51 (m, H-5''), 3,78 (dd, 9,2 e 3,2, H-3''), 4,21 (dd, 3,2 e 1,8, H-2"′), 5,31 (d, 2,0, H-1'' ), 6,20 (d, 2,0, H-6), 6,42 (d, 2,0, H-8), 6,95 (2H, s, H-2', H-6' ); RMN ¹³C (50 MHz, CD₃OD) δ_C: 17,8 (C-6''), 71,8 (C-2''), 72,0 (C-5''), 72,2 (C-3''), 72,3 (C-4''), 94,9 (C-8), 100,0 (C-6), 103,8 (C-1''), 106,0 (C-10), 108,5 (C-6'), 109,7 (C-2'), 122,1 (C-1'), 136,5 (C-3), 138,1 (C-4'), 147,0 (C-3' ,C-5' ), 158.7 (C-9), 159,6 (C-2), 163,4 (C-5), 166,3 (C-7), 159,6 (C-2), 179,8 (C-4).

Hesperidina (7)

Sólido amorfo amarelado, RMN ¹H (400 MHz, DMSO-d₆) δ_H (mult., J em Hz, H): 5,38 (dd, 3,0 e 12,6, H-2), 2,72 (dd, 3,0 e 14,0, H-3eq), 3,14 (dd, 14,0 e 12,6, H-3ax), 6,05 (sl, H-6), 6,91 (sl, H-8), 6,95 (m, H-2', H-5', H-6'), 4,50 (s, H-1"'), 4,98 (d, 8,1, H-1"), 3,09-3,90 (H-2"-H-5"'), 0,96 (d, 6,0, H-6"), 12,00 (s, 5-OH), 3,86 (s, 4'-OCH₃). RMN ¹³C (50 MHz, DMSO-d₆) δ_C: 78,8 (C-2), 42,3 (C-3), 197,4 (C-4), 165,4 (C-5), 96,8 (C-6), 163,3 (C-7), 95,9 (C-8), 162,8 (C-9), 103,6 (C-10), 131,0 (C-1'), 114,2 (C-2'), 146,1 (C-3'), 148,0 (C-4'), 112,0 (C-5'), 118,0 (C-6'), 100,9 (C-1"), 73,3 (C-2"), 76,6 (C-3"), 69,9 (C-4"), 75,7 (C-5"), 66,4 (C-6"), 99,8 (C-1"'), 70,6 (C-2"'), 71,1 (C-3"'), 72,5 (C-4"'), 68,7 (C-5"'), 18,2 (C-6"'), 56,0 (4'-OCH₃).

Esquimmianina (8)

RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ_H (mult., J em Hz, H): 8,03 (d, 9,4, H-5), 7,24 (d, 9,4, H-6), 7,59 (d, H-2'), 7,05 (d, 2,8, H-3'), 4,44 (s, 4-OCH₃), 4,04 (s, 7-OCH₃), 4,12 (s, 8-OCH₃).

Marmesina (9)

RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ_H (mult., J em Hz, H): 7,60 (d, 9,4, H-4), 6,22 (d, 9,4, H-3), 6,75 (s, H-8), 7,22 (sl, H-5), 4,74 (dd, 9,2 e 8,5, H-2'), 3,22 (ddd, 14,8, 8,5 e 1,0, H-3'a), 3,20 (ddd, 14,8, 9,2 e 1,0, H-3'b), 1,38 (3H, s, H-2''), 1,24 (3H, s, H-3''). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 161,1 (C-2), 163,3 (C-7), 91,1 (C-2'), 123,4 (C-5), 29,5 (C-3'), 155,7 (C-8a), 139,4 (C-4), 97,9 (C-8), 125,0 (C-6), 113,7 (C-4a), 112,3 (C-3), 71,6 (C-1''), 26,2 (C-2''), 24,2 (C-3'').

8-Metóxi-marmesina (10)

RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ_H (mult., J em Hz, H): 7,58 (d, 9,5, H-4), 6,22 (d, 9,5, H-3), 6,96 (sl, H-5), 4,78 (dd, 9,2 e 8,5, H-2'), 3,25 (ddd, 14,8, 8,5 e 1,0, H-3'a), 3,20 (ddd, 14,8, 9,2 e 1,0, H-3'b), 1,39 (3H, s, H-2''), 1,25 (3H, s, H-3''), 4,06 (3H, s, 8-OCH₃). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 161,0 (C-2), 154,4 (C-7), 91,5 (C-2'), 117,2 (C-5), 29,9 (C-3'), 147,5 (C-8a), 143,5 (C-4), 132,0 (C-8), 125,9 (C-6), 113,7 (C-4a), 112,5 (C-3), 71,6 (C-1''), 26,0 (C-2''), 24,4 (C-3''), 61,0 (8-OCH₃).

N-Metilflindersina (11)

RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ_H (mult., J em Hz, H): 7,97 (dd, 8,4 e 2,0, H-5), 7,23 (ddd, 8,6, 6,8 e 2,0, H-6), 7,55 (ddd, 8,4, 6,8 e 1,6, H-7), 7,32 (dl, H-8), 6,76 (d, 9,9, H-4'), 5,54 (d, 9,9, H-3'), 1,52 (2H, s, 2'(CH₃), 3,70 (3H, s, N-CH₃). RMN ¹³C (50 MHz, CDCl₃) δ_C: 161,0 (C-2), 106,2 (C-3), 155,0 (C-4), 116,2 (C-5a), 123,0 (C-5), 122,0 (C-6), 131,0 (C-7), 114,0 (C-8), 139,5 (C-8a), 117,9 (C-4'), 125,5 (C-3'), 78,8 (C-2'), 29,2 (2'(CH₃)), 28,2 (N-CH₃).

Limonina (12)

Sólido branco, RMN ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ_H (mult., J em Hz, H): δ 4,04 (sl, H-1), 2,68 (dd, 16,8 e 1,9, H-2a), 2,98 (dd, 16,8 e 3,8, H-2b), 2,23 (dd, 15,8 e 3,2, H-5), 2,86 (dd,15,8 e 14,5, H-6 ax), 2,47 (dd, 14,5 e 3,2 H-6 eq), 2,55 (dd, 12,2 e 2,8, H-9), 1,78 (m, H-11a), 1,90 (m, H-11b), 1,84 (m, H-12 ax), 1,51 (m, H-12 eq), 4,04 (s, H-15), 5,47 (s, H-17), 1,18 (3H, s, H-18), 4,47 (d,13,0, H-19a), 4,77 (dd , 13,0 e 0,6 H-19b), 7,42 (tl, H-21), 6,34 (dd, 1,7 e 0,7, H-22), 7,40 (tl, H-23), 1,30 (3H, s, H-28), 1.19 (3H, s, H-29), 1,30 (3H, s, H-30). RMN ¹³C (CDCl₃) δ_C: 79,2 (C-1), 35,7 (C-2), 169,1 (C-3), 80,4 (C-4), 60,7 (C-5), 36,5 (C-6), 206,1 (C-7), 51,4 (C-8), 48,2 (C-9), 46,0 (C-10), 19,0 (C-11), 30,9 (C-12), 38,0 (C-13), 65,7 (C-14), 53,9 (C-15), 166,0 (C-16), 77,9 (C-17), 20,8 (C-18), 65,4 (C-19), 120,0 (C-20), 141,2 (C-21), 109,7 (C-22), 143,3 (C-23), 30,2 (C-28), 21,5 (C-29), 17,7 (C-30).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo fitoquímico dos extratos das folhas de E. paraensis levou ao isolamento de quatro cumarinas (1-4), três flavonoides (5-7) e o alcaloide esquimmianina (8) (Figura 1).

As substâncias 1-4 apresentaram no espectro de RMN ¹H (solvente: CDCl₃) um par de dubletos (J 9,5 Hz) localizados entre d 6,1-6,4 e 7,5-8,3, sugerindo a presença de um esqueleto cumarínico, sendo estes sinais característicos dos hidrogênios H-3 e H-4, respectivamente.¹⁷ Também foi observada para estas substâncias a presença de um anel furano α,β-substituído, sendo facilmente reconhecido através de um par de dubletos (J = 2,5 Hz) em d 7,6 e 6,8, atribuídos a H-2' e H-3', respectivamente. O sinal deste último hidrogênio é observado como um duplo dubleto (J = 2,4 e 0,8) quando C-8 se encontra hidrogenado, devido a um acoplamento a longa distância (⁵J) deste com H-3' e isto foi observado para as substâncias 3 e 4. A substância 1 apresentou, além dos sinais relatados acima, um singleto em d 7,34 e outro em d 4,28, sendo este último característico do grupo metoxila. A substância 2 apresentou um singleto em d 4,16 (6H) atribuído a duas metoxilas. Os substituintes presentes em C-5 das substâncias 3 e 4 foram determinados através das correlações observadas nos mapas de contorno de HSQC e HMBC, que estão representadas na Figura 2.

Os espectros de RMN ¹³C destas cumarinas apresentaram sinais característicos para o esqueleto furanocumarínico: δ 160,3-161,0 (C-2); δ 112,9-114,8 (C-3); δ 139,1-144,2 (C-4); δ 145,0-146,6 (C-2'); δ 104,1-106,7 (C-3'). O conjunto de dados acima e a comparação com a literatura permitiram a identificação das cumarinas xantotoxina (1),¹⁸ isopimpinilina (2),¹⁹ iso-oxipeucedanina (3) e oxipeucedanina hidratada (4).^18,20 A cumarina 3 foi isolada do extrato hexânico e as demais (1, 2, 4) do extrato diclorometânico.

A configuração do carbono quiral da unidade prenila do composto 4 foi considerada R baseando-se no valor de rotação específica obtida ([α]_D²⁵ = + 21) e comparação deste com aquele citado na literatura para esta mesma substância ([α]_D²⁵ = + 8), a qual além de ser denominada oxipeucedanina hidratada é também conhecida como prangol.²¹ Definir a configuração deste carbono baseando-se na rotação específica obtida foi possível devido à molécula possuir somente este estereocentro.

O estudo do extrato hidroalcoólico forneceu os compostos 5, 6 e 7, sendo este o primeiro relato do isolamento de flavonoides nesta espécie. Os espectros de RMN ¹H de 5 e 6 apresentaram, na região de hidrogênios aromáticos, um par de dubletos em δ 6,20 e 6,37 (J = 2,0 Hz), característico de sistema de acoplamento AB, correspondente a dois hidrogênios meta-posicionados e atribuídos, respectivamente, a H-6 e H-8 do anel A de um flavonoide. A diferença observada nos espectros destas substâncias está relacionada ao anel B, que apresenta para 5 um sistema de substituição nas posições 3' e 4', sugerido pelos sinais em δ 7,34 (d, J = 2,0 Hz), 7,31 (dd, J = 8,0 e 2,0 Hz) e 6,91 (d, J = 8,0 Hz), atribuídos aos hidrogênios H-2', H-6' e H-5', respectivamente; para 6 foi observado apenas um singleto em d 6,95 relativo a dois hidrogênios, característico dos hidrogênios H-2' e H-6' do anel B de uma flavona. A presença de sinais entre δ 3,3 e δ 4,2 nos espectros de RMN ¹H de 5 e 6 indicou que as duas substâncias se tratavam de flavonoides glicosilados. Esta afirmação pode ser confirmada pelos sinais em δ 4,21 (dd, J = 3,2 e 1,8 Hz), 3,78 (dd, J = 9,2 e 3,2 Hz), 3,37 (m, 2H) e pelo dubleto em δ 0,90 (J = 5,6 Hz), este último sendo característico do grupo metila da ramnose e, assim, o sinal em δ 5,50 (sl) foi atribuído ao hidrogênio anomérico (H-1'') da molécula de açúcar. A estereoquímica do carbono anomérico da ramnose e a posição na qual o açúcar está ligado à aglicona foi determinada pela constante de acoplamento de H-1'' e por comparação com os dados da literatura,^22,23 sendo possível identificar a substância quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (5) e miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (6).²³

O padrão de substituição no anel A do flavonoide 7 foi definido como 5,7-dioxigenado pela presença de dois singletos largos em d 6,05 (H-6) e 6,91 (H-8), no espectro de RMN ¹H, formando um sistema de acoplamento AB. Para o anel B foi observado um multipleto entre δ 6,75-6,95 atribuído aos hidrogênios H-2', H-5' e H-6', sugerindo anel B 3'-hidróxi-4'-metoxilado ou 4'-hidróxi-3'-metoxilado. O sinal do grupo metoxila foi observado em δ 3,86 (3H). Esta substância foi definida como flavanona devido à presença dos sinais de hidrogênios alifáticos d 3,14 (dd, J = 14,0 e 12,6 Hz), 2,72 (dd, J = 14,0 e 3,0 Hz) e d 5,38 (dd, J = 12,6 e 3,0 Hz), que foram atribuídos aos hidrogênios H-3pseudoax, H-3pseudoeq e H-2 do anel C, respectivamente. A presença de sinais na região δ 3,09-3,86 indicou a presença de unidades de açúcar na estrutura proposta. Esta afirmação pode ser confirmada pelos sinais em δ 4,98 (d, J = 8,1 Hz) e 4,50 (s) e pelo dubleto em δ 0,96 (J = 6,0 Hz, 3H), este último sendo característico do grupo metila da ramnose. Estes dados sugeriram a presença do substituinte O-β-D-rutinosil e permitiram atribuir os sinais em δ 4,98 e 4,50 aos hidrogênios anoméricos H-1" e H-1"'. A comparação dos deslocamentos químicos de RMN ¹H e ¹³C desta flavanona isolada com os dados descritos na literatura para a hesperidina mostrou que o flavonoide 7 referia-se a esta substância (3',5-di-hidróxi-4'-metoxiflavanona-7-O-β-[L-ramnopiranosil(α1→6)]-D-glucopiranosídeo, ou hesperetina-7-O-β-[L-ramnopiranosil(α1→6)]-D-glucopiranosídeo).²⁴

Somente um alcaloide foi isolado das folhas e este foi obtido do extrato diclorometânico. Seu espectro de RMN ¹H apresentou dois dubletos em δ 7,59 e 7,05, de hidrogênios furânicos, característicos dos alcaloides furoquinolínicos, e um par de dubletos em δ 8,03 e 7,24 com J = 9,4 Hz, atribuídos a H-5 e H-6, respectivamente. A presença de três sinais de metoxilas, em δ 4,44, 4,04 e 4,12 e a comparação com dados da literatura permitiu identificar esta substância como sendo a esquimmianina (8).²⁵

O estudo fitoquímico do extrato etanólico do caule de E. paraensis levou ao isolamento de duas cumarinas (9 e 10), do alcaloide N-metilflindersina (11) e do limonoide limonina (12) (Figura 1). As cumarinas 9 e 10 apresentam em seus espectros de RMN ¹H os sinais característicos do esqueleto cumarínico com a presença do anel di-hidrofurano, o qual foi evidenciado pelos sinais em δ 4,78 (dd, 9,3 e 8,5 Hz, H-2'), 3,25 (ddd, 14,8, 8,5 e 1,3 Hz, H-3'a) e 3,20 (ddd, 14,8, 9,3 e 0,9 Hz, H-3'b). Ainda no espectro de RMN ¹H foi possível observar sinais que caracterizam um grupo hidróxi-isopropila. Esses sinais apresentaram-se como singletos em δ 1,39 (3H, s) e 1,25 (3H, s). No espectro da cumarina 9 foram observados dois singletos em δ 6,75 (1H, s) e 7,22 (1H, sl) atribuídos, respectivamente, aos H-8 e H-5, sugerindo a presença da marmesina.²⁶ Para a segunda cumarina foram observados dois singletos, um em δ 4,06 (3H, s) relativo a um grupo metoxila posicionado em C-8, e o outro em δ 6,96 atribuído ao H-5, permitindo identificar a 8-metóxi-marmesina (10).²⁶ A confirmação destas estruturas foi obtida através de comparação de seus dados de RMN de ¹³C com aqueles citados na literatura para a marmesina (9) e seu derivado 8-metóxi-marmesina (10).²⁶

O espectro de RMN ¹H da substância 11 mostrou sinais característicos de anel aromático orto-dissubstituído, d 7,97 (1H, J = 8,4 e 2,0 Hz), 7,23 (1H, J = 8,4; 6,8 e 1,6 Hz), 7,55 (1H, J = 8,6; 6,8 e 2,0 Hz), 7,32 (1H, J = 8,6; 1,6 Hz), atribuídos aos H-5-H-8, respectivamente. O espectro de RMN ¹³C mostrou sinal característico de lactama em d 161,0, indicando a presença de alcaloide 2(1H)-quinolin-2-ona. A ausência de sinais para H-3 e H-4 de um alcaloide 2(1H)-quinolin-2-ona e a presença de sinais típicos do anel 2,2-dimetilcromeno (um singleto integrando para 6 hidrogênios em δ 1,52 referente a duas metilas geminais e dois dubletos em δ 5,54 e 6,76 com J = 10,0 Hz referente a hidrogênios olefinicos), permitiram identificar este alcaloide como a N-metilflindersina (11).²⁷

Os espectros de RMN ¹H e ¹³C da substância 12 mostraram sinais característicos do anel furano β-substituído, δ_H 7,42 (J = 0,7 Hz, H-21), 7,40 (J = 1,7 Hz, H-23), 6,34 (J = 1,7 e 0,7 Hz, H-22), δ_C 120,0 (C-20), 141,2 (C-21), 109,7 (C-22) e 143,3 (C-23). O espectro de RMN ¹H ainda mostrou quatro singletos intensos com integração para três hidrogênios em δ 1,18 (Me-18), 1,30 (Me-28), 1,19 (Me-29) e 1,07 (Me-30) referentes a grupos metila ligados a carbono sp³ e atribuídos com o auxílio dos mapas de correlações HSQC e HMBC. A presença de sinais em d 4,77 (dd, J = 13,0 e 0,6 Hz), 4,47 (d, J = 13,0 Hz) e 4,04 (sl), atribuídos aos hidrogênios geminais do C-19 e H-1, respectivamente, sugeriram tratar-se de um limonoide com o anel A-seco. A comparação dos dados de RMN ¹H e ¹³C com aqueles da literatura para a limonina permitiu confirmar a estrutura deste limonoide para a substância 12.²⁸

Segundo o sistema de classificação de Engler (1931) o gênero Euxylophora encontra-se classificado na subfamília Rutoideae, tribo Cusparieae.²⁹ As classes de alcaloides mais abundantes em Rutaceae são aquelas derivadas do ácido antranílico. Entre estas, 2 (1H)-quinolinonas, furoquinolinos, di-hidropiranoquinolinos, furo-4-quinolinonas, di-hidropirano-4-quinolinonas e pirano-2-quinolinonas seriam os que caracterizam a família como um todo. Outra classe que também caracteriza a família são as furanocumarinas. Em morfologia botânica considera-se como gênero típico aquele que possui o maior número de característica da família. Podem-se classificar estes alcaloides e as furanocumarinas como os grupos típicos de Rutaceae, pois são raros os gêneros em que eles ainda não foram citados.^1,4 As furanocumarinas lineares isoladas nas folhas de E. paraensis são citadas em gêneros de todas as grandes subfamílias de Rutaceae,^3,4 ou seja, confirmando que Euxylophora possui a maioria das características químicas das Rutaceae. Considerando o perfil químico de Euxylophora, este pode ser considerado um gênero típico de Rutaceae, pois como citado na introdução as cascas do caule e o cerne de sua única espécie possuem os alcaloides típicos da família.^7-16 Estes trabalhos citam nos estudos com o cerne o isolamento de alcaloides simples do ácido antranílico (Figura 3) como 1-metil-4-(2,3-di-hidróxi-3-metilbutan-1-oxil)-2(1H)-quinolin-2-ona (13), furoquinolino (esquimmianina, 8), piranoquinolino (N-metilflindersina, 11), 1,2',2'-trimetil-3',4'-di-hidro,4'-hidróxi-pirano[3,2-c]quinolin-2-ona (14), 1,2',2',3'-tetrametil-2',3'-di-hidrofuro[2,3-b]quinolin-4-ona (lemobilina, 15), 3-(1,2-dimetil-2-hidróxipropil)-4-hidróxi-1-metilquinolin-2(1H)-ona (16), 2',3',3'-trimetil-2',3'-di-hidrofuro[3,2-c]quinolin-2-ona (17), N-metil-2',3',3'-trimetil-2',3'-di-hidrofuro[3,2-c]quinolin-2-ona (18).^7-9,15 Nos compostos 15 e 16 o rearranjo de Claisen anormal parece ter ocorrido na sua formação, e 15 foi encontrado também em Flindersia ifflaiana, mostrando uma afinidade entre Euxylophora e este gênero, o qual pertence a outra subfamília, Flindersioideae.³⁰

Alguns gêneros de Rutaceae sintetizam alcaloides bis-2(1H)-quinolinona, estes em geral se formam por uma reação de cicloadição de Diels-Alder entre as unidades prenilas. Alguns destes dímeros foram isolados de Vepris louisii, Oricia renieri, E. paraensis e Ptelea trifoliata.³⁰ Paraensidimerinas A (19), B (24), C (20), D (25), E (21), F (22), G (23) isolados do cerne de E. paraensis são exemplos da ocorrência da reação de Diels-Alder nestes dímeros.^8,9,15,16Vepris, Oricia e Ptelea são classificados em Toddalioideae.

O maior número de alcaloides isolados da casca do tronco de Euxylophora é derivado do ácido antranílico e triptofano, os β-indolo-quinazolinos: 1-hidróxi-7,8-di-hidro-β-indolo-quinazolino (26), euxylophoricinas A (29), B (33), C (27), D (31), E (35), F (28), euxylophorinas A (30), B (34), C (32), D (36) e paraensine (37).^10-14 Os alcaloides β-indolo-quinazolinos segundo pesquisa recente foram isolados em três gêneros de Rutoideae, Zanthoxylum, Euodia e Euxylophora, e três de Toddalioideae, Vepris, Araliopsis e Hortia.³⁰ Portanto, Euxylophora também mostra afinidade com gêneros da subfamília Toddalioideae, mais uma vez confirmando ser típico de Rutaceae. Dados micro e macromoleculares vêm sugerindo a união destas duas subfamílias, Rutoideae e Toddalioideae.^31,32

Os flavonoides são geralmente encontrados em muitas, se não em todas, as plantas de Angiosperma,³⁰ principalmente os glicosilados, portanto de pouco valor quimiossistemático na confirmação da classificação de um táxon. Contudo, os flavonoides de Rutaceae são tri-, tetra- e polioxigenados, uma exceção entre as demais angiospermas. As Rutaceae foram estudadas visando principalmente a busca de alcaloides, sendo em geral desprezadas as frações ricas em flavonoides. Recentemente estes compostos vêm sendo isolados em vários gêneros da tribo Cusparieae. Neoraputia e Conchocarpus são dois exemplos de gêneros ricos em flavonoides.^30,33-35 A flavona 6 é pentaoxigenada, assim, também sugerindo afinidade de E. paraensis com os demais gêneros de Cusparieae.

AGRADECIMENTOS

À Capes, CNPq (INCT, 573742/2008-1) e FAPESP (INCT, 08/57859-5) pelas bolsas e apoios financeiros concedidos.

Recebido em 27/4/12; aceito em 28/8/12; publicado na web em 28/9/12

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Artigo em homenagem ao Prof. Otto R. Gottlieb (31/8/1920-19/6/2011)

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Nov 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  27 Abr 2012
• Aceito
  28 Ago 2012