Metabólitos secundários dos nudibrânquios Tambja stegosauriformis, Hypselodoris lajensis e Okenia zoobotryon e dos briozoários Zoobotryon verticillatum e Bugula dentata da costa do Brasil

Secondary metabolites from nudibranchs Tambja stegosauriformis, Hypselodoris lajenis and Okenia zoobotryon and from bryozoans Zoobotryon verticillatum and Bugula dentata from the Brazilian coastline

nudibranch; bryozoan; Tambja

ARTIGO

Metabólitos secundários dos nudibrânquios Tambja stegosauriformis, Hypselodoris lajensis e Okenia zoobotryon e dos briozoários Zoobotryon verticillatum e Bugula dentata da costa do Brasil^#

Secondary metabolites from nudibranchs Tambja stegosauriformis, Hypselodoris lajenis and Okenia zoobotryon and from bryozoans Zoobotryon verticillatum and Bugula dentata from the Brazilian coastline

Fábio R. Pereira^I; Roberto G. S. Berlinck^I,*; Edson Rodrigues Filho^II; Katyuscya Veloso^II; Antonio G. Ferreira^II; Vinicius Padula^III

^IInstituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, CP 780, 13560-970 São Carlos - SP, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, CP 676, 13560-970 São Carlos - SP, Brasil

^IIIZoologische Staatssammlung München, Mollusca Sektion, Münchhausenstr. 21, 81247, München, Germany

ABSTRACT

The chemical investigation of the MeOH extract from the bryozoan B. dentata MeOH yielded tambjamines A (1), C (3), D (4), K (6), aldehyde 8 and the new tambjamine J1(9), while the extract of its predator, the nudibranch Tambja stegosauriformis, yielded tambjamines C and K, along with aldehyde 8. Furodisinin lactone (11) was isolated from the nudibranch Hypselodoris lajensis, a compound previously isolated from Dysidea sponges. The alkaloid 2,5,6-tribromo-N-methylgramine (12) was isolated from the nudibranch Okenia zoobotryon and from its prey, the bryozoan Zoobotryon verticillatum, the only source of 12 previously known.

Keywords: nudibranch; bryozoan; Tambja.

INTRODUÇÃO

Moluscos nudibrânquios são predadores de esponjas, ascídias, briozoários, octocorais e outros moluscos.¹ Suas presas produzem ou acumulam substâncias que muitas vezes apresentam atividades biológicas. Nudibrânquios terminam por adquirir e acumular estas substâncias para sua própria defesa. Além disso, diversas espécies de nudibrânquios possuem a capacidade de biossintetizar produtos naturais de novo.^2,3 Tais metabólitos secundários isolados de nudibrânquios apresentam diversas atividades biológicas, tais como antitumoral,⁴ antimicrobiana,⁵ antifúngica⁶ e citotóxica,^7,8 associadas à ação defensiva destes produtos naturais.

Nudibrânquios do gênero Tambja apresentam tambjaminas, que são alcaloides pirrólicos já isolados de bactérias e outros invertebrados marinhos, como briozoários e ascídias.^9,10 As tambjaminas parecem estar relacionadas com o mecanismo de defesa química de nudibrânquios do gênero Tambja.¹¹ Uma série de derivados sintéticos de tambjaminas foi avaliada quanto à sua atividade antimicrobiana e, também, sua citotoxicidade frente a linhagens de células tumorais tou potente atividade antifúngica contra Malassezia furfurde antiproliferativa não seletiva contra células de câncer e células normais humanas. Em particular, as tambjaminas I e J apresentaram efeito indutor de apoptose.¹²

Previamente realizamos a investigação química do nudibrânquio Tambja sp. (equivocadamente identificado como Tambja eliora), coletado em São Sebastião - SP,¹³ do qual foram isoladas as tambjaminas A (1) e D (4). Os efeitos citotóxicos e genotóxicos da tambjamina D foram analisados em uma linhagem de células de fibroblastos pulmonares de uma espécie de hamster. A substância apresentou atividade citotóxica frente a esta linhagem (V79), com IC₅₀ de 1,2 mg/mL.¹⁴ Todavia, a espécie Tambja stegosauriformis ainda não havia sido objeto de estudo químico.

Hypselodoris lajensis (Troncoso, García e Urgorri, 1998) é um nudibrânquio membro da família Chromodorididae, um grupo de semática, tipicamente uma estratégia de defesa.¹⁵ Estudo químicos realizados Hypselodoristerpenos como defesa química.^16,17 Como exemplo, a furodisinina foi isolada a partir do nudibrânquio Hypselodoris zebra (Heilprin, 1889) e da esponja marinha Dysidea etheria (De Laubenfels, 1936), da qual o molusco se alimenta. O nudibrânquio Hypselodoris lajensis também não havia sido objeto de investigação química.

Zoobotryon verticillatum (Delle Chiaje, 1828) é um briozoário considerado cosmopolita e potencialmente invasor¹⁸ conhecido por conter alcaloides bromados, como a 2,5,6-tribromo-N-metilgramina,¹⁹ que é uma substância de defesa do animal.¹⁹ O nudibrânquio Okenia zoobotryon (Smallwood, 1910) encontra-se comumente associado à Zoobotryon verticillatum, vivendo, se alimentando e até se reproduzindo sobre o briozoário.¹⁸ Porém, ainda não haviam sido realizados estudos químicos com O. zoobotryon de forma a verificar se o nudibrânquio captura ou não substâncias de Z. verticillatum.

O objetivo principal deste trabalho foi verificar se os moluscos Tambja stegosauriformis, Hypselodoris lajensis e Okenia zoobotryon capturavam e acumulavam substâncias de suas presas, o briozoário Bugula dentata, a esponja Dysidea sp.²⁰ e o briozoário Zoobotryon verticillatumtabólitos presentes nas presas são assimilados no seu conjunto por seus predadores. Os resultados deste trabalho permitiram estabelecer as respostas para tais hipóteses. Este é o primeiro trabalho químico focado em espécies de nudibrânquios da costa brasileira e o primeiro a investigar quimicamente as espécies aqui estudadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Investigação química dos extratos do nudibrânquio Tambja stegosauriformis e do briozoário Bugula dentata

O extrato MeOH do nudibrânquio T. stegosauriformis foi submetido à separação por CLAE em fase reversa C₁₈. As frações resultantes da cromatografia foram analisadas por CLAE-UV-EM. As tambjaminas apresentam espectros no ultravioleta característicos, com uma banda intensa entre 390 e 410 nm, em decorrência ao cromóforo bispirrólico.²¹ Dependendo dos substituintes no sistema bispirrólico, este cromóforo pode apresentar ligeiras variações dos comprimentos de onda nos máximos de absorção. Por exemplo, no caso das tambjaminas A (1) e B (2) (Figura 1), nas quais o grupo enamina não apresenta substituintes, os máximos de absorção (λ_max) das duas bandas do espectro no UV situam-se entre 250-255 e em 385 nm. Já no caso de outras tambjaminas, que apresentam o grupo enamina substituído com diferentes grupos alquila, os máximos de absorção destas duas bandas situam-se acima de 255 nm e acima de 398 nm. Além disso, diversas tambjaminas apresentam átomos de bromo em sua estrutura, o que pode auxiliar a análise de seus espectros de massas.²²

A análise dos dados de UV-EM das frações do extrato MeOH de T. stegosauriformis indicou a presença das tambjaminas C (3) e K (6) (Figura 1), além dos aldeídos formados pela hidrólise das tambjaminas A (1) e B (2), o 4-metóxi-2,2'-bipirrol-5-carboxaldeído (7) e 5'-bromo-4-metóxi-2,2'-bipirrol-5-carboxaldeído (8) (Figura 1), respectivamente. Adicionalmente, observou-se a presença de uma substância exibindo no seu espectro de massas a presença de um átomo de bromo, devido à presença de dois íons [M+H]⁺ em m/z 324 e 326, com aproximadamente a mesma intensidade. Os dados observados nas análises por CLAE-UV-EM poderiam indicar a presença ou da tambjamina D (4) ou da tambjamina I (5) (Figura 1), uma vez que estas substâncias são isoméricas. A análise dos dados de RMN de ¹H obtidos para esta fração indicou que se tratava da tambjamina D (4). A principal diferença entre os espectros de RMN de ¹H das tambjaminas D e I está nos deslocamentos químicos dos hidrogênios ligados aos carbonos dos anéis pirrólicos. Observou-se no espectro de RMN de ¹H da substância analisada sinais em d 7,02; 6,71 e 6,34, concordando dados da literatura que mostram estes sinais em d 7,00; 6,64 e 6,33 para a tambjamina D,²¹ enquanto que para a tambjamina I os hidrogênios pirrólicos aparecem em d 6,55; 6,15 e 5,86.²³ A identificação das substâncias 3, 4, 6-8 foi realizada por comparação dos dados obtidos nas análises por CLAE-UV-EM com informações dos bancos de dados MarinLit e Scifinder e, também, de seus espectros de RMN de ¹H com dados da literatura. Considerando-se a pouca massa das frações obtidas, em decorrência de limitado volume de material disponível para investigação, não foi possível isolar as substâncias puras em quantidades suficientes para realizar sua análise completa por RMN mono e bidimensional. Todavia, a análise dos espectros de massas obtidos por fragmentações de íons precursores (EM/EM) das frações isoladas de T. stegosauriformis indicou que as estruturas analisadas seguem um padrão de fragmentação que é condizente com as características estruturais das tambjaminas. No caso da tambjamina D (4), a identidade desta pôde ser inequivocamente estabelecida por comparação de seus espectro de RMN de ¹H com dados da literatura, que concordam com os dados da tambjamina D, mas não com os dados da tambjamina I (5).²³ No que se refere à tambjamina K, sua identificação foi realizada a partir das análises dos dados obtidos por CLAE-UV-EM e por EM/EM, já que não foi possível a obtenção de um espectro de RMN de ¹H de boa qualidade, devido à quantidade de massa disponível da fração. Subsequentemente, a investigação química do extrato do briozoário Bugula dentata levou ao isolamento das tambjaminas A (1), C (3), D (4), K (6) e J1 (9) em quantidades suficientes para a obtenção de seus dados espectroscópicos e comparação dos alcaloides isolados a partir de T. stegosauriformis com aqueles isolados de B. dentata por CLAE-UV-EM.

A análise da tambjamina C (3) por EM/EM possibilitou propor uma rota de fragmentação para esta substância (Figura 2 e Esquema 1). Utilizaram-se dados de fragmentação do íon precursor m/z 246, dutos de m/z 246 contém íons com m/z pares (oriundos da eliminação de grupos neutros não nitrogenados), sendo alguns deles rapidamente associados à eliminação de formaldeído (30 Da), indicando a presença do grupo metóxi (por exemplo, m/z 216). A presença do grupo isobutilamina é constatada pela eliminação de isobutano (C₄ H₁₀, 58 Da) a partir do precursor m/z 246, levando ao pico base m/z 188, e pela eliminação de isobutileno (C₄H₈-radical [M+H-CH₃]^•+ (m/z 231) resultando no pico intenso em m/z 175. Outros íons originados possivelmente através de rearranjos mais complexos, acompanhados de eliminação de fragmentos típicos de substâncias nitrogenadas (por exemplo, HCN, NH₃, pirrol), também compõem o espectro e contribuem para um fingerprinting útil para o diagnóstico estrutural desses alcaloides. Este padrão de fragmentação também foi observado nos espectros de íons obtidos dos íons precursores relativos às outras tambjaminas identificadas neste trabalho (Material Suplementar). Este é o primeiro estudo de fragmentação realizado com tambjaminas e o primeiro estudo químico realizado com Tambja stegosauriformis, espécie conhecida apenas para o Brasil e recentemente descrita.²⁴

O extrato MeOH do briozoário Bugula dentata foi fracionado e analisado por CLAE-UV-EM. Observações de campo indicaram que este briozoário é uma presa de T. stegosauriformis e de Tambja sp. (previamente identificada erroneamente como T. eliora¹³). Diferentes tambjaminas foram isoladas de B. dentata da Austrália.²⁵ O processo de fracionamento e purificação do extrato de Bugula dentata levou ao isolamento das tambjaminas A (1), C (3), D (4), K (6), do 5'-bromo-4-metóxi-2,2'-bipirrol-5-carboxaldeído (8) (aldeído da tambjamina B) e de uma nova tambjamina (9), isomérica da tambjamina J (10). Todos os alcaloides bromopirrólicos isolados a partir de B. dentata foram identificados pela análise de seus dados espectroscópicos e por comparação com dados da literatura.^21,23,25 O alcaloide 9 apresentou, no espectro de massas obtido nas análises por LC-UV-EM (modo ESI⁺), dois sinais de mesma intensidade em m/z 338 e 340 indicando a presença de um átomo de bromo em sua estrutura. A desreplicação com informações obtidas nos bancos de dados MarinLit e SciFinder utilizando dados de UV e de massas para 9 inicialmente levaram à tambjamina J (10), originalmente isolado de Bugula dentata coletado na Tasmânia.²⁵ Os dados de RMN de ¹H e ¹³C obtidos para 9 foram comparados com os dados de 10.²⁵ Observou-se uma discrepância dos valores de deslocamento químico dos hidrogênios bis-pirrólicos de 9 com os de 10-pirrólicos e a diferenciação destes é clara e evidente por RMN de ¹H. Em CDCl₃ o sistema bis-pirrólico substituído com bromo na posição 1, presente na tambjamina D (4) e no aldeído da tamjamina B (8), apresenta deslocamentos químicos em d 6,89-7,00 (H-1), 6,33 (H-2) e 6,64-6,74 (H-6). Já o sistema bis-pirrólico substituído com bromo na posição 3, observado nas tambjaminas G (11), I (5) e J (10), apresenta deslocamentos químicos em d 6,09-6,23 (H-2), 6,40-6,63 (H-3) e 5,90-5,97 (H-6).^13,23,25 Como em CDCl₃ a substância 9 apresentou deslocamentos químicos em d 6,66; 6,34 e 7,01 para os hidrogênios bis-pirrólicos, e deslocamentos químicos idênticos aos observados para a cadeia lateral da tambjamina J (10) (dados não incluídos), tais resultados indicam que a substância isolada de B. dentata apresenta a estrutura 9, inédita na literatura. As atribuições observadas para os ¹H e ¹³C do sistema bis-pirrólico da substância 9 (Tabela 1) puderam ser confirmadas pela análise dos espectros HMQC e HMBC (Figura 3). A estereoquímica Z da ligação enamina das tambjaminas pode ser determinada em se observando efeito nOe entre o hidrogênio do carbono C-9 e o grupo metileno CH₂-1' da cadeia ligada ao nitrogênio, mas não entre CH₂-1' e os hidrogênios do grupo metoxila.²⁶ Desta forma, mica do grupo enamina na tambjamina J1 (9), utilizando a tambjamina C (3) como "controle". Para ambos os casos, observamos correlação no espectro NOESY entre o dublete do hidrogênio H-9 (~ d 7,28, CDCl₃) e o triplete dos hidrogênios CH₂-1' (~ d 3,29), mas não entre estes últimos e os hidrogênios da metoxila em d 3,94. Sendo assim, a estereoquímica do grupo enamina da tambjamina J1 (9) também é Z.

Desta forma, o estudo químico do nudibrânquio T. stegosauriformis e do briozoário predado por este molusco, Bugula dentata, levou ao isolamento de uma série de tambjaminas, dentre as quais a tambjamina J1 (9), inédita na literatura.

Investigação química do extrato do nudibrânquio Hypselodoris lajensis

O fracionamento do extrato EtOH do nudibrânquio Hypselodoris lajensis resultou no isolamento da lactona da furodisinina (12) (Figura 4), uma substância originalmente isolada da esponja Dysidea etheria. 27 Este sesquiterpeno teve sua estrutura elucidada após a análise dos dados espectroscópicos (RMN 1H, 13C, COSY, HSQC e HMBC) e a comparação destes com dados da literatura.26 Recentemente, a lactona da furodisinina foi isolada a partir do extrato hexânico da

esponja marinha Dysidea sp.20 (provavelmente D. etheria). Tal resultado indica que o nudibrânquio possivelmente captura a substância 12 da esponja Dysidea sp., que constitui sua presa. Este é o primeiro trabalho que mostra o isolamento da lactona da furodisinina a partir de um nudibrânquio.

Investigação química dos extratos do nudibrânquio Okenia zoobotryon e do briozoário Zoobotryon verticillatum

O fracionamento do extrato metanólico do nudibrânquio O. zoobotryon levou ao isolamento da 2,5,6-tribromo-N-metilgramina (13)¹⁹ (Figura 4). Esta foi identificada pela análise dos seus espectros de RMN de ¹H e massas, e por comparação com dados da literatura.

Como foi observado que O. zoobotryonzoário Zoobotryon verticillatum, espécimens do briozoário também foram coletados e extraídos com EtOH e MeOH. O fracionamento cromatográfico do extrato MeOH do briozoário forneceu a mesma substância 2,5,6-tribromo-Nmens de O. zoobotryon. Frações contendo a mesma substância isolada do molusco e do briozoário foram analisadas por CLAE-UV-EM, comparando-se seus espectros de massas, o tempo de retenção e, também, seus espectros de RMN de ¹H.

A substância 13 já havia sido anteriormente isolada do briozoário Z. verticillatum.¹⁹tre O. zoobotryon e Z. verticillatum, e que o nudibrânquio se alimenta deste briozoário,¹⁸ este é o primeiro estudo que apresenta o isolamento do derivado indólico tribromado 13 a partir do nudibrânquio O. zoobotryon e de sua presa, indicando que este molusco realmente assimila e armazena esta substância a partir de Z.verticillatum.

CONCLUSÃO

O estudo dos extratos de três espécies de nudibrânquios, T. stegosauriformis, H. lajensis e O. zoobotryon, levou ao isolamento de metabólitos secundários também encontrados em suas presas: o briozoário Bugula dentata, a esponja Dysidea sp. e o briozoário Z. verticillatum, respectivamente. A composição de tambjaminas observada em T. stegosauriformis (predador) e B. dentata (presa) apresenta variações, sendo que o briozoário (presa) apresenta uma maior variedade de alcaloides do que o molusco (predador). Dentre os alcaloides isolados de B. dentata, a tambjamina J1 (9) é inédita na literatura. Já os estudos dos nudibrânquios H. lajensis e O. zoobotryon indicaram que a composição química de seus extratos é constituída pela mesma substância principal encontrada em suas presas. Os resultados sugerem que as mesmas substâncias majoritárias isoladas, tanto das presas como dos predadores, podem exercer funções similares nos moluscos e nos invertebrados sésseis.

Esta é a primeira investigação com foco em nudibrânquios da costa brasileira. Além disso, é a primeira investigação química destas espécies de nudibrânquios e das espécies de briozoários coletadas no Brasil. Os resultados indicam a importância na descoberta de metabólitos secundários que tomam parte em relações entre presa e predador, envolvendo nudibrânquios e outros invertebrados marinhos pouco conhecidos no Brasil.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo pdf, com acesso livre.

PARTE EXPERIMENTAL

Generalidades

Os espectros de RMN foram obtidos a 25 ºC, utilizando-se TMS como padrão interno, em um aparelho Bruker ARX 9.4 Tesla operando em 400.35 MHz (¹H) e 100.10 MHz (¹³C). As análises por CLAE-UV-EM foram realizados em um equipamento Waters Alliance 2695 acoplado on-linedos (PDA) Waters 2996 e um detector de espectrometria de massas Micromass ZQ2000, utilizando ionização por eletrospray, no qual foram obtidos os espectros de massas de baixa resolução. Os espectros de massas EM/EM foram obtidos em um aparelho CLAE-UVESI-EM/EM, com resolução cromatográfica em um sistema Alliance 2695 (Waters), detecção por arranjo de diodos PDA 2996 (Waters) e acoplado a um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo, modelo Micromass QuattroLC (Manchester, U.K), equipado com uma fonte de íons API Z-spray e uma sonda para ionização electrospray em alto fluxo. A ionização foi feita no modo positivo. As resoluções cromatográficas foram realizadas em uma coluna Waters Spherisorb ODS2 (125 mm × 4.0 mm d.i., 5 µm); fluxo: 0,8 mL min^-1; λ_max detecção, 215-600 nm. O gradiente de eluição utilizado foi (A = H₂O, B = MeCN, C = MeOH): 60% A + 15% B + 25% C até 40% A + 15% B + 45% C em 8 min, então 30% A + 15% B + 55% C em 15 min. No final, a coluna foi lavada com 100% C por 2 min, e então recondicionada com 70% A + 10% B + 20% C por 4,5 min, em um fluxo de 0.9 mL min^-1. Um divisor de fluxo pós-coluna foi utilizado para enviar apenas 0,25 mL min^-1 do efluente da coluna para a fonte de ionização. Nitrogênio foi utilizado como gás nebulizador (34 L/h) e de dessolvatação (834 L/h). O capilar da sonda de ESI foi mantido em uma voltagem de 3,57 kV, com os cones de amostragem e de extração em 46 e 4 V, respectivamente. Argônio foi utilizado nos experimentos de fragmentação e os íons precursores foram acelerados usando-se uma rampa de energia de colisão de 5-35 eV. Foram utilizados solventes de grau analítico (P.A.) para a extração e cromatografia em coluna de baixa pressão flash. Foram utilizados solventes de grau cromatográfico (CLAE) e água MilliQ em separações semipreparativas por cromatografia líquida, utilizando-se um equipamento Waters de bomba quaternária 600 e detector de duplo feixe UV 2487.

Estudo químico do nudibrânquio Tambja stegosauriformis

Espécimes do nudibrânquio Tambja stegosauriformisvíduos, com 5 a 7 cm de comprimento) foram coletados na Ilha do Papagaio, em Cabo Frio, RJ, Brasil e preservados em EtOH. Um exemplar de referência foi depositado no Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZSP 97621). O processo de extração foi realizado da seguinte forma: após separação do EtOH de preservação, os animais foram transferidos para 40 mL de EtOH. Os animais em EtOH foram sonicados em banho de ultrassom por 2 min e deixados em repouso por mais 30 min. Removeu-se o EtOH e adicionaram-se mais 40 mL do mesmo solvente, repetindo-se esta operação mais uma vez. Após a extração, todo o EtOH de preservação e de extração, foi evaporado resultando no extrato etanólico do nudibrânquio. Os animais foram re-extraídos com MeOH (3 x 40 mL). Os extratos metanólico e etanólico foram reunidos e concentrados até um volume de 300 mL. A suspensão alcoólica assim obtida foi particionada com hexano. Após evaporação das frações polar e apolar obtiveram-se os extratos brutos metanólico (Tsme, 361,3 mg) e hexânico (Tshx, 143,0 mg), os quais foram analisados por CLAE-UV-EM.

O extrato metanólico (Tsme, 361,3 mg) foi separado por CLAE [coluna Waters Deltapak C₁₈, de 300 x 7,8 mm; 15 µm; eluente: MeOH/H₂O 67:33 (0,05% TFA) ; fluxo: 1,2 mL/min; detecção: UV λ_max 254 nm], obtendo-se nove novas frações: Tsme-1 (102,9 mg), Tsme-2 (14,6 mg), Tsme-3 (1,5 mg), Tsme-4 (1,6 mg), Tsme-5 (1,2 mg), Tsme-6 (0,8 mg), Tsme-7 (2,3 mg), Tsme-8 (1,5 mg) e Tsmelav (7,2 mg). Todas as frações foram analisadas por CLAE-UV-EM [coluna: Waters XTerra EM C₁₈, de 2,1 x 50 mm; 3,5 µm; eluente: gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (0,1% TFA); fluxo: 0,5 mL/ min; UV: espectro obtido entre 200 e 600 nm; EM: ESI⁺, voltagem do cone = 20 V]. A fração Tsme-2 foi submetida à separação posterior por CLAE [coluna: Inertsil Phenyl (GL Sciences, Inc), de 250 x 4,6 mm; 5 µm; eluente: gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (0,1% TFA); fluxo: 1,0 mL/min; detecção: UV l_max 254 nm], obtendo-se quatro novas frações: Tsme-2b1 (2,7 mg), Tsme-2b2 (2,5 mg), Tsme2b3 (0,8 mg) e Tsme-2b4 (0,7 mg), as quais foram analisadas por CLAE-UV-EM nas mesmas condições citadas acima. As substâncias identificadas foram observadas nas seguintes frações: Tsme-2b1 (aldeído da tambjamina A (7), t_R = 5,8 min), Tsme-4 (tambjamina C (3), t_R = 2,02 min), Tsme-6 (tambjamina K (6), t_R = 1,39 min), Tsme-7 (tambjamina D (4), t_R = 5,12 min) e Tsme-8 (aldeído da tambjamina B (8), t_R = 5,2 min).

Tambjamina C (3)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 246; UV: λ_max 258 e 398 nm; RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz): 7,27 (d, 19,4 Hz, 1H, H-9), 7,09 (m, 1H, H-1), 6,75 (m, 1H, H-3), 6,28 (m, 1H, H-2), 5,98 (s, 1H, H-6), 3,93 (s, 3H, OMe), 3,28 (t, 6,4 Hz, 2H, CH₂-1'), 1,99 (m, 1H, H-2'), 1,00 (d, 6,7 Hz, 6H, CH₃-3' e CH₃-4').

Tambjamina D (4)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 324 e 326; UV: λ_max 256 e 399 nm; RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz): 7,40 (d, 15 Hz, 1H, H-9), 7,02 (m, 1H, H-1), 6,71 (d, 2,3 Hz, 1H, H-6), 6,34 (m, 1H, H-2), 3,97 (s, 3H, OMe), 3,30 (m, 2H, CH₂-1'), 2,01 (m, 1H, H-2'), 1,01 (d, 6,7 Hz, 6H, CH₃-3' e CH₃-4').

Tambjamina K (6) Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 260; UV: λ_max 258, 323 e 403 nm.

4-metóxi-2,2'-bipirrol-5-carboxaldeído (7)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 191; UV: λ_max 251 e 364 nm; RMN de ¹H (DMSO-d₆, 600 MHz): 11,4 (s, NH), 11,23 (s, NH), 9,28 (s, 1H, H-9), 6,89 (d, 1,4 Hz, 1H, H-1), 6,74 (m, 1H, H-3), 6,26 (d, 2,7 Hz, 1H, H-6), 6,10 (dd, 2,5 e 5,8 Hz, 1H, H-2), 3,82 (s, 3H, CH₃).

5'-bromo-4-metóxi-2,2'-bipirrol-5-carboxaldeído (8)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 269 e 271; UV: λ_max 247 e 359 nm; RMN de ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): 11,50 (s, NH), 11,28 (s, NH), 9,39 (s, 1H, H-9), 7,01 (t, 3Hz, 1H, H-1), 6,53 (d, 2,3 Hz, 1H, H-6), 6,28 (t, 2,7 Hz, 1H, H-2), 3,87 (s, 3H, CH₃).

Estudo químico do briozoário Bugula dentata

Colônias do briozoário (32 g, peso seco) foram coletadas em Cabo Frio-RJ, congeladas e liofilizadas. Um exemplar de referência foi mantido na coleção de referência de coletas do IQSC-USP (AC11BRY-01). A massa dos espécimes foi triturada em liquidificador com MeOH. O extrato foi filtrado através de celite sobre papel de filtro. Após a filtração, a massa triturada foi extraída mais 4 vezes com MeOH. Todo o MeOH filtrado (2 L) foi concentrado em evaporador rotativo até um volume de 300 mL. Adicionaram-se 30 mL de H₂O e realizou-se uma partição com hexano (4 x 300 mL). O extrato hexânico foi evaporado, seco e guardado.

O extrato MeOH obtido (2,6 g) foi submetido a uma cromatografia em coluna pré-empacotada de sílica gel derivatizada com grupos C₁₈. Utilizou-se um gradiente de MeOH e MeCN em H₂O (H₂O 100%, H₂O/MeOH 8:2, 7:3, 6:4, 1:1, 4:6, 3:7, 2:8, MeOH 100% e MeCN 100%) como eluente. As frações coletadas foram analisadas por CCD utilizando-se os reveladores ácido fosfomolíbdico e ninidrina, e reunidas de acordo com seu padrão cromatográfico. Foram obtidas dez frações: CF11BRI-2A (1,9 g), CF11BRI-2B (86,5 mg), CF11BRI-2C (36,5 mg), CF11BRI-2D (40,1 mg), CF11BRI-2E (54,2 mg), CF11BRI-2F (50,3 mg), CF11BRI-2G (27,0 mg), CF11BRI-2H (34,0 mg), CF11BRI-2I (78,2 mg) e CF11BRI-lav (126,7 mg). Todas estas frações foram analisadas por CLAE-UV-EM, utilizando-se uma coluna Inertsil ODS-SP, 5 µm, 4,6 x 250 mm, GL Sciences Inc., com um gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (0,1% TFA) como eluente [fluxo: 1,0 mL/min; detecção em λ_max entre 200 e 600 nm e por EM (modo ESI⁺, voltagem do cone = 20 V]. Este mesmo procedimento foi utilizado em todas as análises por CLAE-UV-EM de frações do extrato MeOH de Bugula dentata.

A fração CF11BRI-2G (27 mg) foi purificada por HPLC em coluna de fase reversa C₁₈, utilizando-se um gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (início com 40% de eluente orgânico; H₂O com 0,05% de TFA) em uma coluna semipreparativa de sílica gel derivatizada por grupos C₁₈ (CSC-Inertsil 150A/ODS2, 5 µm, 250 x 9,4 mm). Foram obtidas nove frações: CF11BRI-2G1 (2,6 mg), -2G2 (2,5 mg), -2G3 (1,3 mg), -2G4 (2,5 mg), -2G5 (2,4 mg), -2G6 (2,0 mg), -2G7 (2,4 mg), -2G8 (1,5 mg) e -2G9 (6,0 mg). As análises por CLAE-UV-EM indicaram que a fração CF11BRI-2G5 era constituída pelo aldeído da tambjamina B (8).

A fração CF11BRI-2H (34,6 mg) foi separada nas mesmas condições, fornecendo nove novas frações: CF11BRI-2H1 (3,2 mg), -2H2 (2,9 mg), -2H3 (1,0 mg), -2H4 (1,9 mg), -2H5 (4,0 mg), -2H6 (1,2 mg), -2H7 (2,0 mg), -2H8 (1,9 mg), -2H9 (2,5 mg) e -2H10 (9,8 mg). As tambjaminas A (1) e C (3) foram identificadas nas frações CF11BRI-2H2 e -2H5, respectivamente, a partir dos dados obtidos por CLAE-UV-EM e comparação de seus espectros de RMN de ¹H e ¹³C com dados da literatura.

A fração CF11BRI-2I foi separada por CLAE, nas mesmas condições citadas utilizadas para a separação da fração CF11BRI-2G, fornecendo as frações CF11BRI-2I1 (13,1 mg), -2I2 (8,4 mg), -2I3 (7,4 mg), -2I4 (8,3 mg), -2I5 (4,0 mg), -2I6 (10,0 mg), -2I7 (1,7 mg), e -2I8 (12,8 mg). A tambjamina D (4) foi identificada na fração -2I6 após comparação dos seus espectros de RMN de ¹H, ¹³C e massas de baixa resolução (modo ESI⁺) com dados da literatura. Na fração CF11BRI-2I7 foi identificada a tambjamina J1 (9) a partir da análise dos dados obtidos por CLAE-UV-EM e espectros de RMN mono e bidimensionais. Após análise por CLAE-UV-EM, a fração CF11BRI2I5 foi purificada por HPLC em fase reversa (coluna Inertsil ODS-SP, 5 µm, 4,6 x 250 mm, GL Sciences Inc.) utilizando-se MeOH/MeCN/ H₂O 3:2:5 como eluente em modo isocrático. Foram obtidas seis frações: CF11BRI-2I5a (0,7 mg), CF11BRI-2I5b (0,4 mg), CF11BRI2I5c (1,2 mg), CF11BRI-2I5d (0,4 mg), CF11BRI-2I5e (0,7 mg) e CF11BRI-2I5f (0,4 mg). A tambjamina K (6) foi identificada na fração CF11BRI-2I5c.

Tambjamina A (1)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 190; UV: λ_max 216, 250 e 392 nm; RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz): 7,52 (m, 1H, H-9), 7,13 (m, 1H, H-1), 6,82 (m, 1H, H-2), 6,32 (m, 1H, H-3), 5,98 (m, 1H, H-6), 3,96 (s, 3H, OMe).

Tambjamina C (3)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 246; UV: λ_max 217, 258 e 402 nm; RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz): 7,28 (d, 15 Hz, 1H, H-9), 7,10 (m, 1H, H-1), 6,76 (m, 1H, H-3), 6,29 (m, 1H, H-2), 5,98 (m, 1H, H-6), 3,94 (s, 3H, OMe), 3,29 (t, 6,4 Hz, 2H, CH₂-1'), 2,00 (m, 1H, H-2'), 1,01 (d, 6,7 Hz, 6H, CH₃-3' e CH₃-4').

Tambjamina D (4)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 324 e 326; UV: λ_max 256 e 397 nm; RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz): 7,40 (d, 15 Hz, 1H, H-9), 7,03 (m, 1H, H-1), 6,71 (d, 2,3 Hz, 1H, H-6), 6,35 (m, 1H, H-2), 3,97 (s, 3H, OMe), 3,31 (m, 2H, CH₂-1'), 2,01 (m, 1H, H-2'), 1,01 (d, 6,7 Hz, 6H, CH₃-3' e CH₃-4').

Tambjamina K (6)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 260; UV: λ_max 258, 323 e 403 nm; RMN de ¹H (CDCl₃, 400 MHz): 7,30 (d, 14,9 Hz, 1H, H-9), 7,09 (m, 1H, H-1), 6,75 (m, 1H, H-3), 6,29 (m, 1H, H-2), 5,98 (s, 1H, H-6), 3,94 (s, 3H, OMe), 3,49 (m, 2H, H-1'), 1,77 (m, 1H, H-3'), 1,63 (m, 2H, H-2'), 1,00 (d, 6,8 Hz, 3H, H-4') e 0,95 (d, 6,8 Hz, 3H, H-5').

5'-bromo-4-metóxi-2,2'-bipirrol-5-carboxaldeído (8)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 269 e 271; UV: λ_max 220 e 357 nm; RMN de ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): 11,50 (s, NH), 11,28 (s, NH), 9,39 (s, 1H, H-9), 7,01 (t, 3Hz, 1H, H-1), 6,53 (d, 2,3 Hz, 1H, H-6), 6,28 (t, 2,7 Hz, 1H, H-2), 3,87 (s, 3H, CH₃).

Tambjamina J1 (9)

Óleo esverdeado. EM-ESI⁺: m/z 338 e 340; UV: λ_max 219 e 398 nm; RMN de ¹H (DMSO-d₆, 600 MHz): 8,16 (d, 15 Hz, 1H, H-9), 7,20 (t, 3,1 Hz, 1H, H-1), 6,56 (d, 2,2 Hz, 1H, H-6), 6,41 (t, 2,4 Hz, 1H, H-2), 3,97 (s, 3H, OMe), 3,17 (m, 2H, H-1'), 1,24 (m, 3H, H-5'), 0,92 (m, 3H, H-4')

RMN de ¹³C (DMSO-d₆, 150 MHz): 162,6 (C-7), 145,1 (C-9), 138,0 (C-5), 123,7 (C-1), 119,6 (C-4), 113,5 (C-2), 109,5 (C-8), 98,5 (C-3), 93,7 (C-6), 58,6 (OMe), 48,5 (C-1'), 16,4 (C-5'), 10,9 (C-4').

Estudo químico do nudibrânquio Hypselodoris lajensis

Espécimes do nudibrânquio H. lajensis (3 indivíduos, com 3 a 5 cm de comprimento) foram coletados em Cabo Frio, RJ, Brasil e foram preservados em EtOH. A identificação do material foi feita por V. Padula, e exemplares de referência foram depositados no Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZSP 97467). O processo de extração foi realizado da seguinte forma: após separação do EtOH de preservação, os animais foram transferidos para 40 mL de EtOH. Os animais em EtOH foram sonicados em banho de ultrassom por 2 min, deixando-se em repouso por mais 30 min. Removeu-se o EtOH e adicionaram-se mais 40 mL do mesmo solvente, repetindo-se esta operação mais uma vez. Após a extração, todo o EtOH, de preservação e de extração foi reunido e evaporado, resultando no extrato etanólico (Hyet, 278,5 mg) do nudibrânquio. Os animais foram re-extraídos com MeOH (3 x 40 mL) e CH₂Cl₂ (3 x 40 mL). O extrato etanólico foi reunido com o extrato metanólico e este extrato alcoólico foi evaporado, obtendo-se o extrato alcoólico dos animais (HyMe, 12.8 mg). O extrato CH₂Cl₂ também foi evaporado, obtendo-se apenas 1,1 mg deste último.

O extrato alcoólico (Hyet, 278,5 mg) do animal foi submetido a uma separação por cromatografia em coluna pré-empacotada contendo sílica gel derivatizada com grupos C₁₈ como fase estacionária (10 g), utilizando-se um gradiente de MeOH e H₂O como eluente (H₂O 100%, H₂O/MeOH 8:2, 6:4, 4:6 e MeOH 100%). Após análises por CCD (CH₂Cl₂/MeOH 9:1 e 7:3 como eluentes e ácido fosfomolíbdico, ninidrina e Dragendorff como reveladores) das diversas frações obtidas, estas foram reunidas em cinco frações: Hyet-1 (253,1 mg), Hyet-2 (10,1 mg), Hyet-3 (4,6 mg), Hyet-4 (5,8 mg) e Hyet-5 (18,9 mg). Estas frações foram analisadas por CLAE-UV-EM [coluna: Waters XTerra EM C₁₈, de 2,1 x 50 mm; 3,5 µm; eluente: gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (0,1% TFA); fluxo: 0,5 mL/min; UV: espectro obtido entre 200 e 400 nm; EM: ESI⁺, voltagem do cone = 25 V].

A fração Hyet-4 foi submetida a uma purificação por CLAE [coluna: Synergi 4µ Fusion-RP 80 C₁₈ (Phenomenex), de 250 x 4,6 mm; 4 µm; eluente: MeOH/H₂O 6:4 (0,1% TFA) ; fluxo: 0,9 mL/min; detecção: UV λ_max 254 nm]. A fração obtida Hyet-4c (1,4 mg) foi identificada como sendo a lactona da furodisinina (12).

Lactona da furodisinina (12)

[α]_D²⁰= + 100 (c= 1,0 mg/mL, MeOH); EM-ESI⁺: m/z 249; ESIEM^-: m/z 247; UV: λ_max 226 nm; RMN de ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): 5,79 (s, H-2), 5,35 (d, 4,7 Hz, H-7), 2,68 (d, 8,5 Hz, H-6), 2,18 (dd, 13,2 e 3,5, H-5a), 1,91 (m, 2H, CH₂-9), 1,61 (m, H-11), 1,59 (m, H-10a), 1,58 (s, 3H, CH₃-15), 1,36, (d, 13,0 Hz, H-5b), 1,31 (s, 3H, CH₃-14), 1,16 (s, 3H, CH₃-13), 1,10 (m, H-10b).

Estudo químico do nudibrânquio Okenia zoobotryon

Espécimes do nudibrânquio O. zoobotryon (50 indivíduos, com aproximadamente 7 mm de comprimento cada) foram coletados em Cabo Frio, RJ, Brasil e preservados em EtOH. A identificação do material foi feita por V. Padula e exemplares de referência foram depositados no Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZSP 97093). O processo de extração para este animal foi realizado de maneira análoga ao procedimento utilizado na extração do H. lajensis, resultando nos extratos etanólico (OkEt, 230 mg), metanólico (OkMe, 12,8 mg) e diclorometano (OkDM, 1,1 mg), os quais foram analisados por CLAE-UV-EM.

O extrato OkEt foi submetido a uma separação por CLAE [coluna: CSC-Inertsil 150A/ODS-2 C₁₈, de 250 x 9,4 mm; 5 µm; eluente: MeOH/H₂O (0,1% TFA) 62:38; fluxo: 1,1 mL/min; detecção: UV λ_max 254 nm]. A separação forneceu oito frações: Oket-1 (117,5 mg), Oket-2 (11,0 mg), Oket-3 (1,6 mg), Oket-4 (1,0 mg), Oket-5 (1,3 mg), Oket-6 (1,8 mg), Oket-7 (1,1 mg) e Oket-lav (13,3 mg), que foram analisadas por CLAE-UV-EM [coluna: Waters XTerra EM C₁₈, de 2,1 x 50 mm; 3,5 µm; eluente: gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (0,1% TFA); fluxo: 0,5 mL/min; UV: espectro obtido entre 200 e 400 nm; EM: ESI⁺, voltagem do cone = 25 V].

As frações Oket-5, -6 e -7 foram reunidas devido à semelhança de seus perfis cromatográficos observados para estas amostras em CLAE-UV-EM. A fração Oket-5 (4,2 mg), foi submetida a uma purificação por CLAE [coluna: Inertsil Phenyl (GL Sciences, Inc), de 250 x 4,6 mm; 5 µm; eluente: MeOH/H₂O (0,1% TFA) 6:4; fluxo: 0,8 mL/min; detecção: UV λ_max 254 nm]. A fração Oket-5b (1,0 mg) foi identificada por CLAE-UV-EM e por RMN de ¹H como sendo a substância 2,5,6-tribromo-N-metilgramina (13).

2,5,6-tribromo-N-metilgramina (13)

EM-ESI⁺: m/z 422, 424, 426 e 428; UV: λ_max 230, 296 e 301 nm; RMN de ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,29 (s, H-4), 8,13 (s, H-7), 4,39 (s, 3H, CH₃-8), 3,81 (s, 2H, CH₂-9), 2,78 (s, 6H, (CH₃)₃-9).

Estudo químico do briozoário Zoobotryon verticillatum

Colônias do briozoário Z. verticillatum (17 g, peso úmido) foram coletadas em Cabo Frio, RJ, Brasil e preservadas em EtOH. Após remoção do EtOH de preservação, o briozoário foi re-extraído com 100 mL de MeOH em banho de ultrassom por 2 min, e deixado em repouso durante 1 h. Repetiu-se este procedimento mais duas vezes. A seguir, os 300 mL de MeOH utilizados na extração foram reunidos com o EtOH de preservação do animal e o solvente foi evaporado até redução do volume para aproximadamente 200 mL. A suspensão hidroalcoólica foi submetida a uma partição líquido-líquido com hexano (4 x 200 mL), resultando nos extratos metanólico (Zvme, 1,15 g) e hexânico (Zvhx, 93,7 mg).

O extrato Zvme foi submetido a uma separação por cromatografia em coluna pré-empacotada contendo sílica gel derivatizada com grupos C₁₈ como fase estacionária (10 g) e utilizando-se um gradiente de MeOH em H₂O como eluente (H₂O 100%, H₂O/MeOH 8:2, 6:4, 4:6 e MeOH 100%). Análises por CCD (CH₂Cl₂/MeOH 9:1 e 7:3 como eluentes; ácido fosfomolíbdico, ninidrina e Dragendorff como reveladores) das diversas frações obtidas permitiram que fossem reunidas em seis novas frações: Zvme-1 (930 mg), Zvme-2 (14,3 mg), Zvme-3 (8,0 mg), Zvme-4 (3,8 mg), Zvme-5 (42,3 mg) e Zvme-6 (52,2 mg), as quais foram analisadas por CLAE-UV-EM [coluna: Waters XTerra C₁₈, de 2,1 x 50 mm; 3,5 µm; eluente: gradiente de MeOH/MeCN 1:1 em H₂O (0,1% TFA); fluxo: 0,5 mL/min; UV: espectro obtido entre 200 e 400 nm; EM: ESI⁺, voltagem do cone = 25 V].

Após a análise por CLAE-UV-EM, a fração Zvme-5 foi submetida a uma purificação por CLAE [coluna: Waters Phenyl µBondapak, de 300 x 3,9 mm; 10 µm; eluente: gradiente de MeOH em H₂O (0,1% TFA) ; fluxo: 1,0 mL/min; detecção: UV λ_max 254 nm] obtendo-se cinco novas frações, Zvme-5a (5,4 mg), Zvme-5b (2,5 mg), Zvme5c (18,3 mg), Zvme-5d (18 mg) e Zvme-5e (2,3 mg). Estas frações foram novamente analisadas em sistema CLAE-UV-EM, nas mesmas condições citadas acima.

A fração Zvme-5b foi submetida a uma nova purificação por CLAE (coluna: Waters Symmetry C₁₈, de 75 x 4,6 mm; 3,5 µm; eluente: MeOH/H₂O 57:43 (0,1% TFA); fluxo: 0,7 mL/min; detecção: UV λ_max 254 nm), obtendo-se o alcaloide 2,3,5-tribromo-N-metilgramina (13) na fração Zvme-5b2 (1,7 mg).

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq-Brasil) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro, esta última através de projetos temáticos (2005/60175-2 e 2010/50190-2) no âmbito do programa BIOTA/BIOprospecTA, bem como ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) e CNPq, pelas autorizações de coleta (SISBIO 26142-1) e acesso ao patrimônio genético (010553/2011-8). Agradecemos também a C. A. Cunha (CaboFrioSub) pela ajuda na coleta de exemplares de O. zoobotryon. V. Padula é bolsista de doutorado no exterior do CNPq-Brasil e DAAD (German Academic Exchange Service).

Recebido em 14/12/11; aceito em 19/7/12; publicado na web em 28/9/12

Material Suplementar

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Figura 39S - Clique para ampliar

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Artigo em homenagem ao Prof. Otto R. Gottlieb (31/8/1920-19/6/2011)

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Dez 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  14 Dez 2011
• Aceito
  19 Jul 2012