Síntese e controle de qualidade da ureia enriquecida em 13C para diagnóstico da Helicobacterpylori (HP)

Synthesis and quality control of 13C-enriched urea for Helicobacter pylori (HP) diagnosis

stable isotope; reactor; enriched compounds

ARTIGO

Síntese e controle de qualidade da ureia enriquecida em ¹³C para diagnóstico da Helicobacterpylori (HP)

Synthesis and quality control of ¹³C-enriched urea for Helicobacter pylori (HP) diagnosis

Carlos R. Sant Ana Filho; Claudinéia R. O. Tavares; André V. Ferreira; Clelber V. Prestes; José A. Bendassolli^*

Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, CP 96, 13400-970 Piracicaba - SP, Brasil

ABSTRACT

The aim of the study was to synthesize the urea (¹³CO(NH₂)₂), with 99% ¹³C atoms, and to perform a quality analysis for the diagnosis (breath test) of Helicobacter pylori. Furthermore, the process was submitted to economic analysis. The reaction was performed in a stainless steel reactor, lined with polytetrafluoroethylene, under low pressure and temperature. The synthesis method was shown to be appropriate (2.35 g; 81.9% yield), evidenced by physico-chemical and microbiological results, according to Brazilian legislation. The production and diagnosis costs were competitive compared with national and international market values, rendering this a valuable tool in clinical medicine.

Keywords: stable isotope; reactor; enriched compounds.

INTRODUÇÃO

A infecção crônica proporcionada pelo Helicobacter pylori (HP) tem alta prevalência em todo o mundo, sendo a principal causa de gastrites crônicas e úlceras pépticas, além de ser fator de risco para o câncer gástrico, considerado o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo.¹ A prevalência dessa infecção varia entre países desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo menor nos primeiros. Porém, independentemente da região, as diferenças parecem estar em função da condição socioeconômica da população.²

O diagnóstico da infecção pelo HP tem sido, com maior frequência, realizado a partir da análise de fragmentos de biópsia, obtidos por endoscopia (método invasivo), fazendo-se uso do teste da urease, cultivo em meios apropriados ou submetidos à análise histológica com coloração de Giemsa e o PCR. Paralelamente, o diagnóstico pode ser obtido por procedimentos não invasivos, que compreendem a sorologia e o teste respiratório empregando a CO(NH₂)₂ enriquecida no isótopo de ¹³C (isótopo estável) ou ¹⁴C (isótopo radioativo).^3,4

A ¹⁴CO(NH₂)₂ é uma técnica não autorizada pela maioria das autoridades de saúde para o diagnóstico do HP, porque está associada a uma dose de radiação que, embora bastante baixa (5 µCi), necessita de uma licença (do órgão fiscalizador) para se realizar o exame, com local adequado para armazenamento e sua utilização não é permitida para mulheres grávidas e crianças. Por outro lado, o teste de respiração empregando o ¹³C tornou-se cada vez mais atrativo, porque o isótopo estável é inócuo, de modo que pode ser repetido quantas vezes que forem necessárias em um mesmo paciente, como também pode ser realizado com segurança em crianças, mulheres grávidas ou com idade fértil.⁵ É um teste com mais de 90% de sensibilidade, altamente específico e permite a triagem de pacientes que não necessitam de exame direto da mucosa do estômago ou com dificuldade (sangramento, úlceras, terapia anticoagulante) na realização de biópsia. Pode ser usado em estudos epidemiológicos, sendo o teste de preferência para o controle da erradicação da infecção.⁶

No exame o paciente ingere 75 mg de ¹³CO(NH₂)₂ enriquecida (99% em átomos de ¹³C) dissolvida em suco de laranja ou H₂O. Em crianças recomenda-se 50 mg, devido à menor massa corpórea (< 30 kg).⁷ Após a ingestão, a ¹³CO(NH₂)₂ atinge a mucosa gástrica e, na presença do HP, é metabolizada pela enzima urease da bactéria (reação 1).

O dióxido de carbono (¹³CO₂) difunde-se dentro dos vasos sanguíneos, sendo transportado sob a forma de bicarbonato até os pulmões e liberado na forma de ¹³CO₂ com o ar expelido.⁸ Na presença da urease bacteriana a razão (¹³C/¹²C) isotópica é alterada significativamente. A proporção de ¹³CO₂, na amostra de ar expelido, é determinada por espectrometria de massas (IRMS) e expressa como diferença absoluta (Δ) entre os valores no tempo zero (t = 0) e 30 min (t = 30). O ponto crítico para catalogar os pacientes com HP negativo ou positivo é determinado por um valor Δδ de 4‰ (variação de delta per mil), o que significa que um aumento no valor de Δδ maior que 4‰ é indicativo da infecção.⁹

Na ausência de urease bacteriana, toda a ¹³CO(NH₂)₂ administrada pelo paciente, após reabsorção no trato gastrointestinal, será metabolizada como a ureia endógena. O NH₄⁺ resultante da hidrólise bacteriana é incluído no metabolismo.

O crescente interesse pelo teste não invasivo, empregando a ¹³CO(NH₂)₂, no diagnóstico da infecção causada pelo Helicobacter pylori tem sido observado recentemente, refletindo um grande número de estudos publicados.^10-15

As principais inconveniências do teste respiratório são a disponibilidade da ¹³CO(NH₂)₂ enriquecida ( > 99% em átomos de ¹³C) e a aquisição do espectrômetro de massas (IRMS), tornado-se um investimento economicamente inviável. No entanto, como no diagnóstico se utiliza o isótopo de ¹³C, não radioativo, as amostras coletadas (ar expelido) podem ser enviadas para um centro de referência (localizado em regiões estratégicas), compartilhando apenas um espectrômetro entre vários centros especializados.

Com relação à disponibilidade do composto (¹³CO(NH₂)₂) enriquecido no isótopo estável, sabe-se que a tecnologia de produção não é repassada pelos países que a detém, em razão de interesses econômicos e, muitas vezes, estratégicos, o que torna extremamente importante o desenvolvimento de novas tecnologias (separação isotópica e produção de compostos enriquecidos) no Brasil.

A síntese da CO(NH₂)₂, em sistema descontínuo, envolvendo a reação química entre o CO (monóxido de carbono), NH₃ (amônia) e S (enxofre), à temperatura de 100 ºC, na presença do CH₃OH (metanol), é um método alternativo ao processo convencional (pressão de 13 a 25 MPa e temperatura de 170 a 200 ºC). Inicialmente o procedimento foi realizado, em escala laboratorial (ou piloto), em reator tipo A-4, spec. 94-40376 com volume de 1,8 L. De acordo com os resultados, utilizando-se 10,9 g de NH₃, 9,8 g de S, 8,7 g de CO, 0,6 g de H₂S e 35 mL de CH₃OH, obteve-se em torno de 13,5 g de CO(NH₂)₂, equivalente a rendimento de 73%.¹⁶

Utilizando-se o método alternativo, desenvolveram-se estudos para obter CO(NH₂)₂ enriquecida em ¹⁵N e/ou ¹³C, avaliando-se também a reação de síntese entre ¹⁵NH₃, ¹³CO e S, sob baixa pressão e temperatura. O rendimento do processo base (1 mol de ¹⁵NH₃, 1 mol de CO e 0,75 mol de S, temperatura de 100 ºC e tempo de reação de 3 h), para obtenção CO(¹⁵NH₂)₂, foi de 83%; o produto final apresentou 0,1% de biureto e 0,45-0,5% de S.¹⁷ A síntese da ¹³CO(NH₂)₂, utilizando-se 45 g (2,6 mols) de NH₃, 21 g (0,71 mol) de ¹³CO, 32 g (1 mol) de S, 150 g de metanol (previamente saturado com H₂S), na temperatura de 100 ºC e tempo de 3 h, apresentou rendimento de 87% (37,5 g). O rendimento do processo (envolvendo 20 g de mistura metanol-¹⁵NH₃, 10,1 g (0,34 mol) de ¹³CO, 50 mL de metanol (saturado com H₂S) e 10,6 g (0,33 mol) de S, a 100 ºC e tempo de 8 h) para a síntese da ¹³CO(¹⁵NH₂)₂ foi em torno de 35% (5 g).¹⁸

No Brasil, avaliou-se a síntese da CO(¹⁵NH₂)₂, com baixo enriquecimento (5% em átomos de ¹⁵N), a partir da reação entre ¹⁵NH₃, CO e S. Nesse, foi utilizado um reator de aço inoxidável com uma manta aquecedora e um manômetro de aço inoxidável para controle de pressão e da quantidade dos reagentes (principalmente do CO) a ser introduzidos no reator. O sistema de produção apresentou rendimento, em média, de 78%, sendo verificada baixa contaminação de metais pesados, proveniente das paredes do reator de síntese. Foi avaliado o aspecto termodinâmico desse processo de síntese da CO(NH₂)₂, envolvendo a reação entre CO, S e NH₃. Os resultados indicaram que a conversão de NH₃ a CO(NH₂)₂ foi inversamente proporcional à temperatura, no entanto, ela não explica a cinética da reação. Assim, à temperatura ambiente (25 ºC), o equilíbrio (conversão de 92,5%) da reação pode ser obtido em tempo extremamente prolongado.¹⁹

A disponibilidade de compostos enriquecidos nos isótopos estáveis (¹⁵N, ³⁴S, entre outros), no país, impulsionou significativamente as pesquisas com o emprego de traçador não radioativo.^20-23 Ressalta-se, ainda, que os custos desses compostos têm se mostrado inferiores ao preço de comercialização internacional (FOB).

Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo a síntese da ¹³CO(NH₂)₂ enriquecida (99% em átomos de ¹³C), bem como o controle de qualidade (físico-química e microbiológica), visando seu emprego no diagnóstico da Helicobacter pylori (HP). Além disso, o processo de síntese foi submetido a uma avaliação (custos fixos e variáveis) econômica específica, relacionando os valores (composto e diagnóstico) com os obtidos no mercado nacional e do exterior.

PARTE EXPERIMENTAL

Síntese da ¹³CO(NH₂)₂

A reação de síntese da ¹³CO(NH₂)₂ ocorreu dentro de um reator de aço inoxidável (1 L) revestido internamente com politetrafluoretileno (PTFE). O procedimento de produção envolve a reação entre ¹³CO, NH₃, S, tendo o CH₃OH (metanol) como solvente, sob baixa pressão e temperatura.¹⁹

Inicialmente adicionou-se o enxofre (S) no interior do reator de síntese. A quantidade (g) de S foi em função do ¹³CO (reagente limitante) e tomando como base a estequiometria da reação (2).²⁴ O reator foi fechado, ajustando-se corretamente a tampa do cilindro de reação e, com auxílio de um sistema (linha de vidro e bomba mecânica) de vácuo, a pressão em seu interior foi reduzida a 10^-3 MPa. Após, o reator foi colocado em uma solução (etanol e CO₂(s)) à temperatura de -74 ºC, com objetivo de facilitar a transferência dos reagentes (NH₃, ¹³CO, H₂S e CH₃OH) para o reator.

Em seguida, os recipientes contendo CH₃OH, H₂S e NH₃ foram conectados ao reator de síntese, através de tubulações de aço inoxidável (Ø ¼) e válvulas tipo esfera. Desse modo, abrindo-se as válvulas realizou-se a limpeza, com o sistema de vácuo, nas tubulações para a transferência dos reagentes. Ao final, pressão em torno de 10^-3 MPa, fechou-se a válvula de interligação com o sistema de vácuo e adicionaram-se, pela ordem, H₂S, CH₃OH e NH₃ para o reator. O volume (mL) de CH₃OH empregado no processo foi calculado de acordo com a quantidade (g) de S.¹⁷ Ao final, desconectaram-se os recipientes (NH₃, CH₃OH e H₂S), sendo que a massa (g) de NH₃ transferida foi determinada por gravimetria.

Por último, o ¹³CO enriquecido (99,7% em átomos de ¹³C), contido no reservatório de aço inoxidável, foi então admitido ao reator. Para facilitar a transferência do gás (¹³CO) manteve-se a temperatura do reator em torno de -74 ºC (solução de etanol e CO₂(s)), diminuindo a pressão de vapor dos reagentes (NH₃, H₂S e CH₃OH) presentes no reator. Na sequência, transferiu-se o ¹³CO para o reator. Após o procedimento, fecharam-se as válvulas, desconectou-se o reservatório e a massa (g) do ¹³CO foi determinada por gravimetria.

O reator foi retirado da solução (CH₃CH₂OH e CO₂(s)) e, ao atingir a temperatura ambiente (± 25 ºC), colocado em um sistema de aquecimento provido com agitação mecânica (Figura 1). Esse sistema de aquecimento é constituído de placas aquecedoras com controle de temperatura (termostato) incluindo um termopar tipo k no interior do reator. Ao final do período de reação, o sistema de aquecimento foi desligado e resfriou-se o reator até a temperatura ± 25 ºC.

Os gases existentes no interior do reator, provenientes da reação, foram expurgados, com auxílio de N₂ (gás de arraste), passando na sequência por uma solução contendo 1 mol L^-1 de H₂SO₄ (para reter possíveis traços de NH₃) e finalmente por uma solução de H₂O₂ 30% (m/v) e 2 mol L^-1 NaOH, na proporção de 1:2 (H₂O₂:NaOH), para reter o H₂S (subproduto da reação), sendo esse um gás extremamente tóxico e inflamável.

Em seguida, procedeu-se à abertura do reator com a retirada da mistura de ¹³CO(NH₂)₂ e S, contida no seu interior. O reator teve sua parede interna lavada com H₂O desionizada, solubilizando a ¹³CO(NH₂)₂ e mantendo o S na fase sólida, em vista de sua baixa solubilidade. Por filtragem a vácuo (mecânica), em papel de filtro em microfibra de vidro (1,6 mm) e outro de membrana em ésteres de celulose (0,45 mm), o S foi separado da ¹³CO(NH₂)₂. A solução final, contendo ¹³CO(NH₂)₂ solubilizada em H₂O, foi aquecida a 50 ºC, obtendo-se o produto na forma cristalina.

A ¹³CO(NH₂)₂ sintetizada foi submetida a processos de purificação para retirada de possíveis impurezas obtidas durante a reação de síntese. O primeiro procedimento (UQ) baseia-se na solubilidade das impurezas em um solvente orgânico, sendo empregada a acetona (CH₃COCH₃). Para isso, a ¹³CO(NH₂)₂ foi colocada em um béquer e adicionaram-se 50 mL de CH₃COCH₃, sob agitação. Em seguida, a solução foi transferida para o sistema de filtração a vácuo, com filtro de microfibra (1,6 mm), separando-se o composto sólido. Após o procedimento, a ¹³CO(NH₂)₂ foi novamente cristalizada.

No segundo procedimento foi utilizado, após UQ, o processo de troca iônica (UF), constituído por duas colunas de vidro (com diâmetro interno de 1,6 cm e comprimento de 30,5 cm) preenchidas até 27 cm do topo, com resinas catiônicas (Dowex 50W-X8) e aniônica (Dowex 1X8). Essas resinas foram utilizadas com o objetivo de se reter as impurezas (elementos na forma iônica) e permitir que a ¹³CO(NH₂)₂ percolasse pelas colunas. O volume de resina acondicionada, na forma H⁺ ou OH^- equilibrada em H₂O, totalizou 70 mL para cada coluna.

As resinas foram preliminarmente lavadas com H₂O (Mili-Q) com objetivo de retirar as impurezas e traços de resíduos orgânicos. Posteriormente, os sítios ativos das resinas (catiônica e aniônica) foram saturados nas formas de R-H⁺ e R-OH^-, pela admissão de soluções de HCl (1 mol L^-1) e NaOH (2 mol L^-1), respectivamente. O fluxo das soluções procedeu por gravidade, com os reservatórios localizados a 1 m de altura em relação à base do sistema de coluna. Para eliminar o excesso de HCl e NaOH, volume intersticial das resinas, foi realizada a lavagem com admissão de H₂O (Mili-Q).

Em seguida, as colunas foram acopladas em série (R-H⁺/R-OH^-) e interligadas ao reservatório de armazenamento (1 L). A massa (g) de ¹³CO(NH₂)₂, equivalente a uma batelada, foi dissolvida em H₂O (Mili-Q) e admitida no sistema de colunas. Essa solução resultante foi eluída com H₂O (Mili-Q), contida no reservatório. Ao final do procedimento, a ¹³CO(NH₂)₂ foi cristalizada (50 ºC).

Controle de qualidade da ¹³CO(NH₂)₂

As amostras de ¹³CO(NH₂)₂ foram submetidas, em triplicata, a vários procedimentos analíticos, tais como: determinação da concentração (%) de N utilizando espectrômetro de massas com analisador automático - Continuous Flow - Isotope ratio mass spectrometry (CF-IRMS), fazendo uso do padrão NIST 1577b (National Institute Standards of Technology), contendo 10,18% de Ntotal; análise do ponto de fusão (ºC) e concentração (%) de biureto; determinações (mg kg^-1) multielementares por espectrometria de massas com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS).^25-28

Para a determinação isotópica (% em átomos de ¹³C) da ¹³CO(NH₂)₂ sintetizada foram utilizados os métodos para obtenção do ¹³CO₂ (g) e análise no espectrômetro de massa Atlas Mat modelo CH4 (fluxo molecular).²⁴

A carga microbiana (bactérias, fungos e leveduras), nas amostras de ¹³CO(NH₂)₂ enriquecida, foi determinada de acordo com a Farmacopeia Brasileira.²⁹ As placas foram incubadas na temperatura de 30 a 35 ºC por 4 dias (bactérias) e entre 20 e 25 ºC por 7 dias (fungos e leveduras).³⁰

Aspectos econômicos

O processo de síntese foi submetido a uma análise econômica específica, objetivando atestar sua viabilidade (custo benefício) em relação aos métodos (invasivos ou não) utilizados para o diagnóstico da Helicobacter pylori (HP). Para tanto, foi considerado o custo (R$), por batelada, do processo (equipamentos; infraestrutura física; manutenções; mão de obra; reagentes; energia elétrica e análises) de síntese da ¹³CO(NH₂)₂, comparando com o valor de comercialização do produto no mercado internacional (FOB).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Síntese da ¹³CO(NH₂)₂

Com o sistema proposto, envolvendo todas as etapas descritas, foi possível obter em média 2,35 ± 0,1 g de ¹³CO(NH₂)₂ enriquecida no isótopo de ¹³C, equivalente a rendimento médio de 81,9 ± 1,5%. No procedimento utilizaram-se 6,13 g de NH₃, 1,28 g de ¹³CO e S, 40 mL de CH₃OH, 40 mg de H₂S, temperatura de 100 ºC, tempo de reação em 120 min e pressão de 0,98 MPa.²⁴ A síntese completa demanda um tempo de, aproximadamente, 8 h de trabalho.

A temperatura de reação foi atingida após, aproximadamente, 30 min, quando, então, se manteve constante com o emprego de um sistema de aquecimento com controle (termostato/Termopar) de temperatura. Ao final do período de reação e do resfriamento do reator (± 25 ºC), efetuou-se a exaustão dos gases em, aproximadamente, 25 min.

No processo, com base nos dados da síntese, também foram realizados o balanço de massa dos reagentes principais (NH₃ e ¹³CO), obtendo-se, em média, recuperação de 65,3% (21,4% incorporado na molécula da ¹³CO(NH₂)₂ e 43,9% recuperado na forma de (NH₄)₂SO₄) e perda de 34,7% de NH₃ (provavelmente na forma de óxidos de nitrogênio). Com relação ao ¹³CO pôde-se verificar recuperação de 84,0% (incorporado na ¹³CO(NH₂)₂) e perda de 16% (0,2048 g do ¹³CO). Esse último fato proporcionou redução econômica do processo de síntese em torno de R$ 44,06 por batelada (R$ 241,0/g de ¹³CO), devido ao uso de composto com elevado (99,7% em átomos de ¹³C) enriquecimento isotópico.

Os resultados isotópicos (% em átomos de ¹³C), obtidos nas amostras de ¹³CO(NH₂)₂ sintetizadas, foram, em média, 99,1 ± 0,3% em átomos de ¹³C, evidenciando ausência de fracionamento isotópico no sistema de produção.

Análise da ¹³CO(NH₂)₂

Concentração (%) de nitrogênio (N)

As determinações da concentração (%) de N contido nas amostras de ¹³CO(NH₂)₂ foram realizadas em espectrômetro de massas com sistema analisador automatizado (Anca-GSL), utilizando-se do padrão NIST 1577b. Os dados contidos na Tabela 1 não apresentaram diferença estatística significativa (F = 1,59), ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. Desta forma, as amostras de ¹³CO(NH₂)₂ sintetizadas não apresentaram diferença estatística em relação a P.A (grau analítico), atestando a eficiência do procedimento de produção. Além disso, os resultados apresentaram excelente precisão analítica (CV = 0,54%), com concentração média de 46,2% de N, equivalente à pureza química de 99,2%.

Ponto de fusão (ºC) e teor (%) de biureto

A análise do ponto de fusão mostrou que a ¹³CO(NH₂)₂ sintetizada funde à temperatura média de 132,9 ºC, valor muito próximo da amostra P.A (grau analítico). Essa última apresentou ponto de fusão médio de 133,7 ºC, dentro da especificação fornecida pelo fabricante. Fato que comprova a adequação do método analítico, bem como demonstra a eficiência do procedimento de purificação submetido às amostras de ¹³CO(NH₂)₂ sintetizadas.

Os resultados das análises colorimétricas para determinação da concentração (%) de biureto (impureza tóxica), presente nas amostras de ¹³CO(NH₂)₂, apresentaram valor médio de 0,55% em peso do composto. Verificou-se também que as amostras sintetizadas apresentaram diferença em relação à amostra P.A (grau analítico), cuja concentração média de biureto foi 0,06%. Além disso, a concentração de biureto (0,06%) contido na amostra P.A está de acordo com o valor certificado pelo fornecedor, atestando a eficiência do método analítico empregado.

A ¹³CO(NH₂)₂ enriquecida (99% em átomos de ¹³C) é usada, em clínica médica, para o diagnóstico da Helicobacter pylori (HP), sendo necessário a admissão via oral de 75 mg (adultos) e 50 mg (crianças) do composto por exame. Desta forma, empregando-se a ¹³CO(NH₂)₂ sintetizada tem-se a ingestão, por exame, de 0,0059 e 0,009 mg de biureto por kg^-1 de massa corpórea para adultos e crianças, respectivamente. Essas quantidades (mg) administradas de biureto não oferecem risco à saúde da população, levando-se em consideração que outros compostos, tais como, 2,3,7,8-Tetraclorodibenzop-dioxina (2,3,7,8-TCDD) e Tetradotoxina, que são extremamente tóxicos, por ingestão, apresentam limite máximo (DL₅₀) de 0,022 e 0,01 mg kg^-1 de massa corpórea, respectivamente.³¹ Pode-se ainda destacar que a ¹³CO(NH₂)₂ pode ser considerada uma molécula análoga ao biureto, apresentando um valor de DL₅₀ oral, para ratos, de 14.300 mg kg^-1 (inócuo).

Análise multielementar por ICP- MS

A precisão e exatidão do método analítico empregado foram verificadas utilizando-se um material certificado de referência (NIST 1515) e uma solução padrão multielementar de calibração (SVC), da marca Agilent. Os resultados experimentais, em triplicata, das concentrações (mg kg^-1) dos elementos obtidos nas amostras estão apresentados na Tabela 2.

As determinações realizadas dos elementos B, Na, Mg, Al, P, S, K, Ca, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Ba e Pb concordaram com os valores certificados no material de referência (NIST 1515) e de verificação da calibração (SVC) (Tabela 2), apresentando taxa de recuperação na faixa de 93-105% e os desvios padrão relativos foram, em geral, menores que 8%.

Na Tabela 3 estão expressos os resultados das concentrações (mg kg^-1) dos analitos (B, Na, Mg, Al, P, S, K, Ca, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Ba e Pb) para as diferentes amostras (UQ e UF) de ¹³CO(NH₂)₂ sintetizadas, bem como os valores referentes à amostra P.A (grau de pureza analítico). Analisando os dados correspondentes às amostras de ¹³CO(NH₂)₂ obtidas após processos de purificação com CH₃COCH₃ (UQ) e CH₃COCH₃/resinas (UF), respectivamente, verificou-se uma variação bastante significativa nas concentrações (mg kg^-1) desses elementos. Esse fato demonstra a eficiência no processo de purificação de UF, nas amostras de ¹³CO(NH₂)₂, proporcionando redução média de 77% nas concentrações dos elementos analisados.

Nesse contexto, destacam-se os resultados obtidos para B, Na, S, K, Cr, Zn, Ba e Pb que apresentaram excelente redução na faixa de 90 a 100% dos elementos. Em particular, é importante mencionar os bons resultados obtidos para os micronutrientes como Cr (91,66%) e Zn (88,34%), que desempenham funções nutricionais ou bioquímicas essenciais à saúde dos seres vivos, porém sua presença em organismos vivos pode ser prejudicial em concentrações acima do limite máximo permitido pelas legislações pertinentes. Outros elementos, tais como Ba (98,21%) e Pb (100%), que não são essenciais aos seres vivos do ponto de vista biológico e são considerados tóxicos, mesmo em baixas concentrações (mg kg^-1), porque são acumulativos nos organismos dos animais e homens.³²

Ainda com base nos dados da Tabela 3, verificou-se que 50% dos elementos analisados não apresentaram variações expressivas nas concentrações (mg kg^-1) entre as amostras de UF e P.A. Os valores encontrados estão dentro dos limites máximos de tolerância (LMT) estabelecidos pelas normas brasileiras e atendem também às especificações de outros países.^33,34 Em destaque para B, S e Pb que tiveram níveis de quantificação, em UF e P.A, abaixo do limite (0,16; 174,0; 0,028 µg L^-1) de detecção no ICP-MS. Esses resultados atendem às exigências das Farmacopeias, principalmente para o Pb, que tem como limite máximo permitido em matérias-primas para produção de medicamentos a faixa de 10 a 20 mg kg^-1. O limite máximo permitido de Pb na zidovudina (AZT), agente antiviral amplamente utilizado no tratamento da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), fornecido pela United States Pharmacopeia (USP) é 10 mg kg^-1.³⁵

Por outro lado, concentrações médias obtidas para Na, Al e Fe (18,41; 20,24 e 40,56 mg kg^-1, respectivamente) situam-se muito acima dos valores obtidos para os outros elementos, bem como também diferem significativamente do correspondente na amostra P.A (grau analítico). Outros elementos como Cr, Mn e Ni apresentam concentrações bastante reduzidas em UF (0,62; 0,81 e 1,24 mg kg^-1, respectivamente), porém superiores aos valores quantificados nas amostras P.A. Essas informações obtidas, na Tabela 3, são extremamente importantes, levando-se em consideração que os elementos "potencialmente tóxicos" como Al, Cr e Ni são importantes em vista de alguns riscos à saúde (mutações, carcinogenicidade, lesões no DNA, disfunções neurológicas como Mal de Alzheimer e outros tipos de escleroses) atribuídos à ingestão e acúmulo no organismo humano.³⁶

No entanto, a presença desses elementos (principalmente Al e Cr) nas amostras de ¹³CO(NH₂)₂ não é preocupante, uma vez que no diagnóstico da Helicobacter pylori serão admitidos, via oral, 75 mg (adulto) e 50 mg (crianças) do composto por exame.⁷ Nessas quantidades administradas aos pacientes, as concentrações de Al, Fe, Cr, Mn e Ni (2,54; 5,58; 0,42; 0,15 e 0,21 µg/dose, respectivamente) são bem inferiores aos limites máximos permitidos pela legislação pertinente.³³ Ainda deve-se salientar que a ¹³CO(NH₂)₂ não é medicamento de uso diário, descartando a preocupação da acumulação do elemento pela exposição contínua.

Análise microbiológica

As amostras de ¹³CO(NH₂)₂ sintetizadas apresentaram valores de contagem (< 10 UFC g^-1) em placas para bactérias, fungos e leveduras muito abaixo das especificações fornecida pelo órgão fiscalizador, bem como os limites especificados pela Farmacopeia Brasileira.^29,33 Também não foi encontrada a presença de Salmonella spp, Escherichia coli e Staphylococcus aureus em nenhuma das amostras do composto analisadas.

Avaliação econômica

O custo de produção da ¹³CO(NH₂)₂, com enriquecimento de 99,1% em átomos de ¹³C, foi de R$ 192,21 por grama do composto (Tabela 4), valor esse cerca 20,5% inferior ao preço internacional (FOB) que é de R$ 242,00 (US$ 134.40), baseado na cotação do dólar em R$ 1,80. No entanto, deve-se salientar a ausência das elevadas taxas e impostos aplicados aos produtos importados.

Deve-se ainda mencionar que a produção nacional (em escala piloto), por batelada, de 2,35 g da ¹³CO(NH₂)₂, enriquecida a 99,1% em átomos de ¹³C, corresponde à realização de 32 diagnósticos da infecção por Helicobacter pylori (HP) em adultos (75 mg), com custo de R$ 54,40 (referente ao valor de R$ 14,40 do composto e R$ 40,00 das análises isotópicas no t = 0 e t = 30 min) por exame, ou pode-se também realizar, com a devida massa (2,35 g), em torno de 53 diagnósticos do HP em crianças (45 mg), com custo unitário de R$ 48,64 (R$ 8,64 do composto e R$ 40,00 das análises isotópicas) por exame. Além disso, os custos (nacional e no exterior) estimados dos métodos para diagnóstico do HP que dependem da realização de endoscopia para a coleta da biópsia gástrica (invasivos), bem como os testes empregando compostos marcados nos isótopos de C (não invasivos) estão apresentados na Tabela 5.

Os custos nacionais dos métodos invasivos foram em média 136% mais elevados que os procedimentos não invasivos (sorologia, ¹⁴C e ¹³C). Destacando-se que a ¹³C-ureia utilizada para o diagnóstico, no Brasil, foi importada (custo FOB + taxas de tributação) de outros países, principalmente dos Estados Unidos, Inglaterra e França. Observou-se também que os custos dos procedimentos (invasivos ou não) realizados no exterior apresentaram comportamento semelhante aos nacionais, no entanto, somente o teste sorológico (IgG) apresentou custo 57,9% superior (R$ 83,3). Outro fato verificado, na Tabela 5, foi que os valores dos diagnósticos empregando os isótopos de ¹³C e ¹⁴C foram muito próximos, mas é importante salientar que o teste respiratório empregando ¹⁴C-ureia não é recomendado em algumas situações (pediatria, estudos epidemiológico e mulheres grávidas) por ser radioativo.⁴

O emprego da ¹³C-ureia (¹³CO(NH₂)₂) enriquecida (Tabela 5), obtida no país, permite uma economia em torno de R$ 341,5 e 113,4 para os procedimentos invasivos ou não, respectivamente, empregados no diagnóstico da HP. Além disso, o valor (R$ 54,40) do diagnóstico empregando ¹³C-ureia mostrou-se inferior, cerca de 3 vezes, ao custo do exame realizado no exterior.

CONCLUSÃO

O método utilizado para síntese da ¹³CO(NH₂)₂ mostrou-se adequado, atestado pela qualidade físico-química e microbiológica, segundo padrões estabelecidos pelos órgãos fiscalizadores, indicando boas condições para emprego no diagnóstico da Helicobacter pylori (HP).

A ¹³CO(NH₂)₂ sintetizada apresentou custo muito próximo ao comercializado no mercado internacional (FOB), ausentes das taxas e impostos aplicados aos produtos importados. O diagnóstico da HP, empregando a ¹³C-ureia sintetizada, apresentou elevada redução no custo em relação aos procedimentos (invasivos ou não) aplicados atualmente em clínicas e hospitais do país e do exterior. É importante mencionar que com o avanço tecnológico (métodos para a separação isotópica de C (¹³C/¹²C) e obtenção do ¹³CO), no país, o custo de R$ 54,40 do diagnóstico da HP tende a sofrer mais reduções.

AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório de Isótopos Estáveis pelo apoio técnico na execução do trabalho, à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento do projeto de pesquisa e bolsa de estudos.

Recebido em 19/6/12; aceito em 14/8/12; publicado na web em 28/11/12

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Fev 2013
• Data do Fascículo
  2013

Histórico

• Recebido
  19 Jun 2012
• Aceito
  14 Ago 2012