Constituintes químicos de Vernonia scorpioides (Lam) Pers. (Asteraceae)

Chemical constituents of Vernonia scorpioides (Lam) Pers. (Asteraceae)

Resumo

The chemical investigation of hexane and ethanol extracts from the aerial parts of Vernonia scorpioides resulted in the isolation and characterization of a new polyacetylene lactone, rel-4-dihydro-4β-hydroxy-5a-octa-2,4,6-triynyl-furan-2-(5H)-one, along with the new ethyl 3,4-dihydroxy-6,8,10-triynyl-dodecanoate, and seven known compounds: taraxasteryl acetate, lupeyl acetate, lupeol, lupenone, β-sitosterol, stigmasterol and luteolin. The structure of all compounds was determined by spectrometric techniques (HR-ESI-MS, ¹H and 13C NMR and IV) and comparison with published spectral data.

Vernonia scorpioides; Asteraceae; lactones

Vernonia scorpioides; Asteraceae; lactones

ARTIGO

Constituintes químicos de Vernonia scorpioides (Lam) Pers. (Asteraceae)

Chemical constituents of Vernonia scorpioides (Lam) Pers. (Asteraceae)

Adalva Lopes Machado^I; Fabiana Martins Aragão^I; Paulo N. Bandeira^I; Hélcio Silva dos Santos^I; Maria Rose Jane R. Albuquerque^I,*; Otília Deusdênia L. Pessoa^II; Edilberto R. Silveira^II; Edson Paula Nunes^III; Raimundo Braz-Filho^IV

^ICoordenação de Química, Centro de Ciências Exatas e Tecnologia, Universidade Estadual Vale do Acaraú, CP D-3, 62040-340 Sobral - CE, Brasil

^IIDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, CP 12200, 60021-970 Fortaleza - CE , Brasil

^IIIDepartamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará, CP 6021, 60455-760 Fortaleza - CE, Brasil

^IVPesquisador Visitante Emérito - FAPERJ, Laboratório de Ciências Químicas, Universidade Estadual do Norte Fluminense /Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 28013-602 Campos dos Goytacazes - RJ, Brasil

ABSTRACT

The chemical investigation of hexane and ethanol extracts from the aerial parts of Vernonia scorpioides resulted in the isolation and characterization of a new polyacetylene lactone, rel-4-dihydro-4β-hydroxy-5a-octa-2,4,6-triynyl-furan-2-(5H)-one, along with the new ethyl 3,4-dihydroxy-6,8,10-triynyl-dodecanoate, and seven known compounds: taraxasteryl acetate, lupeyl acetate, lupeol, lupenone, β-sitosterol, stigmasterol and luteolin. The structure of all compounds was determined by spectrometric techniques (HR-ESI-MS, ¹H and ¹³C NMR and IV) and comparison with published spectral data.

Keywords:Vernonia scorpioides; Asteraceae; lactones.

INTRODUÇÃO

Vernonia scorpiodes (Lam.) Pers. (Asteraceae) [sin. Conyza scorpioides Lam., Lepidaploa scorpioides Cass], conhecida popularmente por piracá, enxuga ou erva-de-São Simão, é uma planta perene, de porte subarbustivo de até 2,50 m de altura, muito ramificada e encontrada comumente em pastagens, terrenos baldios e beira de estradas de todo o território nacional.^1,2 O extrato etanólico das folhas frescas de V. scorpioides é empregado amplamente em aplicações tópicas no tratamento de enfermidades da pele, incluindo feridas crônicas e úlceras.² Estudos prévios dos extratos brutos e das frações revelaram que esta espécie apresenta relevantes propriedades farmacológicas, como antitumoral e citotóxica, além de antibacteriana e fungicida.³

Várias espécies de Vernonia são muito difundidas na medicina tradicional, em diversas partes do mundo, principalmente nos continentes americano e africano.⁴ Dentre as espécies do mesmo gênero, reconhecidas como medicinais, destacam-se V. amygdalina, utilizada no tratamento da esquistossomose, disenteria amebiana, distúrbios gastrointestinais, malária, doenças venéreas, hepatites e diabetes,⁵ e V. colorata, empregada no tratamento de furúnculos, distúrbios intestinais, febres, tosses e no controle da diabetes mellitus.⁶ No Brasil, destacam-se V. condensata, administrada na forma de chá para o tratamento de desordens gastrointestinais, dores de cabeça e contra picada de cobra,⁴ e V. scorpioides, cujo extrato alcoólico é utilizado no tratamento de ferimentos cutâneos.⁷ Estudos químicos relacionados a essas espécies relatam a ocorrência de triterpenos, esteroides, glicosídeos esteroidais, lignoides, carotenoides, alcaloides, taninos, flavonoides, um derivado do ácido vernólico, um éter alifático, alcoóis e lactonas sesquiterpênicas, sendo estas últimas consideradas marcadores taxonômicos para o gênero.⁸

Estudos anteriores relacionados à composição química de V. scorpioides relatam a ocorrência de lactonas sesquiterpênicas, incluindo um derivado poliacetilênico.^2,3 A composição química do óleo essencial desta espécie foi relatada previamente,⁹ enquanto que, neste trabalho, se relata a composição química dos extratos hexânico e etanólico de suas partes aéreas.

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentação e material cromatográfico

Os pontos de fusão foram determinados em equipamento de microdeterminação digital da Mettler Toledo com placa aquecedora FP82HT e uma central de processamento FP90. As determinações foram realizadas a uma velocidade de aquecimento de 2 ºC/min e não foram corrigidas. Os espectros de absorção na região de IV foram registrados em espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 1000 com transformada de Fourier, utilizando pastilhas de KBr. Os espectros de RMN de ¹H e de ¹³C (1D e 2D), foram obtidos em espectrômetros Bruker, modelos DRX-300 (300 MHz para ¹H e 75 MHz para ¹³C) e Avance DRX-500 (500 MHz para ¹H e 125 MHz para ¹³C). Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em espectrômetro de massa Shimadzu, modelo QP 5000/DI-50, por impacto eletrônico a 70 eV, enquanto os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em um LCMS-IT-TOF equipado com fonte de ionização por electrospray (Shimadzu). Nas cromatografias de adsorção utilizou-se gel de sílica 60 da Vetec (Ø µm 70-230 mesh), enquanto nos fracionamentos cromatográficos por exclusão molecular foi empregado Sephadex LH-20. Nas cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) utilizou-se gel de sílica 60 (Ø µm 5-40 Merck) com indicador de fluorescência na faixa de 254 hm (F₂₅₄). As substâncias foram reveladas com solução de vanilina/ácido perclórico/EtOH, seguida por aquecimento em estufa (~ 100 ºC).

Material vegetal

As partes aéreas de Vernonia scorpioides, em estágio de floração, foram coletadas no Pico Alto, Guaramiranga - CE, em abril de 2008. A identificação botânica foi realizada pelo Prof. E. P. Nunes (Departamento de Biologia, UFC). Uma exsicata da planta, preparada a partir do material coletado, encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra (EAC) do Departamento de Biologia - UFC, sob o registro 33.739.

Extração e isolamento

As partes aéreas (1.000,0 g) de V. scorpioides foram secas à temperatura ambiente, trituradas e, em seguida, submetidas à extração com hexano a frio, seguida por etanol (três vezes cada). As soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida, resultando nos extratos hexânico (14,5 g) e etanólico (27,6 g). O extrato hexânico, após fracionamento cromatográfico sobre gel de sílica (40,0 g), forneceu as seguintes frações: hexano [IA (6,7 g), IIA (0,9 g) e IIIA (0,6 g)], hexano/CHCl₃ 3:1 (500 mL; 2,8 g), hexano/CHCl₃ 1:1 (500 mL; 1,2 g), hexano/CHCl₃ 3:7 (500 mL; 1,4 g), CHCl₃ (500 mL; 0,1 g), AcOEt (200 mL; 0,2 g) e MeOH (200 mL; 0,05 g).

A fração hexano IA (6,7 g) foi submetida a fracionamento cromatográfico sobre 40,0 g de gel de sílica utilizando 150 mL de misturas binárias de hexano/CH₂Cl₂, em gradiente crescente de polaridade, obtendo-se 9 frações que, após análise por CCDA, foram reunidas em 7 grupos (A-I a A-VII). O grupo A-II (hexano/CH₂Cl₂ 9:1; 1,0 g) foi acondicionado sobre 37,0 g de gel de sílica e sujeito a fracionamento cromatográfico empregando os solventes hexano, CH₂Cl₂, e AcOEt, puros ou em misturas binárias, obtendo-se um total de 171 frações de aproximadamente 8 mL. A análise por CCDA permitiu reuni-las em 15 grupos (B-I a B-XV). O grupo B-V (hexano/CH₂Cl₂ 9,5:0,5; 131,3 mg), após fracionamento sobre gel de sílica (5,7 g) com os solventes hexano e CH₂Cl₂, em gradiente crescente de polaridade, resultou na obtenção de 113,4 mg de um sólido (hexano/CH₂Cl₂ 49:1) que, apesar de apresentar uma única mancha em CCDA, se constitui em uma mistura dos acetatos de taraxasterila (1) e lupeol (2).¹⁰ O grupo A-III (hexano/CH₂Cl₂ 4:1, 7:3 e 2:3; 2,05 g) foi disposto sobre 24,0 g de gel de sílica e submetido a uma coluna cromatográfica, utilizando um gradiente de hexano/CH₂Cl₂ (49:1 até CH₂Cl₂) e, depois, AcOEt. Deste procedimento foram obtidas 260 frações de 8 mL que, após análise por CCDA, resultaram em 14 grupos (C-I a C-XIV). O grupo C-V (hexano/CH₂Cl₂ 8,8:1,2;.92-129; 244,2 mg) após fracionamento cromatográfico sobre gel de sílica (19,5 g), empregando os solventes hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt em ordem crescente de polaridade, culminou no isolamento da substância 3 (hexano/CH₂Cl₂ 8,8:1,2; 7,2 mg), caracterizada como o triterpeno lupenona.¹⁰ A fração hexano/CHCl₃ 3:1 (2,8 g) foi sujeita a fracionamento cromatográfico sobre gel de sílica (25,5 g), utilizando a mistura binária dos solventes hexano/AcOEt, aumentando a concentração de 9,8:0,2 até 8,6:1,4, seguida por AcOEt e MeOH. Deste fracionamento foram coletadas 141 frações de 8 mL que, após analisadas por CCDA, foram reunidas em 7 grupos (D-I a D-VII).

O grupo D-III (47-78, hexano/AcOEt 9,4:0,6; 1,8 g), após sucessivos fracionamentos cromatográficos sobre gel de sílica empregando o sistema de solvente hexano/AcOEt, aumentando a concentração de 49:1, até AcOEt, resultou no isolamento do triterpeno lupeol (4) (28,9 mg, hexano/AcOEt 9,8:0,2; p.f 196,2-197,7 ºC; lit. 195-197ºC ).¹⁰

A fração hexano/CHCl₃ 1:1 (1,2 g) foi acondicionada sobre 37,0 g de gel de sílica e eluída com hexano, CHCl₃ e AcOEt, seguindo ordem crescente de polaridade resultando em 147 frações de 8 mL, que após monitoramento por CCDA culminaram em 12 grupos. O grupo V (52-62, hexano/CHCl₃ 6:4; 24,2 mg), após comparação com padrões, foi caracterizado como sendo composto por esteroides sitosterol (5) e estigmasterol (6).

O extrato EtOH bruto (27,6 g) foi dissolvido em 100 mL de MeOH e, em seguida, acrescentada H₂O até a proporção de 4:1. Esta mistura, após filtração, forneceu um resíduo (17,1 g) e a fase hidroalcoólica que, após extração com hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt (5 x 50 mL cada), resultou em 0,3; 3,7 e 1,3 g de material, respectivamente. A fração CH₂Cl₂ (3,7 g) foi acondicionada sobre 39,0 g de gel de sílica e eluída com a mistura de solventes hexano/AcOEt (8:2; 6:4; 4:6; 2:8) e, posteriormente, AcOEt. Este fracionamento resultou em 29 frações de 50 mL que, após destilação do solvente e monitoramento em CCDA, resultou em 9 grupos (E-I a E-IX). O grupo E-II (8-14, hexano/AcOEt 6:4; 229,3 mg) foi disposto sobre 7,4 g de gel de sílica e eluído com hexano, AcOEt e MeOH. Um total de 160 frações de 8 mL foi coletado que, após análise por CCDA, produziu 14 grupos (F-I a F-XIV). F-VIII (80-99, hexano/AcOEt 8:2; 63,7 mg) foi submetida à cromatografia em gel de sílica (7,0 g) e eluída com misturas binárias de hexano/AcOEt, seguindo um gradiente de polaridade e, finalmente, MeOH. 180 frações de 5,0 mL foram obtidas e, após monitoramento por CCDA, resultaram em 10 grupos (G-I a G-X). G-IV (84-115, hexano/AcOEt 7,9:2,1; 33,1 mg), após cromatografia sobre gel de sílica (2,4 g), utilizando hexano/AcOEt 9,5:0,5 até AcOEt, resultou em 120 frações de 2,5 mL, cuja análise por CCDA originou 10 grupos (H-I a H-X). H-V (50-74, hexano/AcOEt 8,5:1,5; 24,5 mg), após fracionamento em Sephadex LH-20 e MeOH como fase móvel, culminou no isolamento do composto 7 (17,7 mg; p.f. 105,5-106,4 ºC). O grupo F-X (108-121, hexano/AcOEt 7:3; 36,3 mg) foi submetido ao mesmo procedimento anterior, levando ao isolamento do composto 8 (4,0 mg). O grupo E-V (19-21, hexano/AcOEt 2:8; 182,4 mg) após fracionamento em Sephadex LH-20 e MeOH como eluente resultou no isolamento do flavonoide luteolina (9) (5,6 mg; p.f. 322-324 ºC; lit. >320 ºC).¹¹

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A prospecção química dos extratos hexânico e etanólico das partes aéreas de V. scorpioides resultou no isolamento de triterpenos, esteroides, um flavonoide, uma lactona poliacetilênica e seu produto de transesterificação. Do extrato hexânico foram isolados os triterpenos acetato de taraxasterila (1) e acetato de lupeíla (2),¹⁰ lupenona (3)¹⁰ e lupeol (4)¹⁰ além dos esteroides sitosterol (5) e estigmasterol (6). Os compostos 1-2 e 5-6 foram isolados como misturas binárias. Do extrato etanólico foram isolados uma nova lactona poliacetilênica (7), um éster etílico derivado desta (8), obtido possivelmente pela reação de 7 com EtOH, solvente utilizado no processo da extração, e 3',4',5,7-tetra-hidroxiflavona (luteolina) (9).¹¹ A estrutura de todos os compostos isolados foi determinada pela análise dos espectros de RMN de ¹H e de ¹³C, e por comparação de seus dados espectrais descritos previamente na literatura.

O composto 7, p.f. 105,5-106,4 ºC, isolado na forma de cristais de cor vinho, teve sua fórmula molecular C₁₂H₁₀O₃ determinada por espectrometria de massa de alta resolução através do pico m/z 201,0557 [M-H]^- (massa calculada 201,0551). Seu espectro na região do infravermelho apresenta bandas de absorção em 3424 e 2220 cm^-1 compatíveis com deformação axial de ligações O-H e ≡C-H, respectivamente. Uma banda em 1754 cm^-1, correspondente à deformação axial de ligação C=O, além de bandas em 1208 e 1021 cm^-1, correspondentes à deformação axial de ligação C-O.¹²

O espectro de RMN de ¹H mostra sinais em d 4,58 (m) e 4,46 (m) correspondentes a átomos de hidrogênio ligados a átomos de carbono oxigenado. Estes sinais mostram correlação HSQC com os sinais de carbonos metínicos em δ 83,6 e 68,9, respectivamente. O espectro revelou também sinais para dois pares de átomos de hidrogênio diastereotópicos em δ 2,91(dd, J = 17,6 e 5,5 Hz)/2,42 (dd, J = 17,6 e 0,5 Hz) e 2,82 (dd, J = 17,5 e 7,2)/2,77 (dd, J = 17,5 e 5,9), os quais no mapa de contorno HSQC exibiram correlações com os carbonos metilênicos em δ 40,1 (C-3) e 20,5 (C-1'), respectivamente. Apresentou ainda um singleto em δ 1,95 para um carbono metílico (3H-8'), Tabela 1.

O espectro de RMN de ¹³C-PND de 7 mostrou doze linhas espectrais que, em comparação com o DEPT 135º, foram atribuídas a dois carbonos metilênicos (d 40,1 e 20,5), dois carbonos oxi-metínicos (δ 83,6 e 68,9), um carbono metílico (δ 3,84) e sete carbonos não hidrogenados, dos quais o sinal em 177,9 corresponde a uma carbonila de g-lactona, enquanto os sinais em δ 76,9; 75,2; 67,7; 65,2; 61,9 e 59,9 foram atribuídos a carbonos de tripla ligação. Vale ressaltar que, com base no valor do deslocamento químico do carbono do grupo metila em d 3,8, este se encontra ligado a um carbono com hibridização sp, justificando a acentuada blindagem provocada pelo efeito anisotrópico deste tipo de ligação.¹² Esses dados, juntamente com as correlações observadas no mapa de contorno HMBC entre os hidrogênios em d 2,91(H-3a), 2,42 (H-3b), 4,46 (H-4) e 4,58 (H-5) com o carbono da carbonila (δ 177,9), em adição ao fragmento com m/z 83 (Figura 2), mostraram a presença de um anel b-lactônico na molécula. Um grupo hidroxila e uma unidade poliacetilênica constituída de três triplas ligações foram posicionados em C-4 e C-5, respectivamente. A estereoquímica relativa para os centros estereogênicos C-4 e C-5 foi determinada com base nos valores das constantes de acoplamento observadas para átomos de hidrogênio vicinais em lactonas de cinco membros, onde para hidrogênios que mantêm uma relação cis (~ 8,0 Hz) o valor da constante de acoplamento é maior do que trans (~ 6,0 Hz).¹³ Conforme pode ser observado na Tabela 1, os valores das constantes de acoplamento encontrados para H-4 e H-5 foram de 4,0 Hz, compatíveis portanto com a relação trans. Os dados espectrais discutidos acima permitiram identificar o composto 7 como sendo a lactona poliacetilênica rel-di-hidro-4b-hidróxi-5a(octa-2,4,6-triinil)furan-2-(5H)-ona.

O composto 8, cristais de cor lilás, teve sua fórmula molecular C₁₄H₁₆O₄ determinada por espectrometria de massa de alta resolução através do pico m/z 271,0941 [M+Na]⁺ (massa calculada 271,0946). Os espectros de RMN de ¹H e de ¹³C de 8 mostraram-se semelhantes a aqueles observados para 7, exceto pelos sinais correspondentes a um grupo etoxila, evidenciado pelos sinais de hidrogênios em δ 4,14 (dq, J = 7,1 Hz) e 1,11 (t, J = 7,1 Hz) e de carbonos em δ 60,7 e 14,6. No mapa de contorno HMBC, a correlação entre o sinal em δ 4,14 com o sinal em δ 172,7 revelou que 8 se tratava de um éster etílico derivado de 7, o qual pode ser um artefato, formado durante o processo de extração com EtOH.

Ambos os compostos 7 e 8 foram avaliados sobre várias linhagens de células tumorais humanas (SF-295, MDAMB-435, HCT-8 e HL-60), visto que em trabalho prévio uma lactona semelhante a 7 mostrou atividade citotóxica.³ No entanto, contrariando essa expectativa, nenhum dos compostos foi ativo.

CONCLUSÃO

A prospecção química de V. scorpioides resultou no isolamento de triterpenos, esteroides, um flavonoide e uma nova γ-lactona contendo uma cadeia lateral poliacetilênica. Uma lactona semelhante a esta foi previamente isolada a partir da espécie em estudo, no entanto, o que se costuma observar para plantas do gênero Vernonia é a presença de lactonas sesquiterpênicas, consideradas marcadores quimiotaxonômicos para o mesmo.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Disponível em http://quimicanova.sbq.org.br, em pdf e com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

Às instituições de fomento à pesquisa Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) e Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pelo auxílio financeiro e pelas bolsas de estudo e de pesquisa.

REFERÊNCIAS

1. Lorenzi, H.; Matos, F. J. A.; Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas, Plantarum: São Paulo, 2002.

2. Buskuhl, H.; Oliveira, F. L.; Blind, L. Z.; Freitas, R. A.; Barinson, A.; Campos, F. R.; Corilo, Y. E.; Eberlin, M. N.; Caramori, G. F.; Biavatti, M. W.; Phytochemistry 2010,71,1539.

3. Buskuhl, H.; Freitas, R. A.; Monache, F. D.; Barinson, A.; Campos, F. R.; Corilo, Y. E.; Eberlin, M. N.; Biavatti, M. W.; J. Braz. Chem. Soc. 2009,20, 1327; Kreuger, M. R. O.; Biavatti, M. W.; Pacheco, E. S.; Júnior, R. R. A.; Blind, L. Z.; Pedrini, R. D'A.; Rev. Bras. Farmacogn. 2008,19,353.

4. Monteiro, M. H. D.; Gomes-Carneiro, M. R.; Felzenszwalb, I.; Chahoud, I.; Paumgartten, F. J. R.; J. Ethnopharmacol. 2001,74, 149; Kambizi, L.; Afolayan, A. J.; J. Ethnopharmacol. 2001,77,5.

5. Erasto, P.; Grierson, D. S.; Afolayan, A. J.; J. Ethnopharmacol. 2006,106,117.

6. Rabe, T.; Mullholland, D.; van Staden, J.; J. Ethnopharmacol. 2002,80,91; Sy, G. Y.; Cissé, A.; Nongonierma, R. B.; Sarr, M.; Mbodj, N. A.; Faye, B.; J. Ethnopharmacol. 2005,98,171.

7. Dalazen, P.; Molon, A.; Biavatti, M. W.; Kreuger, M. R. O.; Rev. Bras. Farmacogn. 2005,15,82.

8. Carvalho, M. G.; Costa, P. M.; Abreu, H. S.; J. Braz. Chem. Soc. 1999,10, 163; Liu, J.; Ma, S.; Yu, S.; Lv, H.; Li, Y.; Wu, X.; Liu, Y.; Carbohydr. Res. 2010,345,1156; Fiseha, A.; Tadesse, M.; Bekele, T.; Bedemo, B.; Chem. Nat. Comp. 2010,46,692; Liu, Y.; Nugroho, A. E.; Hirasawa, Y.; Nakata, A.; Kaneda, T.; Uchiyama, N.; Goda, Y.; Shirota, O.; Morita, H.; Aisa, H. A.; Tetrahedron Lett. 2010,51,6584; Costa, F. J.; Bandeira, P. N.; Albuquerque, M. R. J. R.; Pessoa, O. D. L.; Nunes, E. P.; Nascimento, R. F.; Silveira, E. R.; Braz-Filho, R.; Quim. Nova 2008,31,1691.

9. Albuquerque, M. R. J. R.; Lemos, T. L. G.; Pessoa, O. D. L.; Nunes, E. P.; Nascimento, R. F.; Silveira, E. R.; Flavour Frag. J. 2007,22,249.

10. Mahato, S. B.; Kundu, A. P.; Phytochemistry 1994,37,1517.

11. Agrawal, P. K.; Carbon-13 NMR of Flavonoids, Elsevier: Amsterdan, 1989.

12. Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Introdução à Espectroscopia, 4ª ed., Cengage Learning: São Paulo, 2010.

13. Pretsch, E.; Buhlmann, P.; Affolter, C.; Structure Determination of Organic Compounds. Tables of Spectral Data, 3^rd ed., Springer: New York, 2000.

Recebido em 17/6/12; aceito em 13/11/12; publicado na web em 20/2/13

Material Suplementar

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Maio 2013
• Data do Fascículo
  2013

Histórico

• Recebido
  17 Jun 2012
• Aceito
  13 Nov 2012