Desenvolvimento de procedimento de extração para análise de sedativos e B-bloqueadores em rim suíno

Development of extraction procedure for analysis of sedatives and β-blockers in swine kidney

sedatives; B-blockers; swine kidney

ARTIGO

Desenvolvimento de procedimento de extração para análise de sedativos e β -bloqueadores em rim suíno

Development of extraction procedure for analysis of sedatives and β-blockers in swine kidney

Lenise G. de OliveiraI, ^*; Marcia H. S. Kurz^I; Fábio F. Gonçalves^I; Fabiano Barreto^II; Gabriel Rübensam^II; Rodrigo Hoff^II

^IEscola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, 95500-000 Santo Antônio da Patrulha - RS, Brasil

^IILaboratório Nacional Agropecuário, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 91785-340 Porto Alegre - RS, Brasil

ABSTRACT

A procedure was developed for determination of 5 sedatives and 14 β-blockers in swine kidney and subsequent analysis by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Three different procedures for extraction were tested, evaluated through recovery studies. The procedure using acetonitrile for extraction and cleanup with freezing at low temperature and dispersive solid phase extraction using 500 mg celite^® 545 before the concentration step presented the better results. The dried samples were redissolved with methanol and analyzed using a LC-MS/MS system with electrospray ionization (ESI) operating in positive MRM mode. The recovery values for this procedure were in the 75-88% range. The robustness of the method was tested against small variations. The method was used to analyze carazolol, azaperone and azaperol in collaborative assay, obtaining results close to designed value.

Keywords: sedatives; β-blockers; swine kidney.

INTRODUÇÃO

O Brasil é destaque mundial na produção de alimentos e, neste contexto, o setor de carnes vem crescendo gradativamente, impulsionado tanto pelo mercado interno quanto externo. Para suprir a demanda de mercado, o produtor pecuário nacional tem cada vez mais lançado mão de estratégias de manejo que primam pelo aumento do sucesso da cadeia produtiva de carne, pela melhoria do produto final e pela manutenção da saúde e bem-estar animal, conforme estabelecido nas Boas Práticas de Manejo (BPM).¹ O emprego de medicamentos veterinários tem se configurado como uma prática-chave ao longo das diferentes etapas de produção animal, pois reduz a incidência de doenças e melhora a qualidade de vida dos animais. No Brasil, as drogas veterinárias de maior emprego são as antiparasitárias e as antimicrobianas² devido, principalmente, ao regime de manejo (predominantemente extensivo) e às condições climáticas (temperatura e umidade elevada) dos locais de produção. No entanto, outras classes de drogas são usadas com fins mais específicos. Este é o caso dos sedativos e β-bloqueadores. Tais compostos têm sido usados principalmente em suínos com o objetivo primário de reduzir a atividade excessiva e ansiedade dos animais durante seu transporte, além de possibilitar o aumento da taxa de conversão alimentar e reduzir o aparecimento de carnes do tipo PSE, - Pale, Soft e Exudative, que significa pálida, mole e exsudativa.^3,4 Os suínos são animais extremamente suscetíveis ao estresse durante o transporte podendo vir a óbito em decorrência de complicações cardíacas.⁵ Assim, tanto os sedativos quanto os β-bloqueadores têm contribuído com a redução de perdas e a melhoria do bem-estar animal durante transporte. Entretanto, esses compostos apresentam a característica de acúmulo em tecidos, principalmente no rim e no fígado, e podem permanecer como resíduo nos alimentos caso a administração dos medicamentos seja feita poucas horas antes do abate.^6,7

No que diz respeito aos resíduos de medicamentos veterinários em alimentos, diversos órgãos oficiais, nacionais e internacionais, determinam, por meio de suas normativas, os Limites Máximos de Resíduos (LMR) que podem estar presentes nos alimentos, considerando a ingestão diária aceitável do composto (IDA), protegendo a saúde do consumidor e garantindo a segurança do alimento oferecido para consumo humano através de programas de monitoramento.⁸

As normas referentes a LMRs para resíduos de medicamentos veterinários do Mercado Comum do Sul (MERCOSUL) e Food and Drug Administration (FDA) não apresentam valores estabelecidos para sedativos e β-bloqueadores. Já o Programa Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes em Produtos de Origem Animal (PNCRC), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), o Codex Alimentarius e a Comunidade Europeia, por meio das suas normativas,^9-11 apresentam limites para alguns compostos destas classes. Estes limites estão descritos na Tabela 1.

O monitoramento destes resíduos só pode ser realizado se métodos analíticos que garantam resultados seguros estejam disponíveis. Faz-se necessário, portanto, que os procedimentos analíticos desenvolvidos sejam rápidos, fáceis e de baixo custo, viabilizando o monitoramento em larga escala.

Os primeiros métodos de extração descritos para análise de sedativos e β-bloqueadores utilizavam detectores do tipo ultravioleta (UV) e fluorescência (FL) associados à cromatografia, e necessitavam de grande quantidade de amostra e reagentes, envolvendo inúmeras etapas complexas e laboriosas.^12-18 No final dos anos 90, a utilização de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) ganhou espaço, permitindo a utilização de menor quantidade de amostra e solventes, além de possibilitar a análise de maior número de compostos e identificação inequívoca destes, mesmo em baixas concentrações.^5,19-27

Nos últimos anos, os métodos publicados têm apresentado muitas etapas de extração em comum. Basicamente, os procedimentos consistem na extração por solvente orgânico (geralmente, acetonitrila), separação extrato/matriz por centrifugação, seguida de evaporação sob fluxo de N₂ a temperatura controlada. Após retomada da amostra com solvente, o extrato é submetido à etapa de purificação por meio da técnica de Extração em Fase Sólida (SPE), utilizando diferentes sorventes como sílica, C18 e NH₂.

A determinação de 19 β-bloqueadores e 11 sedativos em tecido animal (rim, fígado e músculo suíno e músculo bovino) foi realizada usando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado à espectrometria de massas sequencial. As amostras foram extraídas com acetonitrila sob sonicação por 20 min a 40 °C. O sobrenadante foi centrifugado e o resíduo reextraído. Os sobrenadantes combinados foram concentrados em evaporador rotatório e redissolvidos para purificação. Cartuchos de fase reversa (Oasis HLB e C18) e de fase normal (sílica e NH₂) foram testados. A purificação usando cartuchos NH₂ apresentou melhores recuperações e menor efeito matriz.²⁵

Recentemente, foi desenvolvido um método para determinação de 25 β₂-agonistas e 23 β-bloqueadores em alimentos de origem animal (carne, fígado e rim de porco e amostras de frango). O método consistiu de hidrólise e extração com 10 mL de ácido tricloroacético 5% seguido de sonicação por 30 min. O meio fortemente ácido também proporcionou a desnaturação e precipitação de proteínas. A purificação consistiu na utilização de cartuchos de SPE mistos (C8 ou C18 combinados com trocador catiônico forte) (MCX) seguido de um passo de purificação adicional com metanol e análise por CLAE acoplado a espectrometria de massas ion trap linear.²⁷

Este trabalho consistiu no desenvolvimento de procedimento de extração adequado para determinação simultânea de resíduos de 5 sedativos (acepromazina, azaperol, azaperona, clorpromazina, xilazina) e 14 β-bloqueadores (acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carazolol, carvedilol, labtalol, metoprolol, nadolol, nebivolol, penbutolol, pindolol, propanolol, sotalol) em rim suíno e posterior análise por LC-MS/MS. O trabalho foi realizado em parceria com o Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO/RS), nas instalações do Laboratório de Resíduos de Pesticidas e Medicamentos Veterinários (RPM), que juntamente com demais laboratórios da rede do MAPA, integram a área técnica do PNCRC.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes e solventes

Os padrões analíticos dos compostos foram adquiridos de 3 diferentes fornecedores: Dr. Ehrenstorfer GmH (Alemanha), Sigma-Aldrich (EUA) e Fluka Analytical (EUA). Além dos compostos que fazem parte do estudo, também foram utilizados 3 padrões deuterados como padrões internos (acepromazina-d6, azaperona-d4 e carazolol-d7). Os dados referentes a pureza, coeficiente de partição octanol-água (log Kow) e fornecedor dos padrões utilizados neste trabalho estão descritos na Tabela 2.

Os solventes utilizados foram: acetonitrila (ACN) grau HPLC (Sulpra Solv, Alemanha), metanol (MeOH) grau HPLC (Tedia Brasil, Brasil) e água ultrapurificada com ultrapurificador de água Master System (Gehaka, Brasil). Sorvente celite® 545 P.A. foi adquirido da empresa Impex (Brasil), cloreto de sódio 99% P.A. da empresa Dinamica (Brasil) e gás nitrogênio 99,996% da empresa IBG (Brasil).

EQUIPAMENTO

O sistema LC-MS/MS utilizado consistiu em um cromatógrafo Agilent série 1260 (Agilent, EUA), acoplado a um espectrômetro de massas QTrap 5500 (ABSciex, EUA), equipado com uma fonte de ionização por eletronebulização (ESI) operada no modo positivo. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna Poroshell 120 EC-C18 (3,0 x 50 mm, 2,7 µm) provida pela Agilent. Os dados foram adquiridos e tratados utilizando o sistema de aquisição Analyst 1.6.2 (ABSciex).

Preparo das soluções analíticas

As soluções estoque de 1000 mg L^-1 foram preparadas individualmente em metanol e armazenadas em frascos de polipropileno revestidos com papel alumínio para evitar degradação, e armazenados em freezer a -20 ºC.

A solução intermediária foi preparada a partir da diluição de cada solução estoque com metanol, de forma a obter uma solução com todos os analitos na concentração de 10 mg L^-1. A solução dos padrões internos (10 mg L^-1) foi preparada de forma similar, exceto para carazolol e carazolol-d7 cujas concentrações finais foram 5 mg L^-1. A partir das soluções intermediárias, foram preparadas soluções de trabalho ou soluções de fortificação com concentrações de 1 mg L^-1, exceto para carazolol e carazolol-d7 (0,5 mg L^-1), sempre em metanol.

Estudo de estabilidade

A estabilidade foi verificada a partir da análise dos compostos em solução e extrato.

Para a determinação da estabilidade em solução, foram analisadas as soluções de fortificação (1 mg L^-1) preparadas semanalmente, de forma a obter tempo de armazenamento de aproximadamente 5 semanas. Três alíquotas de cada solução foram diluídas para obtenção de solução com concentração correspondente a 20 µg L^-1 e injetadas para obtenção de média. O cálculo da concentração do analito em cada solução analisada foi realizado por comparação com a solução de mesma concentração teórica recém diluída, que foi considerada 100%, conforme Equação 1.

na qual AR corresponde a variação do analito remanescente, C_i é a concentração média da solução e C_nova é a concentração média da solução nova.

Para determinação da estabilidade do analito em extrato, foi realizado fortificação em extrato obtido de amostra branca, sendo analisado no dia do preparo e 24 h após o preparo. Durante este período, elas permaneceram a uma temperatura de 20 °C em frasco de polipropileno. Foi utilizado o mesmo cálculo descrito anteriormente, onde C_nova será a concentração obtida na análise realizada no dia do preparo.

Amostras

As amostras brancas de rim suíno foram obtidas junto a estabelecimentos sob Serviço de Inspeção Federal (SIF) do MAPA. Foram retiradas pequenas porções da parte externa do órgão, já isento de cápsula fibrosa, e processadas até homogeneização com auxílio de processador de amostras. A amostra foi acondicionada e mantida em freezer a -20 °C, em recipiente plástico, para posterior utilização.

Otimização do método por LC-MS/MS

Condições cromatográficas

A escolha da fase móvel foi realizada inicialmente através de revisão bibliográfica. Foi utilizado (A) solução aquosa acidificada com 0,1% de ácido fórmico (v/v) e (B) metanol acidificado com 0,1% de ácido fórmico (v/v).²⁵

Também foi testada a seguinte composição: (A) solução aquosa acidificada com 0,1% de ácido fórmico (v/v) e (B) acetonitrila acidificada com 0,1% de ácido fórmico (v/v).

Sistema de detecção

Para otimização dos parâmetros dependentes do composto, inicialmente foi realizado infusão dos compostos em solvente na concentração de aproximadamente 200 µg L^-1 com o objetivo de selecionar no mínimo 2 fragmentos (íons produto) de maior intensidade ou seletividade para cada analito, sendo o mais intenso utilizado como íon quantificador e o segundo como qualificador. Para otimização dos parâmetros dependentes da fonte de ionização foram realizados os experimentos de injeção em fluxo (Flow Injection Analysis, FIA) visando obter as melhores condições para o conjunto de compostos.

Desenvolvimento e otimização dos procedimentos de extração

Três métodos de extração foram propostos com o objetivo de verificar qual apresentaria melhor recuperação, além de produzir extratos com menor concentração possível de coextrativos para análise de sedativos e β-bloqueadores em rim suíno por LC-MS/MS.

Procedimento 1

O procedimento 1 consistiu na pesagem de 5 g de amostras brancas em tubos de polipropileno com capacidade para 50 mL e fortificadas na concentração de 10 µg kg^-1 (apenas A1, A2 e A3). Após homogeneização em vórtex por 20 s, foi realizada adição de 2 mL de água ultrapura e 10 mL de acetonitrila. As amostras foram trituradas e homogeneizadas em ultra-turrax e, em seguida, agitadas em mesa agitadora a 180 rpm por 20 min. Após agitação foi adicionado 2,5 g de NaCl, seguido de nova agitação por 5 min nas mesmas condições anteriores. As amostras foram centrifugadas a 5670 g por 5 min a 5 °C, o sobrenadante foi transferido para tubo de polipropileno de 15 mL e acondicionado em freezer a -20 °C por 1 h. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 5670 g e 0 °C por 20 min, o sobrenadante foi transferido para tubo de polipropileno de 50 mL e evaporado até secura sob fluxo de N₂ a 50 °C.

As amostras secas foram fortificadas na concentração de 10µg kg^-1 (apenas B1, B2 e B3) e retomadas com metanol obtendo-se volume de 1 mL, agitadas em vórtex por 20 s e transferidas para tubos eppendorf para centrifugação a 16200 g por 10 min a 0 °C. Após centrifugação, as amostras foram transferidas para frasco com capacidade para 2 mL e analisadas por LC-MS/MS.

Procedimento 2

O procedimento 2 consistiu na pesagem de 2 g de amostras brancas em tubos de polipropileno com capacidade para 50 mL e fortificadas na concentração de 10 µg kg^-1 (apenas A1, A2 e A3). Após homogeneização em vórtex por 20 s, foi adicionado 10 mL de acetonitrila. Com auxílio de ultra-turrax as amostras foram trituradas e homogeneizadas. Em seguida, foram colocadas em mesa agitadora por 20 min a 180 rpm. Após agitação, as amostras foram centrifugadas a 5670 g por 5 min a 5 °C. Os sobrenadantes foram transferidos para tubo de polipropileno de 15 mL e acondicionados em freezer a -20 °C por uma hora. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 5670 g por 20 min a 0 °C. O sobrenadante foi transferido para tubo de polipropileno de 50 mL e evaporado até secura sob fluxo de N₂ a 50 °C.

As amostras secas foram fortificadas na concentração de 10 µg kg^-1 (apenas B1, B2 e B3) e retomadas com metanol obtendo-se volume de 1 mL, agitadas em vórtex por 20 s, transferidas para tubos eppendorf contendo 250 mg de celite® 545 e novamente homogeneizadas em vórtex por 20 s. Após homogeneização, as amostras em tubos eppendorf foram centrifugadas a 16200 g por 20 min a 0 °C e transferidas para frasco com capacidade para 2 mL para posterior análise por LC-MS/MS.

Procedimento 3

Este procedimento consistiu na pesagem de 2 g de amostras brancas, previamente homogeneizadas, em tubos de polipropileno com capacidade para 50 mL e fortificadas na concentração de 10 µg kg^-1 (apenas A1, A2 e A3), seguido de adição de 10 mL de acetonitrila. Com auxílio de ultra-turrax as amostras foram trituradas e homogeneizadas. Em seguida, foram colocadas em mesa agitadora e agitadas por 20 min a 180 rpm. Após agitação, as amostras foram centrifugadas a 5670 g por 5 min a 5 °C, o sobrenadante foi transferido para tubo de polipropileno de 15 mL e acondicionado em freezer a -20 °C por uma hora. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 5670 g por 20 min a 0 °C e o sobrenadante foi transferido para novo tubo de polipropileno de 15 mL contendo 500 mg de celite® 545. As amostras foram agitadas em vórtex por 20 s e novamente submetidas a centrifugação a 5670 g por 20 min a 0 °C. Uma alíquota de 1 mL foi transferida para tubo de polipropileno de 50 mL e evaporada a 50 °C, sob fluxo de N₂ até secura. As amostras foram fortificadas na concentração de 10 µg kg^-1 (apenas B1, B2 e B3), e retomadas em metanol obtendo-se volume de 300 µL, agitadas em vórtex por 20 s e transferidas para frasco com insert fixo com capacidade para 300 µL para posterior análise por LC-MS/MS.

A Tabela 3 apresenta uma comparação entre os 3 procedimentos propostos, salientando-se as principais diferenças entre eles.

Avaliação dos procedimentos de extração

Recuperação

A avaliação da eficiência dos procedimentos empregados (procedimentos 1, 2 e 3) consistiu na análise das recuperações obtidas para cada composto e também análise das amostras brancas obtidas, de forma a verificar presença de interferentes que prejudicariam a quantificação dos compostos. Para isso, foi utilizado amostras brancas fortificadas na concentração desejada (10 µg kg^-1) antes da extração (denominadas A1, A2 e A3), e extratos de amostras brancas fortificadas no final do processo de extração (denominadas B1, B2 e B3), além da análise de amostra branca.

Robustez

O estudo da robustez foi realizado utilizando a abordagem de Youden, que consiste em uma análise multivariada de variáveis, as quais quando testadas nas condições normais são identificadas por letras maiúsculas e quando alteradas, por letra minúscula. O desvio padrão obtido foi utilizado para análise dos testes realizados.²⁸

Esta abordagem foi utilizada para avaliar a variação produzida pelos seguintes fatores: tipo de fase móvel, aditivo utilizado na fase móvel, temperatura de evaporação, analista, forma de homogeneização das amostras e quantidade de sorvente em amostras brancas fortificadas na concentração de 10 µg kg^-1 utilizando procedimento selecionado para análise de sedativos e β-bloqueadores em rim suíno, conforme Tabela 4.

Aplicabilidade do procedimento

A aplicabilidade do procedimento foi testada através de análise de amostras de rim suíno enviadas pela Canadian Food Inspection Agency para determinação de carazolol, azaperona e azaperol, em ensaio colaborativo.

Cinco amostras foram recebidas em embalagem devidamente identificada e lacrada, sendo que uma delas consistia em branco de rim suíno, portanto isenta dos analitos, para construção de curva de calibração.

A estimativa da reprodutibilidade dos procedimentos utilizados pelos diferentes laboratórios é dada pela avaliação do Z-Score, que considera os resultados enviados por cada um dos laboratórios e os desvios padrão obtidos no ensaio colaborativo, conforme Equação 2.

na qual x corresponde ao resultado de cada participante, X à concentração atribuída e σp ao desvio padrão obtido no ensaio colaborativo.

Valores de Z-Scores inferiores a 2 são considerados satisfatórios, entre 2 e 3 questionáveis e superiores a 3 insatisfatórios.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Otimização do método por LC-MS/MS

Condições cromatográficas

Dois tipos de fases móveis foram testadas durante o processo de otimização do método. Inicialmente foi utilizada fase móvel que consistia em (A) solução aquosa acidificada com 0,1% ácido fórmico (v/v) e (B) acetonitrila 0,1% ácido fórmico (v/v). Esta fase móvel foi utilizada com o objetivo de garantir limpeza eficiente da coluna, assegurando sua vida útil. Os resultados obtidos nas análises utilizando esta fase móvel foram satisfatórios e reprodutíveis, porém, com resolução insatisfatória para os picos do atenolol e sotalol, além de tempo de eluição de aproximadamente 1 minuto para a maioria dos compostos.

A segunda fase móvel utilizada consistiu em (A) solução aquosa acidificada com 0,1% ácido fórmico (v/v) e (B) metanol 0,1% ácido fórmico (v/v). Os resultados obtidos foram satisfatórios, reprodutíveis, com picos bem resolvidos para atenolol e sotalol, resultando em tempo de eluição dos analitos de aproximadamente 3 minutos (Figura 1). A utilização desta fase móvel apresenta como única desvantagem eluição de maior quantidade de coextrativos, porém, nenhum destes coelui com os analitos. O aumento do tempo de retenção de compostos coextraídos é compatível com o comportamento de aumento de tempo de retenção dos analitos.

O tempo necessário para análise cromatográfica de todos os compostos por LC-MS/MS foi de 8 minutos, seguido de 2 minutos de equilíbrio, resultando em um tempo total de 10 minutos para cada injeção de amostra.

As condições cromatográficas utilizadas para análise de resíduos de sedativos e β-bloqueadores em rim suíno por LC-MS/MS estão descritas na Tabela 5.

Sistema de detecção

Os parâmetros definidos para análise de sedativos e β-bloqueadores foram obtidos na etapa de infusão dos analitos e otimização usando FIA, os quais são otimizados automaticamente pelo software Analyst.

Os parâmetros da fonte de ionização por eletronebulização no modo positivo que foram usados neste método são gás de colisão high, voltagem do Spray eletrônico de 5500 volts, temperatura de 700 °C, gás de nebulização e gás auxiliar de 55 psi, e gás de cortina de 30 volts.

Os parâmetros do espectrômetro de massas e tempos de retenção dos compostos estão decritos na Tabela 6.

No decorrer da otimização dos procedimentos de extração, alguns analitos apresentaram relação sinal/ruído baixos, já que estavam em matriz e não mais em solvente. Para estes compostos foi realizada nova otimização, desta vez manual, para garantir fragmentação eficiente do íon precursor e seleção de fragmentos que apresentassem maior seletividade.

Estudo de estabilidade

No estudo de estabilidade, admite-se variação de até 15%²⁹ nos resultados obtidos, sendo que para valores acima ou abaixo considera-se que a substância é instável a partir do período avaliado. A estabilidade das soluções de fortificação preparadas para análise de sedativos e β-bloqueadores, armazenadas a -20 °C, no escuro, foram monitoradas durante cinco semanas e foi possível observar que todos os compostos permaneceram estáveis neste período. Os resultados de concentração obtidos variaram entre 4 e 8%.

No estudo de estabilidade dos compostos em extrato, as amostras foram analisadas no dia do preparo e após 24 h. A variação dos resultados obtidos ficou entre 2 e 14%, exceto para carvedilol em que o resultado variou cerca de 27%.

Assim, considera-se que os analitos são estáveis tanto em solução quanto no extrato no período avaliado, com exceção do composto carvedilol em extrato na temperatura de 20 °C.

Otimização do procedimento de extração

A etapa de extração dos compostos é uma das mais relevantes, devido à complexidade da matriz e os baixos níveis de concentração desejados.

A matriz, rim suíno, é constituída basicamente por cerca de 80% de água, 16% de proteínas, 3% de gorduras totais, e 1% de vitaminas e minerais.³⁰ Além disso, conforme mostrado na Tabela 2, o coeficiente de partição octanol água dos analitos varia de 0 a 4.³¹

A utilização de acetonitrila é uma opção interessante, pois permite a extração de compostos com faixa de polaridade mais ampla, quando comparado a outros solventes como acetato de etila, acetona, metanol, água, entre outros. A adição de sal, além de possibilitar a retirada de água do sistema, tem efeito salting out, transferindo os analitos da fase aquosa para fase orgânica.³²

Para a retirada de proteínas e gorduras da amostra, um procedimento bastante comum como alternativa de purificação é o congelamento do extrato da amostra à baixa temperatura (-20 °C), pois auxilia na precipitação destes interferentes, os quais podem ser posteriormente removidos do extrato por centrifugação.³³

Outra prática, que substituiria a SPE, corresponde à Dispersão em Fase Sólida, d-SPE, que consiste na utilização de sorvente que atua como filtro na retirada de coextrativos. A utilização desta técnica é uma alternativa simples e rápida, em que a adição do sorvente escolhido é realizada diretamente no extrato, seguido de agitação para homogeneização da amostra e centrifugação para separação extrato/sorvente.^34,35

Quando se deseja determinar concentrações muito baixas, uma etapa de pré-concentração do extrato torna-se necessária. Uma opção interessante e viável, em substituição à SPE, seria a evaporação à temperatura controlada, sob fluxo de nitrogênio.

Recuperação

Tendo em vista as características da matriz e dos compostos, os procedimentos foram propostos com o intuito de garantir a máxima extração dos analitos e limpeza eficiente do extrato, para posterior análise por LC-MS/MS. A Tabela 7 apresenta os resultados de recuperação obtidos para os 3 procedimentos propostos.

O procedimento 1 proporcionou recuperações baixas para atenolol, nadolol e sotalol (19%, 26% e 47%, respectivamente). Estes compostos apresentam log Kow muito próximo de zero, portanto, é provável que a etapa de partição tenha sido ineficiente e os compostos tenham sido removidos do extrato juntamente com a água. Para os demais analitos, o procedimento apresentou recuperações que variaram entre 56 e 110%.

A utilização de menor quantidade de amostra no procedimento 2 permitiu a quantificação de todos os analitos, porém apresentando como grande vantagem a obtenção de extrato mais límpido. Neste procedimento foi possível observar uma melhora significativa nas recuperações obtidas para atenolol, nadolol e sotalol, que foram de 54%, 58% e 60% respectivamente, provavelmente devido à retirada da etapa de partição. Com isso, o extrato foi evaporado contendo a água oriunda da matriz. Cabe ressaltar que este procedimento se tornou bastante oneroso devido ao tempo gasto para evaporação do extrato obtido (cerca de 11 mL), que permaneceu sob fluxo de nitrogênio, a 50 °C, por cerca de 3 a 4 horas. Para os demais compostos, as recuperações obtidas ficaram entre 65 e 84%.

O procedimento 3 consistiu no procedimento 2 otimizado, com o objetivo principal de reduzir o tempo de análise (pela diminuição no tempo de evaporação), além de diluir a amostra, reduzindo a quantidade de coextrativos a serem inseridos no sistema cromatográfico. Para isso, a etapa de purificação utilizando celite® 545 foi antecipada, sendo realizada logo após a precipitação de proteínas à baixa temperatura. Uma alíquota de 1 mL do extrato foi retirada para evaporação sob fluxo de N₂ a 50 °C. Esta otimização reduziu significativamente o tempo de evaporação para cerca de 20 min. As recuperações obtidas neste procedimento foram satisfatórias para todos os compostos, proporcionando valores de recuperação entre 75 e 88%.

Portanto, o procedimento 3 descrito foi escolhido para análise de sedativos e β-bloqueadores em rim suíno devido suas vantagens de custo, praticidade e valores de recuperações satisfatórios para todos os compostos.

Procedimento de extração para análise de sedativos e β -bloqueadores

O procedimento 3 selecionado consistiu em extração simples com solvente orgânico, seguido de etapas de purificação à baixa temperatura e d-SPE, além de etapa rápida de concentração da amostra sob fluxo de N₂ e, por fim, retomada da amostra para posterior análise por LC-MS/MS. O tempo total do procedimento de extração foi de no máximo 5 horas para cerca de 50 amostras, o que corresponde a aproximadamente 6 minutos por amostra.

A utilização de acetonitrila na etapa de extração permitiu recuperações satisfatórias para todos os compostos, independente de sua polaridade, além de reduzir a extração de coextrativos presentes no rim suíno, principalmente gorduras, quando comparado ao uso de solventes como metanol. O uso de homogenizador mecânico aumenta significativamente a superfície de contato solvente/matriz, permitindo melhor extração dos compostos. O uso de mesa agitadora por 20 minutos teve como principal objetivo favorecer a precipitação de proteínas, enquanto a posição dos tubos no sentido horizontal favorece a agitação. A última etapa, de centrifugação, é necessária para separar o extrato da matriz para posterior etapa de purificação.

Na etapa de purificação, dois procedimentos simples foram empregados. A precipitação de proteínas à baixa temperatura é uma alternativa de purificação bastante difundida. Após uma hora já foi possível observar a deposição de quantidade significativa de proteínas que ficaram retidas no fundo do tubo após centrifugação. A adição de celite® 545 como sorvente para d-SPE teve como objetivo retirar principalmente gordura, além de proteínas e fosfolipídios, que podem estar presentes nesta matriz e que são coextrativos de difícil remoção. A grande vantagem na utilização deste sorvente está relacionado ao baixo custo se comparado a sorventes como C18 e PSA.

A etapa de concentração consiste na utilização de recurso simples de evaporação sob temperatura controlada e fluxo de N₂. Este procedimento é bastante rápido e eficiente, e é necessário já que os níveis de concentração a serem alcançados neste procedimento são significativamente baixos.

Robustez

O estudo da robustez tem por objetivo demonstrar que o procedimento em questão apresenta resultados confiáveis, mesmo quando sujeito a pequenas variações como diferentes fabricantes de insumos, colunas cromatográficas, concentrações de fase móvel, entre outros.³⁶

Uma alternativa sugerida pela 2002/657/CE³⁷ seria a verificação da robustez por meio da abordagem de Youden.²⁸

A Tabela 8 apresenta os resultados de desvio padrão relativo obtidos no estudo de robustez utilizando o procedimento 3.

Considerou-se 30% como desvio aceitável no estudo de robustez devido a complexidade da matriz e o baixo valor de concentração (10 µg kg^-1). Os desvios obtidos para a maioria dos compostos foram inferiores a 20%. Também foi possível observar por meio dos dados estatísticos que a quantidade de sorvente utilizado (d) corresponde ao fator que apresentou maior influência sobre os desvios obtidos para penbutolol e nebivolol, enquanto que para atenolol, o desvio padrão obtido é influenciado principalmente pela utilização de menor temperatura de evaporação (c) e de vórtex (f) no processo de extração.

Cabe salientar que foram propostas alterações mais robustas que o recomendado (redução de 50% da quantidade de sorvente, por exemplo). Por este motivo, é possível afirmar que os fatores estudados não afetaram significativamente o desempenho do procedimento, permitindo concluir que o mesmo foi robusto a estas alterações.

Aplicabilidade do procedimento

A Tabela 9 apresenta os valores admitidos como reais das amostras, emitidos pela agência canadense, os valores emitidos pelos demais laboratórios participantes e os obtidos utilizando o procedimento desenvolvido neste trabalho com seu respectivo valor de Z-Score.

Analisando os resultados e os valores de Z-Scores, é possível concluir que o procedimento é adequado para análise de azaperona, azaperol e carazolol em rim suíno, apresentando valores muito próximos do esperado, sendo classificado como satisfatório para a maioria das amostras. Apenas a análise de carazolol na amostra XP 1319 apresentou valor de Z-Score na faixa considerada questionável, porém, devido ao tempo em que amostra permaneceu armazenada (cerca de 9 meses) até realização da análise é possível considerar como satisfatório o resultado obtido.

Este procedimento será validado conforme as normas do MAPA³⁶ e incluído no PNCRC para monitoramento de sedativos e β-bloqueadores em amostras de rim suíno.

Posteriormente, o escopo do método será ampliado para outras matrizes de origem animal.

CONCLUSÃO

Foi demonstrado o desenvolvimento de um procedimento para extração dos resíduos de 5 sedativos e 14 β-bloqueadores em rim suíno. O procedimento foi considerado adequado para a produção de um extrato compatível com sistema de LC-MS/MS. O tempo do procedimento de extração foi de aproximadamente 6 minutos por amostra por analista.

O procedimento também foi considerado robusto e passível de ser prontamente implementado em outras unidades laboratoriais.

A utilização de pequena quantidade de solvente e de sorvente estão de acordo com a necessidade de geração mínima de resíduos, atendendo, portanto, aos princípios da Química Verde.

Dessa forma, o procedimento desenvolvido neste trabalho mostrou-se simples, rápido, prático, robusto e de baixo custo, sendo uma alternativa altamente viável aos procedimentos de extração que utilizam SPE como etapa de purificação.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Rio Grande e ao Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental por oportunizar o desenvolvimento deste trabalho em conjunto com o Laboratório Nacional Agropecuário- LANAGRO/RS ao qual agradeço pela disponibilidade de estrutura e equipamentos, além de esforço incansável de todos os seus colaboradores para a realização deste trabalho.

Recebido em 13/02/2014

Aceito em 07/05/2014

Publicado na web em 15/07/2014

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Out 2014
• Data do Fascículo
  2014

Histórico

• Aceito
  07 Maio 2014
• Recebido
  13 Fev 2014