Espécies ativas de oxigênio na resposta de defesa de plantas a patógenos

Reactive oxygen species on plant defense responses to pathogens

REVISÃO / REVIEW

Espécies ativas de oxigênio na resposta de defesa de plantas a patógenos

Reactive oxygen species on plant defense responses to pathogens

Mário Lúcio V. Resende; Sônia M. L. Salgado; Zuleide M. Chaves

Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Cx. Postal 37, Lavras, MG, CEP 37200-000, e-mail: [e-mail]

RESUMO

A explosão oxidativa é uma resposta de defesa da planta após o reconhecimento do patógeno, conduzindo à reação de hipersensibilidade (HR). Esta resposta é devido à geração de espécies ativas de oxigênio (ROS ou EAO's), tais como H₂O₂, O₂^–, e OH^– As espécies ativas de oxigênio possuem várias funções na resposta de defesa da planta. Peróxido de higrogênio (H₂O₂) pode ser diretamente tóxico ao patógeno e está envolvido com o fortalecimento da parede celular, uma vez que o H₂O₂ é necessário para a biossíntese de lignina. Peróxido de hidrogênioatua também como mensageiro secundário, sendo responsável pela ativação da hidrolase do ácido benzóico, enzima responsável pela conversão do ácido benzóico em ácido salicílico. A explosão oxidativa não está confinada somente à HR macroscópica, uma vez que explosões oxidativas secundárias poderão ocorrer nos tecidos distantes, causando micro-HR's e conduzindo à resistência sistêmica adquirida (SAR), a qual é mediada pelo ácido salicílico como um sinal. Portanto, a ocorrência de HR e SAR é dependente da cascata de sinalização derivada da explosão oxidativa, que por sua vez é um evento inicial na resposta da planta contra a invasão do patógeno.

Palavras-chave adicionais: resistência, explosão oxidativa, HR, SAR.

ABSTRACT

Oxidative burst is a very quick plant defense response after pathogen recognition, leading to hypersensitive reaction (HR). This response is due to generation of reactive oxygen species (ROS), such as H₂O₂ , O₂^–, and OH^–. Several roles in plant defense have been proposed for ROS. Hidrogen peroxide (H₂O₂), apart from being directly toxic to pathogens, is also involved in cell wall strengthening, since it is necessary for lignin biosynthesis. Hidrogen peroxide acts as a second messenger, being responsible for the activation of the benzoic acid 2-hydrolase, enzyme responsible for benzoic acid conversion to salycilic acid. Oxidative burst is not only confined to the macroscopic site of HR, since secondary bursts can occur in distant tissues, causing micro-HR's and leading to systemic acquired resistance (SAR), which is mediated by salycilic acid as a signal. Therefore, occurrence of both HR and SAR are dependent on signaling cascades derived from oxidative burst, as an early event in plant response against pathogen invasion.

INTRODUÇÃO

As interações planta-patógeno são classificadas em compatíveis (patógeno virulento e hospedeiro suscetível) e incompatíveis (patógeno avirulento e hospedeiro resistente). Nas interações incompatíveis, o sistema de defesa da planta é eficientemente ativado, conduzindo à resistência, mas é tardiamente ativado ou não ativado em interações compatíveis, condicionando a doença. A presença de um gene de resistência, dominante na planta (R) e um gene de avirulência dominante no patógeno (Avr) condiciona a incompatibilidade em interações gene-a-gene.

A infecção por patógenos avirulentos induz uma série de respostas de defesa freqüentemente resultando no colapso localizado de células vegetais conhecido como reação de hipersensibilidade (HR) (Stakawicz et al., 1995). Nessa reação, há a produção de intermediários reativos de oxigênio, conhecidos como 'Reactive Oxygen Intermediates' (ROI) ou 'Reactive Oxygen Species' (ROS), ou ainda 'Espécies Ativas de Oxigênio' (EAO's), incluindo o O₂^.–, H₂O₂ e OH^. (Hegedus et al., 2001).

A explosão oxidativa participa de um sistema integrado e amplificado de sinalização, que envolve o ácido salicílico e cálcio (Ca²⁺) citosólico no disparo dos mecanismos de defesa (Lamb & Dixon, 1997). O desenvolvimento da HR, inicialmente desencadeado pela presença de espécies ativas de oxigênio, promove o estabelecimento gradual da resistência sistêmica adquirida (SAR) (Alvarez et al., 1998).

Na presente revisão, procurou-se abordar aspectos da explosão oxidativa como a química da produção de espécies ativas de oxigênio, EAO's e a patogênese em plantas, mecanismos envolvidos na explosão oxidativa, funções das EAO's na planta e sua quantificação durante a interação planta-patógeno.

QUÍMICA DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO

Simplificadamente, a partir do O₂, os agentes de explosão oxidativa são:

O oxigênio molecular (O₂) é relativamente não reativo e não tóxico, devido a estrutura estável dos elétrons na sua camada externa. Entretanto, alterações na distribuição dos elétrons podem provocar a sua ativação e influenciar os sistemas biológicos. As EAO's podem ser geradas dentro das plantas como resultado da excitação ou um "leve toque" no elétron externo, formando oxigênio simples (¹O₂) ou de uma sucessiva adição de elétrons ao oxigênio molecular produzindo O₂^.–, H₂O₂ e OH^. (Figura 1). Essas moléculas, descritas a seguir, são consideradas "ativas" porque não necessitam da entrada de energia para reagir com outras moléculas.

Superóxido (O₂^.–): pode ser produzido na planta por meio de vários mecanismos, inclusive pela ativação de NADPH-oxidases/sintases ligadas à membrana, peroxidases (POX) da parede celular, lipoxigenases (LOX) e como resultado da transferência de elétrons da mitocôndria ou do cloroplasto. Normalmente, oxida várias moléculas orgânicas, como o ascorbato, ou como redutor de metais como Fe³⁺, nas reações de Haber-Weiss ou Fenton (Breusegem et al., 2001).

Peróxido de hidrogênio (H₂O₂):a maioria do H₂O₂ celular surge da dismutação do O₂^.– catalisada pela SOD (Tabela 1). Peróxido de hidrogênioé um oxidante relativamente estável e ausente de carga, o que pode facilitar a passagem através da camada bilipídica da membrana celular. Essa capacidade de difundir-se rapidamente através da membrana celular favorece a rápida elicitação da resposta vegetal (Apostol et al., 1989).

Radical hidroxila (OH): embora os radicais hidroxila tenham meia-vida curta (< 1 ms), são radicais potencialmente fortes e com alta afinidade à biomoléculas no seu sítio de produção (Halliwell & Gutteridge, 1989), o que dificulta o estudo desses radicais.

Oxigênio simples (¹O₂): semelhante aos radicais hidroxila, os ¹O₂ têm aproximadamente 2 ms de vida e são altamente destrutivos, reagindo com a maioria das moléculas biológicas (Foyer et al., 1994), porém a maioria dos danos são próximos aos sítios onde são produzidos. São predominantemente gerados nos cloroplastos, através da transferência de energia de uma clorofila foto-excitada para o elétron do oxigênio molecular. ¹Oxigênio simples reage facilmente com ligações duplas e têm alta afinidade com "dienos" na membrana e aminoácidos específicos como histidina, metionina, triptofano e cisteína.

O acúmulo de H₂O₂ pode depender de duas etapas consecutivas: redução do O₂ molecular a O₂^– seguida pela dismutação espontânea ou catalisada de O₂^– a H₂O₂. A enzima SOD catalisa uma conversão altamente eficiente de O₂^–/^.HO ₂ a H₂O₂, numa velocidade 10¹⁰ vezes maior que na reação espontânea.

EAO's E A PATOGÊNESE EM PLANTAS

Os primeiros estudos enfocando as EAO's na defesa vegetal, foram realizados por Doke (1983), na década de 80, muito embora a produção de radicais de oxigênio já tivesse sido constatada em células do sistema imunológico humano (Baldridge & Gerard, 1933). Doke (1983) e Doke & Ohashi (1988) publicaram os primeiros relatos da produção de O₂^– nas interações incompatíveis nos patossistemas batata (Solanum tuberosum L.)-Phytophthora infestans (Mont.) de Barye fumo (Nicotiana tabacum L.) -vírus do mosaico do fumo (Tobacco mosaic virus, TMV).

As EAO's ocorrem durante o contato inicial entre o patógeno e a célula vegetal mas podem também ser produzidas e apresentar um papel sutil nos estádios posteriores da patogênese. Durante a interação planta-patógeno a produção de EAO's acontece em três fases: na fase I ocorre o reconhecimento dos elicitores provenientes do patógeno, que podem ser carboidratos, proteínas ou porções de glicoproteínas. Esse reconhecimento dispara os eventos de transdução de sinais. Durante a fase II são iniciados vários processos relacionados à defesa, mas não identificados por sintomas visíveis. Os processos ou vias metabólicas dessa fase são resultantes do reconhecimento durante a fase I, e nesses processos de defesa incluem-se aumento de antioxidantes, ação de lipoxigenases, a HR, produção de fitoalexinas, lignificação e SAR. A fase III compreende o processo de evolução da patogênese levando ao desenvolvimento de sintomas visíveis. A diferenciação da patogênese em três fases distintas é apenas um artifício para compreensão de como ocorrem tais processos. Na natureza, dependendo das interações, ocorrerá uma sobreposição dos eventos fisiológicos (Baker & Orlandi, 1999).

MECANISMOS ENVOLVIDOS NA EXPLOSÃO OXIDATIVA

Mecanismos indutores da produção de EAO's

Injúrias no tecido vegetal e processos oxidativos normais da célula são provavelmente responsáveis pela geração de O₂^–. Durante o transporte de elétrons (e^–)nos cloroplastos e mitocôndrias, muitos desses e^– são perdidos, e então captados pelo O₂ formando O₂^– (Leshem, 1988, citado por Goodman & Novacky, 1994).

Fatores abióticos tais como UV B (280 a 320 nm), extremos de temperatura, poluentes, estresse osmótico e mecânico, podem aumentar a produção de EAO's. Contudo, os elicitores mais efetivos são macromoléculas derivadas do patógeno que se ligam a receptores na superfície da célula vegetal (Allan & Fluhr, 1997).

Segundo Hammond-Kosack & Jones (1996), provavelmente, o ozônio (O₃) ou UV–B, sinalizadores não específicos, induzem o acúmulo de EAO's. Isso foi confirmado recentemente por Wohlgemuth et al. (2002) ao verificarem que o O₃ induziu a produção e acúmulo de H₂O₂ em plantas de fumo e tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), e H₂O₂ e O₂^– em Arabidopsis sp. Neste estudo, a geração e acúmulo de H₂O₂ e/ou O₂^– foi dependente da espécie e cultivar da planta, apesar de ambas EAO's estarem envolvidas na indução da morte celular.

Duas fases de indução de EAO's por elicitores fúngicos e bacterianos tem sido avaliadas em culturas de células vegetais. A fase I corresponde a aquela de resposta muito rápida (poucos minutos) (Baker & Orlandi, 1995). Embora a produção de EAO's na fase I, possivelmente envolva uma interação elicitor-receptor, as respostas nem sempre são correlacionadas com resistência a fitodoenças, podendo também ocorrer em interações compatíveis. Na 2ª fase de produção de espécies ativas de oxigênio ocorre uma explosão mais forte e prolongada, que está diretamente correlacionada com a resistência da planta ao patógeno, provocando a morte localizada de células (HR) e, portanto, essa fase é característica das interações incompatíveis (Dangl et al., 2000).

Elicitores derivados do patógeno provocam uma biossíntese muito rápida de EAO's (menos de 5 min), que requer Ca⁺⁺ externo e a ativação de canais de íons. Contrariamente, bactérias avirulentas provocam uma pequena explosão oxidativa inicial rápida e, após 2 a 4 h, uma explosão oxidativa massiva. Este atraso reflete o tempo requerido para o sinal da bactéria avirulenta ser liberado para as células da planta e processado para uma forma que possa elicitar o mecanismo de reconhecimento (Figura 2) (Keppler & Baker, 1989; Keppler et al. 1989; Baker et al, 1991).

Na interação entre uma raça incompatível de Phytophthora nicotianae Breda de Hanne células de fumo, a produção de H₂O₂ ocorreu em sucessivas explosões oxidativas, verificadas entre 0 e 2 h após a inoculação. Entretanto, uma explosão oxidativa mais intensa ocorreu no período de 8 a 10 h após a inoculação (Able et al., 2000).

A explosão oxidativa envolve a ativação de componentes de oxidases pré-existentes mais do que a síntese de novo do maquinário de explosão oxidativa. O mecanismo que as plantas possuem para gerar O₂^–a partir do oxigênio molecular, possivelmente envolve uma NADPH oxidase associada à membrana. Há indicações de que plantas e mamíferos geram EAO's de maneira similar durante as respostas de defesa. Entretanto, a presença de um motivo citoplasmático no qual o cálcio se liga a NADPH oxidase vegetal, sugere a possibilidade de regulação direta da atividade dessa oxidase, através da percepção de trocas em concentrações subcelulares de cálcio, em vez da montagem de oxidases citoplasmáticas adicionais, como ocorre em sistemas de defesa de mamíferos (Hammond-Kosack & Jones, 2000). Exemplificando, componentes citosólicos pré-formados como o Ca⁺⁺, ATP e uma etapa de fosforilação, contribuíram para aumentar a atividade in vitro da NADPH oxidase associada à membrana plasmática de células de tubérculos de batata infetados por P. infestans (Allan & Fluhr,1997).

Culturas de células de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), testadas com dois diferentes tipos de elicitores, mostraram um rápido aumento na absorção de oxigênio, seguido pela produção transitória de H₂O₂ e aumento na atividade catalítica da peroxidase. Uma alcalinização transitória do apoplasto, pH 7,0-7,2, foi necessária para a geração de H₂O₂ nesse sistema. Nenhuma dessas rotas alternativas foram inibidas por difenilenoiodonium, levando a crer que a produção de EAO's durante as interações incompatíveis poderia ocorrer por mecanismos divergentes em diferentes espécies vegetais e a contribuição de cada mecanismo para a explosão oxidativa poderia variar de acordo com a espécie em questão (Hammond-Kosack & Jones, 1996).

Mecanismos celulares para inibição das EAO

As EAO's ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém, quando acumuladas tornam-se tóxicas à célula.O H₂O₂ sobrevive no citoplasma da célula em concentrações suficientes para alcançar o núcleo da célula vegetal ou do patógeno, podendo reagir com íons metálicos intracelulares. Dessa forma, embora moderadamente reativas por elas próprias, muito do prejuízo celular causado por H₂O₂ e O₂^–resulta da conversão dessas moléculas para espécies ainda mais reativas. Exemplo disso é a conversão do H₂O₂, na presença de Fe²⁺, para OH^–, extremamente tóxico. Esses radicais podem reagir com proteínas e assim reduzir a atividade de enzimas, reagir com lipídios e aumentar a permeabilidade de membranas e ainda reagir com o DNA causando mutações (Moller, 2001). Portanto, como o acúmulo de EAO's pode resultar em prejuízos consideráveis, a célula dispõe de vários mecanismos para detoxificar eficientemente essas espécies ativas de oxigênio. Esses mecanismos de proteção, foram desenvolvidos pelas plantas durante o processo de evolução, para controlar os níveis dessas moléculas e anular essa toxicidade. Moléculas antioxidantes, enzimas simples, e um sistema mais complexo de detoxificação, podem estar envolvidos na proteção celular contra EAO's acumuladas. Conhecidos como "scavengers", várias enzimas reguladoras (Tabela 1) impedem a ação tóxica das EAO's à célula vegetal.

Superóxido dismutases: as SOD's são enzimas catalisadoras da dismutação do O₂^.– e HO₂⁺ a H₂O₂, e podem estar ligadas a um metal (Cu/Zn, Mn e Fe). As plantas, normalmente, têm Cu/Zn-SOD no citosol, Cu/Zn e/ou Fe-SOD no cloroplasto e Mn-SOD na mitocôndria. As SOD's são consideradas importantes agentes antioxidantes porém, em elevadas concentrações nas células animais e bacterianas, podem induzir disfunções e morte celular (Baker & Orlandi, 1995).

Ciclo do ascorbato/glutationa: principal sistema de remoção das EAO's nos cloroplastos. Nesse ciclo são empregadas quatro enzimas: ascorbato peroxidase (APX), dehidroascorbato redutase (DHA), monodehidroascorbato redutase (MDA^.) e glutationa redutase. O H₂O₂ pode ser reduzido e removido pela APX através do ascorbato como redutor, formando o radical monodehidroascorbato (MDA^.) (Yoshimura et al., 2000). Esse por sua vez, irá dismutar para dehidroascorbato (DHA) e ascorbato.

Catalase: são enzimas que convertem o H₂O₂ em H₂O e O₂. As plantas possuem várias isoformas de catalase, as quais estão presentes nos peroxissomas e glioxissomas. São as principais enzimas de detoxificação do H₂O₂ em plantas e podem dismutar diretamente o H₂O₂ ou oxidar substratos, tais como metanol, etanol, formaldeído e ácido fórmico. As catalases podem ser dividas em três classes: catalases da classe 1 removem o H₂O₂ produzido durante a fotorespiração em tecidos fotossintéticos; catalases da classe 2 são produzidas em tecidos vasculares e podem exercer uma função de lignificação mas, sua exata função biológica permanece desconhecida; e na classe 3 estão as catalases presentes abundantemente em sementes e plantas jovens, e cuja atividade está relacionada à remoção do H₂O₂ produzido durante a degradação dos ácidos graxos no glioxissoma. As catalases funcionam então como canal de limpeza do H₂O₂ celular (Breusegem et al. 2001). Em soja [Glycine max (L.) Merril], Dixon et al. (1994) verificaram que a adição da catalase ou ácido ascórbico, potentes antioxidantes, bloqueou o acúmulo da fitoalexina gliceolina elicitada por Verticillium dahliae Kleb. Pelo lado do patógeno, possivelmente a catalase seja uma forma de defesa enzimática de alguns patógenos contra as EAO's do hospedeiro (Garre et al., 1998), isso porque essas enzimas localizadas nos peroxissomos de muitos organismos, incluindo os fungos, quando aplicadas na célula vegetal, impedem a influência positiva do gene da glucose oxidase na resistência do hospedeiro e efetivamente inibem a explosão oxidativa, a produção de fitoalexinas e a ação de H₂O₂ na morte celular programada durante a HR.

b-caroteno: é um eficiente agente de detoxificação de ¹O₂ . Os carotenóides participam do sistema de antenas dos cloroplastos, na absorção de luz e transferência de energia para os centros das reações. Entretanto, os carotenóides também podem dissipar energia durante o estresse fotoxidativo (Baker & Orlandi, 1999).

As EAO's induzidas por elicitores fúngicos e bacterianos durante a fase inicial da explosão oxidativa, têm sido especificamente inibidas por difenilenoiodonium (DPI), inibidores do influxo de cálcio e inibidores de quinases (Baker & Orlandi, 1995; Hammond-Kosack & Jones, 1996).

Nas mitocôndrias, principal sítio de produção de EAO's na célula vegetal, existem várias enzimas para detoxificação de EAO's. Recentemente a thioredoxina, pequena proteína (12 - 14 kDa) com duas cisteínas no sítio ativo, tem sido apontada como possível agente de detoxificação de EAO's (Moller, 2001). No entanto, esse autor considera que o sistema celular de detoxificação de EAO's está pouco esclarecido.

FUNÇÕES DAS EAO's NA PLANTA

A rápida geração e acúmulo de espécies ativas de oxigênio, desencadeadas pela explosão oxidativa após a percepção dos sinais de avirulência do patógeno, atuam com diferentes funções de defesa. Dentre as várias funções das EAO's na defesa vegetal, podemos citar o efeito tóxico direto de H₂O₂ ao patógeno, agindo como um agente antifúngico e antibacteriano (Sutherland, 1991; Allan & Fluhr, 1997). O efeito antimicrobiano direto das EAO's numa dada interação planta-patógeno, depende das concentrações das EAO's e da sensibilidade do patógeno a essas concentrações (Medhy et al. 1996). Para atuar como antibiótico efetivo na resposta de defesa vegetal, a concentração de H₂O₂ no sítio de infecção deve ser alta o bastante para servir como agente microbicida (Medhy et al. 1996). Concentrações micromolares de H₂O₂ inibiram a germinação de esporo de vários fungos patogênicos (Peng & Kúc, 1992). O H₂O₂ a0,1 mM inibiu completamente o crescimento de Erwinia carotovora ssp. carotovora (Jones) Bergey, Harrison, Breed, Hammer & Huntoone mais de 95% do crescimento de P. infestans (Wu et al. 1995). Entretanto, os estudos da atuação do H₂O₂ como agente redutor da viabilidade do patógeno, são dificultados pelas várias funções exercidas pelo H₂O₂ na célula vegetal (Medhy et al. 1996).

Além da atuação no complexo e integrado sistema de sinalização celular que culminará na ativação da expressão dos genes de defesa (Figura 3), o H₂O₂ participa do cruzamento oxidativo ('cross-linking') de proteínas da parede celular formando, com a matriz de polissacarídeos, um grande polímero de várias glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, reforçando estruturalmente a parede celular. O H₂O₂ também atua como importante substrato das peroxidases e por conseguinte dispara a química de lignificação, com formação de precursores de polímeros de lignina, via atividade da POX (Alvarez et al., 1998).

Na sinalização para respostas de defesa da planta ao patógeno, o H₂O₂ é o candidato mais atrativo dentre as EAO's, por causa da sua vida relativamente longa e alta permeabilidade através das membranas. Como o H₂O₂ não possui elétron pareado, pode atravessar membranas biológicas, nas quais as espécies O₂^– atravessam lentamente. Desse modo, após o reconhecimento do patógeno avirulento seguido da explosão oxidativa e seus intermediários reativos, ocorre indução de genes de defesa e morte celular, onde o H₂O₂ age como um sinal para indução de genes de proteção celular nas células vizinhas para restringir o desenvolvimento da lesão (HR), que é, então, acompanhada pelo desenvolvimento de uma resistência sistêmica adquirida (SAR). Essa reação sistêmica de defesa é induzida pela explosão oxidativa no sítio de inoculação (local primário), e pelas subsequentes microexplosões secundárias em folhas distantes, que por sua vez são necessárias para o estabelecimento da SAR. Isso foi comprovado por Alvarez et al. (1998), após a inoculação da bactéria Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young, Dye & Wilkie(Pst), contendo o gene de avirulência avrRpt_2, em folhas de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ecotipo Col-0, possuidora do gene de resistência Rps₂. A bactéria causou uma HR macroscópica no sítio de inoculação, e o desenvolvimento de resistência em folhas não inoculadas (secundárias). Assim como ocorre com os genes das proteínas relacionadas à patogênese (PRPs) em outros sistemas SAR, a transcrição e acúmulo de PR-2 ocorreu em folhas secundárias, aproximadamente dois dias após a inoculação da raça avirulenta de Pst nas folhas primárias. Níveis máximos de PR-2 ocorreram após cerca de quatro dias da inoculação (Alvarez et al., 1998).

Na SAR, o H₂O₂ aumenta a atividade da enzima ácido benzóico 2-hidrolase, requerida para a biossíntese do ácido salicílico, potente sinalizador para a ocorrência desse tipo de resistência induzida. Martinez et al. (2000) verificaram que a acumulação sistêmica de ácido salicílico, emitido aproximadamente 3 h após inoculação de Xanthomonas campestris pv. malvacearum (Smith) Dye em cotilédones de algodão (Gossypium hirsutum L.) cv. Reba B50, estava associado com a explosão oxidativa. Existe uma forte probabilidade de que a geração de EAO's conduziria a uma alteração no balanço redox, e este por sua vez poderia também regular a estabilidade de mRNAs específicos, o que culminaria com a tradução de genes de defesa (Figura 3).

A explosão oxidativa é necessária mas não suficiente para disparar a morte celular (HR). Dados recentes citados por Delledonne et al. (2001) indicam que o óxido nítrico (NO) coopera com as EAO's na ativação da HR, então, aparentemente o NO possui um efeito sinergístico com o H₂O₂, na indução de HR.

QUANTIFICAÇÃO DE EAO'S DURANTE A INTERAÇÃO PLANTA-PATÓGENO

A detecção e quantificação de EAO's em sistemas biológicos é particularmente difícil devido à rápida destruição e detoxificação ('scavenging') desses radicais. Além disso, as EAO's não podem ser medidas diretamente por métodos espectrofotométricos ou HPLC, normalmente aplicados ao estudo de compostos de carbono. Por isso, a maioria das técnicas de detecção de EAO's baseia-se na oxidação ou redução de certos compostos pelas EAO's. A dificuldade de monitoramento das espécies ativas de oxigênio em células vegetais, deve-se ao fato de que muitas são de vida curta e sujeitas aos mecanismos antioxidantes celulares tais como SOD, peroxidases, ciclo do ascorbato/glutationa e catalase.

Vários métodos têm sido empregados para monitorar EAO's em tecidos vegetais (Tabela 2). As aplicações, vantagens e desvantagens desses métodos, bem como os cuidados que devem ser tomados na interpretação dos resultados, devem ser considerados. O método da quimioluminescência facilita os estudos que enfocam a produção e detoxificação de EAO's durante as interações incompatíveis planta-bactéria (Baker & Orlandi, 1995). Delledonne et al. (2001) avaliaram o acúmulo de H₂O₂ por fluorescência em escopoletina, e de O₂^– pelo monitoramento do citocromo C e tetrazólio através da análise de absorbância.

O método comumente usado para medir a produção de O₂^– é a oxidação de epinefrina para formar adrenocromo. Para se medir H₂O₂, o mais comum é utilizar uma peroxidase e um substrato oxidável como escopoletina (Moller, 2001). Pelo método da espectroscopia de ressonância magnética de elétrons, Fodor et al. (2001) verificaram a produção de EAO's induzida pelo TMV. A fim de localizar o H₂O₂ na célula, Rodriguez et al. (2002) empregaram o método da microscopia eletrônica. Diante disso, verifica-se que são vários os métodos empregados para detectar e/ou monitorar EAO's, e a escolha do método vai depender principalmente do tipo de molécula que se pretende avaliar.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A explosão oxidativa é uma das respostas mais rápidas de defesa da planta após o reconhecimento do patógeno. Essa resposta corresponde à geração de espécies ativas de oxigênio (H₂O₂, O₂^–, OH^–). São recentes os estudos de detecção e monitoramento destas espécies de oxigênio, devido a grande variedade de formas e intermediários, além da alta taxa de reatividade química envolvida nessas reações, dificultando os estudos. Existem evidências de que H₂O₂ está envolvido em muitos mecanismos de resistência da planta, atuando no reforço da parede celular, pela ligação cruzada de proteínas estruturais ou fenólicos, formando uma barreira mecânica efetiva. O peróxido de hidrogênio, no apoplasto da célula hospedeira, pode agir diretamente como um agente antimicrobiano. No entanto, dificilmente esse efeito é quantificado in vivo, em virtude das várias outras funções do H₂O₂, atuando, por exemplo, como mensageiro secundário na cascata de transdução de sinais para ativação de genes de defesa e de proteção celular. Assim, as EAO's em geral, são apontadas como intermediárias na complexa malha de sinalização para as respostas de resistência local (HR) e sistêmica (SAR).

A explosão oxidativa não está confinada à reação macroscópica de HR no sítio de inoculação, pois repetidas explosões secundárias ocorrem em sítios discretos em tecidos distantes, provocando micro-HRs e reação sistêmica (SAR). O papel do NO como molécula sinérgica ao H₂O₂ na HR, carece de investigação. Atualmente é grande a busca por uma NO sintase em plantas, enzima já detectada em células animais. Também se investiga o papel do ácido salicílico, cuja síntese é estimulada por H₂O₂, como uma dos sinais que translocam, levando a mensagem da HR para a ativação da SAR.

Com a recente clonagem de vários genes de resistência (R), que geralmente codificam os receptores do sinal de avirulência em interações gene-a-gene, existe um grande interesse na compreensão dos processos envolvidos na explosão oxidativa, como um dos eventos iniciais após o reconhecimento do patógeno pelo hospedeiro. Tais estudos poderão ser aprofundados à medida que as técnicas disponíveis para detecção das EAO's tornarem-se rotineiras em laboratórios de fisiopatologia vegetal e que novas técnicas para detecção in situ sejam também desenvolvidas, acopladas à microscopia eletrônica de transmissão.

LITERATURA CITADA

Aceito para publicação em 31/01/2003

Autor para correspondência: Mário Lúcio V. Resende

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2003
• Data do Fascículo
  Abr 2003

Histórico

• Recebido
  31 Jan 2003