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Fitopatologia Brasileira

Print version ISSN 0100-4158

Fitopatol. bras. vol.29 no.3 Brasília May/June 2004

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-41582004000300018 

COMUNICAÇÕES COMMUNICATIONS

 

Caracterização da região 5'-terminal de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus*

 

Characterization of the 5'-terminal region of a Brazilian isolate of Southern bean mosaic virus

 

 

Luciana M. EspinhaI, 1; José O. GasparI, 2; Richard J. WardII; Roberto RullerIII; Luis E. A. CamargoIV

IDepartamento de Zoologia e Botânica, IBILCE-UNESP, CEP 15054-000, São José do Rio Preto, SP, e-mail: gaspar@dzb.ibilce.unesp.br
IIDepartamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP, CEP 14049-900, Ribeirão Preto, SP
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina/USP, CEP 14049-9000, Ribeirão Preto, SP
IVESALQ-USP, Cx. Postal 9, CEP 13418-900, Piracicaba, SP

 

 


RESUMO

O presente trabalho caracteriza a região 5'-terminal de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar cerca de 590 nt da região 5'-terminal do RNA viral. Foi obtido um fragmento de tamanho esperado que, após clonagem e seqüenciamento, mostrou a existência de uma região não codificadora com 92 nt e a primeira ORF, começando no primeiro AUG (posição 93) e terminando no códon UGA na posição 534. Na região não codificadora foi detectado um segmento parcialmente complementar ao RNA ribossomal 18S. A ORF1 codifica uma proteína de 147 aminoácidos com massa molecular estimada de 17080 Da. A extremidade 3' da ORF1 sobrepõe a extremidade 5' da ORF2 em 34 nucleotídeos. Os resultados obtidos indicam que a região 5'-terminal do RNA do SBMV-SP é similar ao isolado Arkansas (SBMV-ARK) descrito na América do Norte.

Palavras-chave adicionais: feijoeiro comum, Sobemovirus, SBMV, seqüenciamento.


ABSTRACT

We report the characterization of the 5'-terminal region of an isolate of Southern bean mosaic virus found in the São Paulo State, Brazil (SBMV-SP). The RNA was extracted from purified virus particles and subjected to RT-PCR using oligonucleotides designed to amplify about 590 nt of the 5'-terminal region of the viral RNA. A fragment with the expected size was obtained, which, after cloning and sequencing, showed the existence of a 5' non-coding region with 92 nt and the first ORF, starting at the first AUG (position 93) and ending at a UGA stop codon at position 534. A small site, partially complementary to the 3'-terminus of 18S ribossomal RNA was detected at the non-coding region. The ORF1 may encode a protein containing 147 amino acids with a deduced molecular weight of 17080 Da. The 3'-terminus of ORF1 overlaps the 5'-terminus of ORF2 in 34 nt. Our results indicate that the 5'-terminal region of SBMV-SP is similar to that of the Arkansas isolated (SBMV-ARK) described in the North America.


 

 

Entre as mais de dez viroses descritas em feijoeiros (Phaseolus vulgaris L.) (Costa et al., 1972; Bianchini et al., 1977), está a causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV), gênero Sobemovirus (van Regenmortel et al., 2000). O SBMV possui partículas isométricas (28-30 nm) contendo RNA genômico de 4-4,5 Kb envolto por proteína capsidial com massa molecular de 29-39 kDa (Sehgal, 1981). Uma pequena proteína (VPg) é covalentemente ligada à extremidade 5' do RNA, enquanto a extremidade 3' é destituída de cauda Poli A (Ghosh et al, 1979). Os genomas dos sobemovirus possuem quatro ORFs que se sobrepõem (Van Regenmortel et al., 2000), com exceção para o SBMV que possui somente três ORFs não sobrepostas (Othman & Hull, 1995). Ao SBMV falta a pequena ORF3 que é encontrada, entretanto, no isolado "Arkansas" do SBMV (SBMV-ARK; Lee & Anderson, 1998). Tem sido proposto, que as diferenças na organização do genoma do SBMV e SBMV-ARK resultariam de mutações ou erros no seqüenciamento de nucleotídeos do SBMV (Lee & Anderson, 1998). De qualquer maneira, os genomas dos isolados do SBMV codificam para uma possível proteína do movimento (ORF1), uma poliproteína com domínios de VPg, uma serino protease e RNA polimerase dependente de RNA (ORF2) e a proteína capsidial (ORF4) (Othman & Hull, 1995; Lee & Anderson, 1998). A função da proteína codificada pela ORF3 do SBMV-ARK, é desconhecida.

No Brasil, o SBMV foi detectado pela primeira vez em feijoeiros na região do Distrito Federal (SBMV-DF; Cupertino et al, 1982) e, posteriormente, no Estado de São Paulo (SBMV-SP; A. S. Costa, Dados não publicados) e Paraná (SBMV-PR; Gasparin, 2002). Algumas propriedades moleculares foram determinadas para o isolado SBMV-SP por Moreira & Gaspar (2002): (a) as partículas virais apresentam diâmetro de 28-30 nm e a proteína capsidial possui massa molecular de 30 kDa, (b) das partículas virais foram extraídos RNA de vários tamanhos (4,2 Kb, 3,1 Kb, 2,6 Kb, 2,15 Kb, l,64 Kb, 1,36 Kb e l,0 Kb) sendo o de 4,2 Kb o RNA genômico e o de 1,0 Kb supostamente um RNA subgenômico que codifica a proteína capsidial, (c) ácidos ribonucleicos do mesmo tamanho foram também detectados in vivo, indicando estar associados à replicação viral e (d) somente duas espécies de RNA de fita dupla (dsRNA) foram detectadas in vivo (4,2 Kpb e 1,0 Kpb), correspondendo às formas replicativas (RFs) do RNA genômico e do RNA subgenômico para a proteína capsidial.

No presente trabalho descreve-se a caracterização da região 5'-terminal do genoma do isolado do SBMV encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP).

O SBMV-SP foi doado, no final dos anos 80, pelo Dr. Álvaro Santos Costa (Instituto Agronômico de Campinas), inoculado em feijoeiro comum cv. Rosinha e mantido em casa de vegetação. O vírus foi purificado como descrito por Moreira & Gaspar (2002). Após purificação, uma alíquota do vírus foi tratada com SDS 2,5% e NaCl 0,1 M com aquecimento por 3 min à 55 oC. Em seguida foi acrescentado igual volume de fenol (equilibrado com tampão citrato de sódio 0,1 M pH 4,3), agitada manualmente por 30 s e, então, centrifugada para a separação das fases. A fase aquosa foi novamente extraída com fenol e, após centrifugação, o ácido nucleico foi precipitado da fase aquosa pela adição de 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e três volumes de etanol por 1 hora à -70 oC. Em seguida, a mistura foi submetida à centrifugação a 12.000 g por 15 min e o "pellet" foi secado à 37 oC por 10 min e solubilizado em água tratada com DEPC.

Para a produção do DNA complementar (cDNA) ao RNA viral, foi utilizado um volume de reação de 20 µl consistindo de: 50 mM Tris.HCl (pH 8,3); 75 mM KCl; 10 mM DTT; 3 mM MgCl2; 0,1 mM cada dGTP, dATP, dCTP; 0,065 mM dTTP; 10 µg/ml hexanucleotídeos ou oligonucleotídeo anti-senso (SBMV1, abaixo); duas unidades de inibidor de RNAse; 1-3 µg RNA viral desnaturado à 95 oC por 5 min; 40 unidades de Transcriptase Reversa "Superscript" (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A reação permaneceu por 2 h a 42 oC.

Os oligonucleotídeos foram desenhados utilizando-se os programas Primer-3 e Oligo-4 baseando-se na seqüência de nucleotídeos do SBMV-ARK (Lee & Anderson, 1998). O par de oligonucleotídeos flanqueia uma seqüência de 591 nucleotídeos, correspondendo a região inicial não codificadora e a ORF1 que codifica a possível proteína do movimento. A seqüência do par de oligonucleotídeos é a seguinte: senso (Ea39): 5'-CACAAAATATAAGAAGGAAAGCTGG-3' e anti-senso (SBMV1): 5'-ACGCTGCAGCCGTATGGATGTCGAA-3'.

O volume da reação de PCR foi de 50 µl consistindo de tampão (Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM); 5 mM de MgCl2; 0,2 mM cada dCTP, dGTP, dATP e dTTP; 10 ug/ml de cada primer (senso e anti-senso); 1 µl da mistura da reação de cDNA e duas unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O ciclo da PCR, realizado em um termociclador "MiniCycler" (MJ Research, San Francisco, CA, USA), envolveu uma desnaturação inicial de 94 oC por 4 min e 30 ciclos com 1 min de desnaturação à 94 oC, 1 min de anelamento à 45 oC e 1 min de extensão à 72 oC. Após 30 ciclos, foi feita uma extensão final por 10 min à 72 oC. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados, sob luz ultravioleta, em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo.

A clonagem do fragmento obtido na reação de PCR foi feita utilizando-se o kit "SureClone Ligation" (Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA) e a extração do plasmídeo recombinante realizada com o kit "Concert Rapid Plasmid Miniprep System" (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), segundo instruções dos fabricantes. Após clonagem em vetor pUC18, bactérias Escherichia coli linhagem DH5µ foram transformadas e cinco clones selecionados. Após a extração do DNA plasmidial das células selecionadas, foram feitas digestões com enzimas de restrição (EcoRI e BamHI) para a comprovação da formação do recombinante. Os DNAs plasmidiais purificados foram seqüenciados pela técnica de reação de terminação em cadeia, utilizando-se o seqüenciador automático "ABI Prism 377 DNA Sequencer" (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) e o kit "DNA sequencing Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA), seguindo-se as recomendações do fabricante. O seqüenciamento de cinco clones foi realizado nos dois sentidos de leitura utilizando-se os oligonucleotídeos universais M13. O alinhamento das seqüências obtidas foi feito com o auxílio do programa CLUSTAL W (http://www.ch.embnet.org/software/clustalW.html) e as comparações com as seqüências existentes no banco de dados GenBank, feitas através do algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Após seqüenciamento, a análise da região 5' não codificadora do SBMV-SP evidenciou a presença de 92 nucleotídeos precedendo o códon de iniciação da ORF1 (Figura 1A). Nessa região, o RNA do SBMV-SP tem um conteúdo relativamente baixo de G + C (38%) semelhante às regiões 5' não codificadoras de outros sobemovirus (SBMV-ARK, 39%; SBMV, 37%; SCPMV, 33% e SeMV, 38%) e de outros genomas virais (Alquist et al., 1981). Dentro da região 5' não codificadora há um segmento parcialmente complementar ao RNA ribossomal 18S (Figura 1B), sugerindo um possível papel na ligação do ribossomo (Hagenbüchle et al., 1978). Este possível sítio de ligação ao ribossomo está localizado a distâncias variáveis do código de iniciação da ORF1 sendo 52 nt para o SBMV-SP, SBMV-ARK e SBMV, 36 nt para o SeMV e 5 nt para o SCPMV (Wu et al., 1987; Othman & Hull, 1995; Lee & Anderson, 1998; Lokesh et al., 2001).

 

 

A ORF1 do RNA do SBMV-SP tem início no nucleotídeo 93 (códon AUG) e termina na posição 534 (códon UGA) (Figura 1A). A seqüência dos 441 nucleotídeos e a seqüência deduzida de aminoácidos apresentam 79% de identidade com o SBMV-ARK. Em relação a outras espécies do gênero Sobemovirus, há pouca identidade de nucleotídeos e aminoácidos dentro da ORF1 (Tabela 1). A função da proteína codificada pela ORF1 é ainda desconhecida, mas tem sido proposta sua participação no movimento viral entre células (Othman & Hull, 1995). A baixa identidade na ORF1 entre diferentes espécies de Sobemovirus corrobora resultados anteriores para outros gêneros de vírus, onde as proteínas relacionadas com o movimento viral mostram pouca identidade, porém apresentam funções biológicas semelhantes (Melcher, 1990). A ORF1 do SBMV-SP codifica uma proteína contendo 147 aminoácidos com massa molecular deduzida de 17080 Da. Isto constitui uma diferença de um códon de nucleotídeos e um aminoácido a menos do que o isolado SBMV-ARK. Se esta diferença é significativa ainda está por ser determinado mas, levando-se em conta que esta proteína está relacionada com o movimento do vírus de célula-à-célula (Othman & Hull, 1995; Sivakumaran et al., 1998) e os dois isolados provocam infecção sistêmica, a perda deste aminoácido não deve ser responsável por mudança na função da proteína.

 

 

A extremidade 3'-terminal da ORF1 do SBMV-SP sobrepõe a extremidade 5'-terminal da ORF2 em 34 nucleotídeos (Figura 1A), sendo semelhante ao SBMV-ARK. Assim, a organização genômica dos dois isolados, nessa região, se dispõe igualmente, o que reforça a proposta de Lee & Anderson (1998), de que deve ter ocorrido erro no seqüenciamento feito para o outro isolado americano do SBMV (Othman & Hull, 1995), o qual apresenta somente 3 ORFs que não se sobrepõem.

Os resultados aqui obtidos indicam que o SBMV-SP é similar, na organização da região 5'-terminal do genoma, ao isolado Arkansas (SBMV-ARK) descrito na América do Norte. O seqüenciamento da região 3'-terminal, que inclui a proteína capsidial, poderá oferecer maiores detalhes da identidade entre esses dois isolados.

 

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Aceito para publicação em 01/12/2003

 

 

Autor para correspondência: José Osmar Gaspar
* Parte da Tese de Doutorado da primeira autora. Universidade Estadual Paulista (2003). Apoio financeiro da FAPESP e CAPES. Seqüência depositada no GenBank com o número de acesso AY340587.
1 Bolsista da CAPES
2 Bolsista do CNPq