Marcadores RAPD na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum

RAPD markers in the genetic diversity analysis of Acremonium strictum isolates

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Marcadores RAPD na análise da diversidade genética de isolados de Acremonium strictum¹

RAPD markers in the genetic diversity analysis of Acremonium strictum isolates

Hudson Teixeira^I; Maria das Graças G. C. Vieira^II; José C. Machado^III

^IDepartamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, CEP 36570-000, Viçosa, MG, tel: [phone], e-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Agricultura, Universidade Federal de Lavras, e-mail: [e-mail]

^IIIDepartamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Cx. Postal 37, CEP 37200-000, Lavras, MG, tel: [phone], e-mail: [e-mail]

RESUMO

Os fungos Acremonium strictum e Fusarium verticillioides normalmente apresentam algumas similaridades morfológicas, o que dificulta sua diferenciação em sementes de milho (Zea mays), particularmente quando ocorrem simultaneamente. Técnicas moleculares de análise do DNA têm possibilitado o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis eespecíficos no diagnóstico de fitopatógenos, em complemento à análise morfológica. Este trabalho objetivou caracterizar e dimensionar a diversidade genética de dez isolados de A. strictum obtidos de sementes de milho, provenientes de diferentes regiões produtoras brasileiras, por meio da análise do DNA genômico (RAPD). Objetivou-se ainda, diferenciar os isolados de A. strictum de F. verticillioides por meio da técnica citada. Pela análise do DNA, 25 primers Operon geraram polimorfismos, os quais tornaram possível e seguro o agrupamento de isolados de A. strictum e sua diferenciação de F. verticillioides. Os isolados de A. strictum apresentaram variabilidade intraespecífica entre 3,4% e 44,4%. Para a maioria dos casos não foi possível correlacionar a similaridade genotípica e a origem geográfica dos isolados de A. strictum.

Palavras-chave adicionais: DNA, variabilidade, fungo fitopatogênico, Cephalosporium acremonium, semente, milho.

ABSTRACT

Differentiation between Acremonium strictum and Fusarium verticillioides infecting corn (Zea mays) seeds is difficult because they present some morphological similarities. Molecular techniques have been applied with success, allowing the development of fast, sensible and specific diagnostic methods for plant pathogens in complement to morphological analysis. The objectives of this work were to characterize and measure the genetic diversity of ten isolates of A. strictum associated with maize (Zea mays) seeds from different brazilian regions, using DNA analysis (RAPD) in comparison with one isolate of F. verticillioides. Twenty-five Operon primers generated polymorphisms that were efficient in grouping A. strictum isolates and in distinguishing them from F. verticillioides. The isolates of A. strictum showed variable intraspecific diversity between 3.4% to 44.4%. No genotypic symilarities were correlated with the geographic origin of the A. strictum isolates.

INTRODUÇÃO

O aumento da demanda mundial por produtos agrícolas tem tornado imperativo o desenvolvimento de mecanismos mais rápidos e confiáveis no exercício do controle da qualidade sanitária do insumo semente, a qual tem sido insuficientemente investigada com as técnicas disponíveis da biotecnologia. Técnicas moleculares baseadas na análise do DNA têm sido aplicadas com êxito em diversas áreas da Micologia, possibilitando o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos no diagnóstico de fitopatógenos. A caracterização morfológica, embora essencial, é limitada algumas vezes devido ao número de caracteres passíveis de serem analisados (Fungaro, 2000). Marcadores morfológicos, como pigmentação, textura, forma marginal e velocidade de crescimento da colônia, produção de estruturas típicas, presença ou ausência de zonas concêntricas (Burgess et al., 1995; Urben & Oliveira, 1999), entre outros, são, de modo geral, instáveis e dependentes de vários aspectos, por exemplo, composição do meio utilizado, condições de incubação e a própria variação intraespecífica do patógeno. Portanto, podem ser subjetivos, pouco conclusivos e podem induzir a erros de interpretação quanto à identificação das espécies em estudo, já que, muitas vezes, colônias atípicas de um dos organismos podem assemelhar-se às colônias do outro.

A irrestrita adoção de marcadores moleculares do tipo RAPD na detecção, diagnóstico e determinação da diversidade genética de fitopatógenos deve-se, principalmente, à sua simplicidade de uso, rapidez, segurança e amplitude dos resultados gerados. A técnica RAPD tem se mostrado extremamente útil para medir e caracterizar a variabilidade genética (Fungaro, 2000). Por utilizar diretamente o DNA, não sofre influência dos fatores que afetam a expressão gênica. Sendo assim, tem sido considerada uma das mais viáveis para uso rotineiro, devido à sua rapidez e simplicidade na detecção de variabilidade genética, especialmente em organismos haplóides, como é o caso dos fungos (Coddington & Gould, 1992). Como exemplos da utilização desta técnica na caracterização de espécies fúngicas, podem ser citados os trabalhos de Guthrie et al. (1992), Schafer & Wostemeyer (1992), Grajal-Martin et al. (1993), Schilling et al. (1994) e Salgado et al. (1997), entre outros. Levantamentos da diversidade genética utilizando RAPD como marcador foram conduzidos com sucesso por Alzate-Marin et al. (1997), Santos et al. (1997), Faleiro et al. (1998) e Weir et al. (1998).

A diagnose precisa de patógenos morfologicamente semelhantes, como Acremonium strictum W. Gams e Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg, em lotes de sementes de milho (Zea mays L.) é uma necessidade e representa uma proteção indispensável para o sistema de produção de sementes. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram caracterizar e dimensionar a diversidade genética de isolados de A. strictum por meio de marcadores RAPD, correlacionar tal aspecto com a origem geográfica dos mesmos, e ainda, diferenciá-los de um isolado de F. verticillioides por meio da técnica citada.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção e multiplicação dos isolados fúngicos

Foram utilizados dez isolados de A. strictum e um de F. verticillioides obtidos de sementes de milho pelo método de incubação em papel de filtro (Limonard, 1966). Os isolados de A. strictum foram provenientes de duas diferentes localidades representativas de cinco importantes estados produtores brasileiros (Tabela 1). A multiplicação de A. strictum e F. verticillioides constou no cultivo em meio extrato de malte-ágar, MA (Smith & Onions, 1995) a 20 ºC, fotoperíodo de 12 h de luz, por dez dias, em câmara incubadora do tipo BOD.

Marcadores RAPD na análise da diversidade de A. strictum

Cinco discos de meio MA, com 5 mm de diâmetro, contendo micélio de A. strictum ou de F. verticillioides foram retirados da periferia de colônias com dez dias de idade e transferidos para frascos Erlenmeyer contendo 50 ml de meio líquido, constituído por: NaNO₃ - 2 g/l; KH₂PO₄ - 1 g/l; MgSO₄. 7H₂O - 0,5 g/l; sacarose - 15 g/l; água destilada esterilizada - 1.000 ml; 10 ml de solução mineral (elementos traços): FeSO₄. 7H₂O - 20 mg/l; ZnSO₄ . 7H₂O 0 - 100 mg/l; Na₂MoO₄ . 7H₂O - 2 mg/l; CuSO₄ . 5H₂O - 2mg/l; MnCl₂ . 4H₂O - 2 mg/l; pH do meio = 6,5. Os fungos foram mantidos a 20 ºC, sem agitação, no escuro, por sete dias, sendo o micélio obtido coletado a vácuo e macerado em nitrogênio líquido na presença de areia de quartzo esterilizada e do antioxidante Polyvinylpyrrolidone (PVP). Na extração do DNA genômico, o micélio previamente macerado foi colocado em microtubo de 2 ml, preenchendo-o, no máximo, a um terço de seu volume total. Foram adicionados 1.300 ml de tampão de extração (1% de b-mercaptoetanol; 20 ml de Tris-HCl 1M, pH 8,0; 5 ml de NaCl 5M; 5 ml de EDTA 0,5 M; 5 ml de SDS 10%; 65 ml de água pura deionizada e esterilizada) ao microtubo de 2 ml, o qual foi agitado até a obtenção de um homogenato e mantido em temperatura ambiente por 30 min. A seguir, a mistura foi centrifugada a 16.000 g por 5 min e recolheu-se o sobrenadante em um novo microtubo, sendo seu volume completado para 1 ml com tampão de extração. Foram adicionados ½ vol (volume) de Tris saturado com fenol, pH 8,0 e mais ½ vol de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Misturou-se por inversão por 5 min e, em seguida, procedeu-se à centrifugação por 5 min a 11.600 g, sendo a fase aquosa removida para um novo microtubo cujo volume foi completado para 1 ml com tampão de extração. Foram adicionados 20 ml de RNAse (estoque: 5 mg/ml) e incubou-se por 45 min a 37 ºC, misturando-se por inversão a cada 10 min. Adicionou-se 1 vol de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), misturando-se bem até a formação de uma emulsão. A mistura obtida foi centrifugada por 5 min a 11.600 g e a fase aquosa novamente coletada em novo microtubo de 2 ml, onde foram adicionados 100 ml de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, misturando-se por inversão durante 5 min. O DNA foi precipitado pela adição de 1 ml de etanol (98%) gelado. Procedeu-se a uma nova centrifugação por 30 s a 16.000 g, descartou-se o sobrenadante e inverteu-se o microtubo sobre papel toalha para secagem do pelete, o qual foi ressuspenso em 360 ml de TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 1mM de EDTA, pH 8,0). Foram adicionados 180 ml de acetato de amônia, 7,5 M, misturando-se gentilmente por inversão. Manteve-se o microtubo em gelo por 10 min. A seguir, a mistura foi submetida a uma centrifugação por 20 min, a 16.000 g a 4 ºC. O pelete formado foi descartado e o sobrenadante transferido para um microtubo de 1,5 ml, ao qual também foi adicionado 1 ml de etanol (98%) gelado. A mistura, homogeneizada por inversão, foi mantida a -20 ºC por 12 h, sendo então submetida à centrifugação por 5 min, a 16.000 g a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o microtubo invertido sobre papel toalha para drenagem do pelete. Cada microtubo foi lavado com etanol (70%) gelado e centrifugado por 5 min, a 16.000 g a 4 ºC, sendo o sobrenadante descartado e o microtubo novamente invertido sobre papel toalha para a secagem final do pelete de DNA, o qual foi ressuspenso em 50 ml de TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM de EDTA, pH 8,0) e a concentração de DNA determinada em fluorímetro Hoefer, Dyna Quant 200 (Pharmacia). A reação de amplificação apresentava-se com um volume total de 23 ml e foi constituída por água ultrapura deionizada, 15,5 ml; tampão 5x, 2,5 ml; d-NTP's (100 mM cada), 1 ml; primer (0,4 mM), 1 ml; taq polimerase (1 unidade), 1 ml; e 2 ml de DNA (10 ng/ml). Foram testados os seguintes primers decâmeros de seqüência arbitrária da marca Operon Technologies Inc.: A-01; A-02; A-03; A-04; A-05; A-06; A-07; A-08; A-09; A-10; A-11; A-12; A-13; A-14; B-01; B-02; B-03; B-04; C-01; D-01; D-02; D-03; D-04; D-05; D-06; D-07; D-08; D-09; D-10; E-01; E-02; F-01; F-02; F-10; G-01; G-02; G-03; G-04; G-05; G-06; G-07; G-08 e G-10.

A amplificação baseou-se em Williams et al. (1990), utilizando um termociclador Perkin Elmer, modelo Gene Amp PCR System 2400, com a seguinte programação: 3 min a 94 ºC, seguidos por 40 ciclos de 1 min a 94 ºC (desnaturação das fitas de DNA), 1 min a 36 ºC (anelamento dos primers), 2 min a 72 ºC (alongamento das novas fitas de DNA) e uma extensão final de 5 min a 72 ºC. Os produtos amplificados foram separados em gel de agarose 1%, submetidos à eletroforese em tampão TBE (90 mM Tris-borato; 1 mM EDTA, pH 8,0), sendo posteriormente corados com brometo de etídio (0,5 mg/ ml) por 30 min e descorados em água por 20 min. Os géis foram fotografados sob luz UV e avaliados quanto à ocorrência de bandas polimórficas entre os genótipos de A. strictum e F. verticillioides. Os dados do RAPD foram analisados e, considerando-se a presença (1) ou ausência (0) de bandas polimórficas, foi determinada a dissimilaridade genética dos isolados a partir da qual se construiu um dendrograma (UPGMA, NTSYS-pc, versão 2.02), utilizando o coeficiente Dice.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 43 primers testados, 30 amplificaram os fragmentos de DNA. Destes, 25 primers (OP-A02; OP-A03; OP-A04; OP-A05; OP-A07; OP-A09; OP-A10; OP-A11; OP-A12; OP-A13; OP-D01; OP-D02; OP-D04; OP-D05; OP-D07; OP-D08; OP-E01; OP-F01; OP-F10; OP-G02; OP-G04; OP-G05; OP-G06; OP-G07 e OP-G08) geraram um total de 176 bandas polimórficas, utilizadas no cálculo das distâncias genéticas (Tabela 2) e na construção do dendrograma (Figura 2). Pela Figura 1 é possível observar exemplos de padrões de amplificação obtidos pelos primers OP-A05, OP-A07, OP-D07 e OP-G07. A grande maioria dos primers testados forneceu bandas exclusivas para os diferentes genótipos fúngicos, as quais futuramente poderão ser isoladas e utilizadas como sondas (SCAR), facilitando todo o processo de detecção e identificação dos mesmos. Estas observações permitiram confirmar a eficiência de marcadores RAPD aplicados ao estudo da genética de fungos, como tem sido relatado por outros autores (Vieira, 1996; Machado et al., 1997; Faleiro et al., 1998; Mesquita et al., 1998; Fungaro, 2000).

A distância genética relativa (dissimilaridade) entre os isolados de A. strictum variou entre 3,4% (AS1 e AS3) e 44,4% (AS2 e AS4) (Tabela 2). Assim sendo, a similaridade de 55,6 a 96,6% entre os isolados de A. strictum pode ser considerada elevada. Estes resultados indicam que é pouco provável a existência de alta variabilidade intraespecífica em A. strictum, ainda que tenham sido analisados poucos indivíduos. Foi possível constatar também 75,8% (AS2-FV11) a 87% (AS4-FV11) de polimorfismo (dissimilaridade) entre A. strictum e F. verticillioides.

Os resultados deste experimento, assim como aqueles obtidos por Alzate-Marin et al. (1997), Mesquita et al. (1998) e Faleiro et al. (1998) reforçam a eficiência da técnica de RAPD em detectar variabilidade intraespecífica. Baseando-se nos perfis de DNA (Figura 2), os 11 isolados fúngicos foram divididos em três grupos, considerando um limite arbitrário de 32,5% de distância relativa. Os isolados AS1, AS3, AS5, AS9, AS10, AS6, AS7 e AS2 formaram o grupo 1. O grupo 2 foi formado por AS4 e AS8, e o isolado FV11 constituiu o grupo 3.

A análise geral dos resultados obtidos neste experimento, permitiu observar que, na maioria dos casos, isolados de A. strictum provenientes de um mesmo estado (AS1 e AS2, ambos de Minas Gerais; AS3 e AS4, ambos de São Paulo) apresentaram perfis genotípicos mais variados do que isolados oriundos de estados diferentes (AS1 e AS3; AS5 e AS9; AS4 e AS8). Este fato deveu-se, provavelmente, à utilização de isolados obtidos de genótipos hospedeiros com base genética diferente, exercendo alguma influência sobre o comportamento dos próprios isolados, mais que a origem geográfica dos mesmos. Da mesma forma, Alzate-Marin et al. (1997) não observaram correlação entre os grupos de similaridade genética observados e a origem geográfica dos isolados testados. O agrupamento de isolados afins de A. strictum, baseando-se tão somente em marcadores genotípicos do tipo RAPD, não permitiu estabelecer um padrão específico.

Aceito para publicação em 08/07/2004

Autor para correspondência: Hudson Teixeira

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1

Parte da Tese de Doutorado do primeiro autor. Universidade Federal de Lavras (2001)

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Jan 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Aceito
  08 Jul 2004
• Recebido
  08 Jul 2004