Caracterização da região 3'-terminal do genoma de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

Characterization of the 3'-terminal genome region of a Brazilian isolate of Southern bean mosaic virus

COMUNICAÇÕES COMMUNICATIONS

Caracterização da região 3'-terminal do genoma de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus^*

Characterization of the 3'-terminal genome region of a Brazilian isolate of Southern bean mosaic virus

Luciana M. Espinha^{I, **}; José O. Gaspar^I, ^***; Andreia E. Moreira^I; Ana Cecília B. Pereira^{I, ***}; Priscila Belintani^{I, ***}; Luis E. A. Camargo^II

^IDepartamento de Zoologia e Botânica, IBILCE-UNESP, CEP 15054-000, São José do Rio Preto, SP, e-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, ESALQ-USP, Cx. Postal 9, CEP 13418-900, Piracicaba, SP

RESUMO

O presente trabalho caracteriza a região 3'-terminal do genoma de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar 972 nt da região 3'-terminal do RNA viral. Foi obtido fragmento de tamanho esperado que inclui o gene da proteína capsidial e a região 3'-terminal não codificadora. O gene da proteína capsidial (ORF4) contém 801 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. Sessenta e um aminoácidos terminais da ORF2 estão sobrepostos na ORF4. O "sinal de localização nuclear", encontrado dentro do "Domínio R" na região 5'-terminal da ORF4 de alguns sobemovírus, não foi identificado no SBMV-SP. Esse dado pode explicar a ausência de partículas virais do SBMV-SP no núcleo celular. A seqüência do SBMV-SP apresentou identidade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 91% e 93% com o isolado "Arkansas" (SBMV-ARK) descrito nos EUA. Os resultados obtidos indicam que o SBMV-SP e o SBMV-ARK são isolados muito proximamente relacionados.

Palavras-chave adicionais: feijoeiro comum, Sobemovirus, SBMV, seqüenciamento.

ABSTRACT

We report the characterization of the 3'-terminal genome region of an isolate of Southern bean mosaic virus found in the State of São Paulo, Brazil (SBMV-SP). The RNA was extracted from purified virus particles and subjected to RT-PCR using oligonucleotides designed to amplify 972 nt of the 3'-terminal region of the viral genome. The coat protein gene (ORF4) contains 801 nt, including the stop codon UGA, coding for 266 amino acids with a predicted molecular weight of 28,800 Da. The 3'-terminus of ORF2 overlaps the 5'-terminus of ORF4 in 61 amino acids. The nuclear localization signal sequence, found in the "R domain" at the 5'-terminal of the ORF4 in some sobemoviruses, was not identified in SBMV-SP. This could explain the absence of SBMV-SP particles inside the cell nucleus. The SBMV-SP sequence showed identity of nucleotides and amino acids of, respectively, 91% and 93% with the "Arkansas" isolate (SBMV-ARK) described in the USA. The results obtained in the present work indicate that SBMV-SP and SBMV-ARK are closely related isolates of the same virus.

Additional keywords: commom bean, Sobemovirus, SBMV, sequencing.

O isolado americano do Southern bean mosaic virus (SBMV), gênero Sobemovirus, já se encontra bem caracterizado, havendo relatos sobre a estrutura do vírion (Hull, 1977), propriedades da capa proteica (Sheperd, 1971), do genoma (Weber & Sehgal, 1982), seqüenciamento e tradução in vitro de cada uma das ORFs (Othman & Hull, 1995) e interação com a planta hospedeira através de microscopia eletrônica de transmissão (Weintraub & Ragetli, 1970).

O genoma dos sobemovírus possui quatro ORFs que se sobrepõem (Van Regenmortel et al., 2000), com exceção para o SBMV que possui somente três ORFs não sobrepostas (Othman & Hull, 1995). Ao SBMV falta a pequena ORF3 que é, entretanto, encontrada no isolado "Arkansas" (SBMV-ARK; Lee & Anderson, 1998). Foi proposto (Lee & Anderson, 1998) que as diferenças na organização do genoma entre o SBMV e o SBMV-ARK resultariam de mutações ou erros no seqüenciamento de nucleotídeos do SBMV.

No Brasil, o SBMV foi detectado pela primeira vez em feijoeiros (Phaseolus vulgaris L.) na região do Distrito Federal (SBMV-DF; Cupertino et al., 1982) e, posteriormente, mas ainda nos anos 80, no Estado de São Paulo (SBMV-SP; A. S. Costa, dados não publicados). Mais recentemente, o vírus foi também encontrado no Estado do Paraná (SBMV-PR, Gasparin et al., 2005). Algumas propriedades moleculares foram determinadas para o isolado SBMV-SP: (a) as partículas virais apresentam diâmetro de 28-30 nm e a proteína capsidial possui massa molecular de 30 kDa; (b) das partículas virais foram extraídos RNAs de vários tamanhos, sendo o de 4,2 Kb o RNA genômico e o de 1,0 Kb supostamente um RNA subgenômico que codifica a proteína capsidial (Moreira & Gaspar, 2002).

A região 5'-terminal do SBMV-SP foi caracterizada (Espinha et al., 2004), evidenciando-se uma região não codificadora, com 92 nt, precedendo o códon de iniciação da ORF1. Nesta região está contido um segmento parcialmente complementar ao RNA ribossomal. A ORF1 codifica uma proteína de 147 aminoácidos com massa molecular estimada em 17.080 Da. Foi também evidenciado que a extremidade 3' da ORF1 sobrepõe a ORF2.

No presente trabalho descreve-se a caracterização da região 3'-terminal do genoma do isolado do SBMV encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). Este isolado foi gentilmente cedido pelo Dr. Álvaro Santos Costa (Instituto Agronômico de Campinas), inoculado em feijoeiro comum cv. Rosinha e mantido em casa de vegetação com temperatura controlada ao redor de 28 ºC.

O vírus foi purificado seguindo-se o protocolo descrito por Moreira & Gaspar (2002). Para extração do RNA, uma alíquota do vírus purificado foi tratada com SDS 2,5% e NaCl 0,1 M com aquecimento por 3 min à 55 ºC. Em seguida foi acrescentado igual volume de fenol (equilibrado com tampão citrato de sódio 0,1 M, pH 4,3), agitada manualmente por 30 s e, então, centrifugada para a separação das fases. A fase aquosa foi novamente extraída com fenol e, após centrifugação, o ácido nucleico foi precipitado da fase aquosa pela adição de 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, e três volumes de etanol por 1 h à -70 ºC. Em seguida, a mistura foi submetida à centrifugação a 12.000 g por 15 min e o "pellet" foi secado à 37 ºC por 10 min e solubilizado em água tratada com DEPC.

Para a produção do DNA complementar (cDNA) ao RNA viral, foi utilizado um volume de reação de 20 ml consistindo de 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,1 mM de cada dNTP, 2 µl do oligonucleotídeo anti-senso (descrito abaixo) na concentração de 10 pmol/µl, duas unidades de inibidor de RNAse, 1-3 µg de RNA viral desnaturado à 95 ºC por 5 min e 40 unidades de transcriptase reversa "Superscript II" (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A mistura de reação permaneceu por 2 h à 42 ºC.

Para amplificar o gene da proteína capsidial foram utilizados oligonucleotídeos que cobrem a seqüência dos nucleotídeos 3164 a 4136, compreendendo região de 972 pares de bases, de acordo com a seqüência do SBMV-ARK (Lee & Anderson, 1998). A seqüência do par de oligonucleotídeos é: Senso, 5'-CATCGCCCCACAAAACTAAT-3' (localizado 42 nt anteriores ao códon de iniciação da ORF4) e Anti-senso, 5'-ACTTTTGGATTACGCTCCATC-3' (localizado 108 nt posteriores ao códon de terminação UGA da ORF4). O volume da reação da PCR foi de 25 ml consistindo de tampão (Tris-HCl 20mM pH 8,4, KCl 50 mM), 5 mM de MgCl_2, 0,2 mM de cada dNTP, 2 µl de cada oligonucleotídeo (senso e anti-senso) na concentração de 10 pmol/µl; 1µl da mistura da reação de cDNA e duas unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen). O programa da PCR, realizado em um termociclador "MiniCycler" (MJ Research, San Francisco, CA, EUA) envolveu uma desnaturação inicial a 94 ºC por 4 min e 30 ciclos com 1 min de desnaturação a 94 ºC, 1 min de anelamento a 45 ºC e 1 min de extensão a 72 ºC. Após os 30 ciclos foi feita a extensão final por 10 min a 72 ºC. Os fragmentos de DNA amplificados foram separados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo e visualizados sob luz ultravioleta.

O produto de amplificação foi clonado utilizando-se o "SureClone^™ Ligation Kit" (Amersham Biosciences, San Francisco, CA, EUA) e a extração do plasmídeo recombinante realizada com o "Concert Rapid Plasmid Miniprep System Kit" (Invitrogen) de acordo com instruções dos fabricantes. Após a extração do DNA plasmidial das células selecionadas, foram feitas digestões com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI para comprovar a formação do recombinante. Os DNAs plasmidiais purificados foram seqüenciados pela técnica de terminação em cadeia utilizando-se o seqüenciador automático ABI Prism 377 (Applied Biosystems, Norwalk, CT, EUA) e o "Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystems), seguindo-se as recomendações do fabricante. O seqüenciamento de cinco clones foi realizado nos dois sentidos de leitura. Análises comparativas com seqüências existentes no "GenBank" foram feitas através do algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

O alinhamento das seqüências foi efetuado pelo programa CLUSTAL W (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html) com o objetivo de obter relações filogenéticas pelo método "neighbor-joining", como implementado no programa PAUP v.4.0b10 (Swofford, 1997). A análise de "bootstrap" consistiu de 500 réplicas e a árvore foi construída usando o programa Tree View 1.6.1. (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html).

A ORF 4 (gene da proteína capsidial) do SBMV-SP contém 801 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. A seqüência do gene codificador da proteína capsidial do SBMV-SP (Figura 1), quando comparada com seqüências depositadas no GenBank (Tabela 1), mostrou que este isolado é mais proximamente relacionado ao isolado "Arkansas" descrito nos EUA (SBMV-ARK; Lee & Anderson, 1998). Existe entre esses isolados 91% de identidade na seqüência de nucleotídeos e 93% de identidade na seqüência de aminoácidos. Em ordem decrescente de identidade, dentro da mesma família, estão o SBMV (Othman & Hull, 1995), o Sesbania mosaic virus (SeMV), o Southern cowpea mosaic virus (SCPMV) e o Lucerne transient streak virus (LTSV). Seqüências de outros sobemovírus analisados não mostraram identidade significativa com o SBMV-SP. A análise filogenética (Figura 2A) realizada com base nas seqüências de aminoácidos correspondentes às proteínas capsidiais de alguns sobemovírus agrupou o SBMV-SP e o SBMV-ARK no mesmo ramo em 69% das réplicas, indicando maior proximidade entre eles. O agrupamento do SBMV-SP e SBMV-ARK apresentou-se fortemente relacionado com o SBMV (100%) e o SeMV (91%).

Os 61 aminoácidos terminais da ORF2 sobrepõem a ORF 4 e apresentam 92% de identidade com o SBMV-ARK (Figura 1). Essa sobreposição, assim como aquela existente entre as ORF1 e a ORF2 do SBMV-SP (Espinha et al., 2004), corroboram a proposta de Lee & Anderson (1998) de que deve ter ocorrido erro no seqüenciamento do SBMV (Othaman & Hull, 1995), já que este isolado apresenta somente três ORFs que não se sobrepõem, diferenciando-se dos demais sobemovírus que possuem quatro ORFs sobrepostas.

A região 3' não codificadora do SBMV-SP apresenta 129 nucleotídeos (Figura 1) e, ao ser comparada com outros isolados e espécies de sobemovírus, apresentou 97% de identidade com o isolado Arkansas, 94% com o SBMV, 29% com o SeMV e 22% com o SCPMV (Tabela 1).

O domínio R, localizado próximo ao terminal 5' da ORF 4, é uma região da cadeia polipeptídica rica em arginina, lisina, prolina e glutamina, voltada para o interior da partícula, onde interage com o RNA (Abad-Zapatero et al., 1980). Nessa região, os genomas do SBMV e do SCPMV apresentam um sinal de localização nuclear (Dingwall & Laskey, 1991), o qual poderia estar relacionado com a presença de partículas desses dois vírus no núcleo celular, um fato já demostrado por Weintraub & Ragetli (1970). O alinhamento (Figura 2B) das regiões do domínio R do SBMV-SP, SBMV-ARK, SBMV e SCPMV mostrou haver diferença não só no número (cinco a mais no SBMV-SP e SBMV-ARK) como na seqüência de aminoácidos. SBMV e SCPMV possuem o sinal de localização nuclear do tipo bipartido (consenso: (K/R)₂ X_10-12 (K/R)₃), ausente no SBMV- SP e SBMV-ARK. Estudos preliminares ao microscópio eletrônico e de fracionamento celular sugeriram que o SBMV-SP está ausente do núcleo de células infettadas, mas não há estudos similares com o SBMV-ARK. A ausência do SBMV-SP no núcleo celular é ainda mais instigante levando-se em conta o fato de que Muñoz & Kitajima (1990) citaram a presença, no núcleo celular, de partículas do isolado do SBMV encontrado no Distrito Federal (SBMV-DF). Isso abre a possibilidade de que ocorram diferentes isolados do SBMV no Brasil e o seqüenciamento do gene da proteína capsidial do SBMV-DF poderá elucidar essas questões.

Aceito para publicação em 13/07/2005

Autor para correspondência: José Osmar Gaspar

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Parte da Tese de Doutorado da primeira autora. Universidade Estadual Paulista (2003). Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES. Seqüência depositadano GenBank com o número de acesso AY340586;

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Bolsista da CAPES;

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Bolsista do CNPq.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Out 2005
• Data do Fascículo
  Out 2005