Agressividade de linhagens de Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Tipo C em lima ácida 'Galego'

Aggressiveness of Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Type C strains in 'Mexican' Lime

ARTIGOS ARTICLES

Agressividade de linhagens de Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Tipo C em lima ácida 'Galego'^*

Aggressiveness of Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Type C strains in 'Mexican' Lime

Letícia A. S. NocitiI, ^**; Margarete Camargo^I; Júlio Rodrigues Neto^II; Fabrício J. B. Francischini^III; José Belasque Júnior^IV

^IDepartamento de Fitossanidade, Universidade Estadual Paulista, Campus Jaboticabal, CEP 14884-900, Jaboticabal, SP

^IILaboratório de Bacteriologia Vegetal, Instituto Biológico, CEP 13094-430, Campinas, SP

^IIIDepartamento de Microbiologia Agrícola, Universidade Estadual Paulista, Campus Jaboticabal, CEP 14884-900, Jaboticabal, SP

^IVDepartamento Científico, Fundecitrus, Cx. Postal 391, CEP 14801-970, Araraquara, SP, e-mail: [e-mail]

RESUMO

O presente trabalho objetivou gerar informações referentes à agressividade de linhagens de Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii Tipo C(Xaa-C), produtoras (PP) e não produtoras de pigmento (NP) escuro em meio de cultura, comparativamente a X. axonopodis pv. citri Tipo A (Xac) . Os tratamentos foram formados por 14 linhagens, sendo sete de Xaa-C PP, cinco Xaa-C NP, e duas linhagens de Xac. As linhagens foram inoculadas através de ferimentos, em folhas de lima ácida 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle), com agulha previamente mergulhada em uma suspensão de células bacterianas (10⁷ UFC/mL). Foram realizadas dez repetições para cada tratamento, representadas por uma planta cada. As plantas foram mantidas em casa de vegetação durante todo o experimento. As linhagens diferiram entre si quanto ao período de incubação, diâmetro e populações bacterianas das lesões e, comparativamente, Xaa-C NP mostraram-se mais agressivas do que Xaa-C PP. Algumas linhagens induziram sintomas que diferiram quanto à presença e extensão de anasarca, halo amarelo e saliência do tecido necrosado.

Palavras-chave adicionais: cancro cítrico, patogenicidade, interação patógeno-hospedeiro.

ABSTRACT

The purpose of this research was to provide the information about the aggressiveness of strains of Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii – strains C (Xaa-C), producer (PP) or not of dark pigment (NP) in culture medium in comparison with X. axonopodis pv. citri – strains A (Xac). A total of 14 strains were inoculated by needle wounds in 'Mexican' Lime (Citrus aurantifolia) leaves, with bacterial cell suspension (10⁷ CFU/mL): seven were Xaa-C PP, five were not producers and two were Xac strains. Ten replications of one plant each were used in each treatment. The plants were kept in greenhouse during the experiment. The strains differed on incubation period, lesion size and population growth. Xaa NP was more aggressive than PP. Symptoms induced by some strains varied in terms of water-soaked, chlorotic halos and necrosis.

Additional keywords: citrus canker, pathogenicity, host-pathogen interaction.

INTRODUÇÃO

A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa-C) agente causal da cancrose da lima ácida 'Galego' (Citrus aurantifolia Swingle) ou cancrose C, foi observada primeiramente em 1963 em algumas regiões do Estado de São Paulo por Namekata (1971), induzindo sintomas hiperplásticos, semelhantes aos de cancro cítrico Asiático causado por X. axonopodis pv. citri (Xac), tais como lesões salientes, corticosas, pardacentas, circundadas muitas vezes por halo amarelo na superfície de ramos, folhas e frutos (Civerolo, 1994; Stall & Civerolo, 1991). Xaa-C é considerada patogênica apenas à lima ácida 'Galego', induzindo reação de hipersensibilidade quando inoculada em folhas de outras espécies cítricas (Malavolta Júnior et al., 1987). Atualmente, a ocorrência de Xaa-C está restrita a alguns municípios do Estado de São Paulo, não causando danos economicamente significativos.

Recentemente, Destéfano & Rodrigues Neto (2001) detectaram linhagens de Xaa-C produtoras de pigmento escuro (provavelmente melanina) em meio de cultura artificial. A produção de pigmento escuro tem sido observada em algumas espécies e patovares do gênero Xanthomonas, como por exemplo X. axonopodis pv. bauhiniae, pv. ricini, pv. punicae e pv. phaseoli, e X. campestris pv. laureliae (Swings et al. 1993). De acordo com Gilbertson et al. (1990), a produção de pigmento escuro em fitobactérias pode representar fatores diferenciais como sobrevivência em condições adversas, na resposta ou inibição de substâncias produzidas por microrganismos antagonistas ou ainda como proteção contra mecanismos de defesa das plantas.

Em relação à patogenicidade, Ekpo & Saettler (1976) avaliaram a agressividade de linhagens de X. phaseoli e X. phaseoli var. fuscans (produtoras de pigmento escuro) em cultivares de Phaseolus vulgaris L., concluindo que as linhagens produtoras de pigmento escuro foram mais agressivas. O mesmo comportamento foi observado por Schuster & Coyne (1981).

Outros estudos têm demonstrado que linhagens de X. axonopodis pv. phaseoli produtoras e não produtoras de pigmento podem formar grupos distintos com variabilidade sorológica (Maringoni et al., 1994; Oleas-Arias, 1982) e variações nos perfis gerados por PCR (Halfeld-Vieira et al., 2001) e RAPD (Birch et al., 1997). Com relação às linhagens de Xaa-C produtoras e não produtoras de pigmento, os estudos iniciais realizados com 20 linhagens (Destéfano & Rodrigues Neto, 2001) revelaram uniformidade entre as linhagens por meio de caracterização molecular baseada no polimorfismo da região espaçadora 16S-23S, e, aparentemente, não mostraram diferenças em patogenicidade à lima ácida 'Galego'.

Considerando a inexistência de informações a respeito da agressividade de linhagens de Xaa-C produtoras e não produtoras de pigmento escuro em meio de cultura, o presente trabalho teve como objetivo comparar a agressividade entre estas linhagens.

MATERIAL E MÉTODOS

Culturas bacterianas e preparo do inóculo

Sete linhagens de Xaa-C produtoras de pigmento (PP), cinco não produtoras de pigmento (NP) obtidas junto à coleção IBSBF¹ e incorporadas ao acervo da Coleção de Culturas do Fundo de Defesa da Citricultura [Fundecitrus] (Tabela1) foram reativadas em meio de cultura nutriente-ágar [NA] (extrato de carne, 3g; peptona, 5g; cloreto de sódio, 5g; ágar 15 g/L de água; pH 7,0) e incubadas a 28 ºC durante 48 h.

Em seguida, foram preparadas suspensões em água destilada esterilizada e a concentração ajustada para 3,4 x 10⁸ UFC/mL (51% de transmitância a 480 nm em espectrofotômetro), sendo efetuadas diluições seriadas para obtenção da concentração final de 10⁷ UFC/mL. Duas linhagens de Xac (FDC 738 e 075) foram incluídas nos testes a título de comparação.

Avaliação da agressividade

As linhagens foram inoculadas em plantas de lima ácida 'Galego' mantidas em vasos e em casa de vegetação perfurando-se o limbo foliar com uma agulha de 0,56 mm de diâmetro mergulhada na suspensão bacteriana. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 14 tratamentos (linhagens) e 10 repetições representadas por uma planta cada. Foram inoculadas 12 folhas medianas/planta com seis ferimentos cada. As plantas foram mantidas em câmara úmida por 72 h após a inoculação, sendo observadas diariamente quanto ao aparecimento de necrose no sítio de inoculação. Para determinação do período de incubação foi considerada como planta doente aquela com mais de 50% das folhas inoculadas com pelo menos um dos sítios de inoculação apresentando sintomas, sendo que o período de incubação para cada tratamento correspondeu a média do número de dias decorridos da inoculação até o aparecimento de sintomas em cada planta.

O diâmetro médio das lesões foi avaliado aos 22, 36, 51, 64, 83 e 94 dias após a inoculação (DAI). Em cada data de avaliação mensurou-se os diâmetros de seis lesões/folha, tendo sido avaliada uma folha por planta, com utilização de micrômetro. Mensurou-se sempre a mesma folha para avaliar a evolução do diâmetro da lesão. A presença de halo amarelo ao redor da necrose foi desconsiderada nas avaliações de diâmetro.

A área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) foi calculada com os dados de diâmetro médio pela integração trapezoidal:

sendo X o diâmetro da lesão, em milímetros, t o tempo, em dias, e n o número de dados existentes.

Avaliação da população bacteriana nas lesões

De cada planta foi selecionada uma folha e retirado um pedaço de tecido com lesão com auxílio de um cortador com 5,35 mm de diâmetro aos 22, 36, 51, 64, 83 e 94 dias após a inoculação. Imediatamente após o corte, os tecidos contendo as lesões foram colocados em 1,0 mL de água destilada esterilizada e deixados em repouso durante 18 h a 4 ºC. A suspensão resultante foi diluída em série e semeada em NA, sendo realizadas três repetições para cada diluição, e as placas mantidas a 28 ºC. Após 48 h procedeu-se a contagem do número de colônias típicas de Xanthomonas.

Análise Estatística

Os resultados de período de incubação, diâmetro médio das lesões em cada data de avaliação e AACPD foram analisados pelo programa ESTAT- Sistema para Análises Estatísticas (Pólo Computacional/ Depto. de Ciências Exatas, Unesp- FCAV- Campus de Jaboticabal) e submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Utilizando-se os dados de diâmetro médio de cada linhagem, foram ajustadas retas por regressão linear e estas comparadas entre si, duas a duas, quanto a coincidência de retas (teste F) e ao coeficiente angular (b) (teste t). Todas as linhagens foram comparadas entre si por contrastes, estabelecidos com os dados do período de incubação, diâmetro das lesões e AACPD.

Sintomatologia

As linhagens foram comparadas com relação a indução de sintomas em plantas de lima ácida 'Galego', sendo as diferenças observadas visualmente aos 94 dias após a inoculação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Todas as linhagens de Xaa-C e Xac induziram sintomas típicos de cancrose. O período médio de incubação foi diferente entre as linhagens com os sintomas tornando-se visíveis entre 9,1 e 17,3 DAI (Figura 1). As duas linhagens de Xac (FDC-738 e 075) induziram sintomas típicos aos 9,1 dias após a inoculação diferindo estatisticamente de todas as demais linhagens de Xaa-C, que induziram sintomas entre 15 e 17,3 dias. Estes resultados diferem dos obtidos por Malavolta Júnior et al. (1987) que observaram período de incubação de seis a nove dias para Xaa-C e de quatro a cinco dias para Xac. Essas diferenças podem ser atribuídas ao método de inoculação (infiltração), condições ambientais e concentrações bacterianas utilizadas nos testes. Foram observadas diferenças entre as linhagens de Xaa-C, sendo que as linhagens FDC 751 e 536 PP induziram sintomas aos 15,2 DAI, com o menor período entre as linhagens de Xaa-C e diferindo estatisticamente das linhagens FDC 578, 791, 766 e 537. A linhagem FDC 766 PP induziu sintomas aos 17,3 DAI, apresentando o maior período incubação e diferindo da linhagem FDC 867 NP que induziu sintomas aos 15,6 DAI. As demais linhagens de Xaa-C apresentaram período de incubação intermediário entre 15,8 e 16,4 DAI, não diferindo significativamente entre si e dos tratamentos com menores e maiores períodos de incubação.

Durante o período de avaliação do experimento (94 dias), as lesões evoluíram continuamente (Figura 2). Os diâmetros médios das lesões variaram de 1,28 a 5,15 mm, entretanto, as lesões induzidas pelas duas linhagens de Xac foram superiores aos observados nos demais tratamentos. Os diâmetros das lesões causadas pelas linhagens de Xaa-C PP foram inferiores aos observados para as linhagens NP. Os diâmetros médios das lesões diferiram significativamente pelo teste de comparação de médias (Tukey, 5%) aos 22, 36, 51, 64, 83 e 94 DAI. As duas linhagens de Xac (FDC 075 e 738) diferiram das demais linhagens de Xaa-C, entretanto aos 22 DAI a linhagem FDC 738 não diferiu das linhagens de Xaa-C FDC 536 PP, 763 NP, 828 NP e 867 NP. Entre as linhagens de Xaa-C foram observadas diferenças nos diâmetros em todas as avaliações, sendo que a linhagem 537 PP foi a que apresentou menor diâmetro médio aos 22, 36, 51, 64, 83 e 94 DAI (Tabela 2).

Com relação a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) observou-se que as linhagens de Xac apresentaram os maiores valores diferindo significativamente das linhagens de Xaa-C (Figura 3). Entre as linhagens de Xaa-C maiores valores foram observados para as linhagens não produtoras de pigmento FDC 763, 828 e 867. O menor valor observado de AACPD foi para as linhagens produtoras de pigmento FDC 535, 537, 751, 766 e 791 que diferiram significativamente das demais linhagens. As linhagens FDC 536 PP, 725 PP, 578 NP e 752 NP apresentaram valores intermediários e não diferiram entre si, porém, diferiram significativamente da linhagem FDC 763 NP e das linhagens com menores valores de AACPD.

Com os dados de diâmetro médio de cada linhagem foram ajustadas retas por regressão linear, uma para cada tratamento, e estas foram comparadas entre si quanto a coincidência das retas e o coeficiente angular (b). Dentre os tratamentos, apenas para a linhagem FDC 791 não foi possível o ajuste de uma equação linear (F não significativo a 5%). Os menores valores de coeficientes angulares (b) foram observados nas linhagens FDC 535, 537, 751, 766 e 791, enquanto que os maiores ocorreram para FDC 536, 725, 578, 752, 763, 828, 867, 738 e 075 (Tabela 3).

No teste de coincidência das retas verificaram-se diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 4), sendo possível observar quais linhagens apresentaram desenvolvimentos diferentes de lesões (em diâmetro) ao longo do tempo considerando-se os parâmetros a e b. As linhagens que mais diferiram nas comparações foram FDC 738 e 075 (Xac), as quais apresentaram os menores valores de a (0,5974 e 0,7769, respectivamente) e maiores de b (0,0488 e 0,0437, respectivamente) e as FDC 763 e 828 que apresentaram valores intermediários para a (1,0053 e 1,1705, respectivamente) e b (0,0179 e 0,0221, respectivamente).

Pelos valores do teste t verificou-se que as linhagens diferiram entre si quanto a taxa de incremento da doença durante todo o período de avaliação (Tabela 5). As linhagens FDC 763, 738 e 075 foram as que apresentaram o maior número de diferenças significativas (12) em relação as demais linhagens. Estas linhagens possuem os maiores valores de b (0,0221, 0,0488 e 0,0437, respectivamente) entre todos os tratamentos (Tabela 3). A linhagem FDC 725 apresentou o menor número de diferenças significativas (cinco) em relação as demais linhagens.

A população bacteriana nas lesões de Xac apresentou-se crescente até aproximadamente 80 DAI, enquanto que nas lesões de Xaa-C a população bacteriana decresceu aos 30 DAI (Figura 4). Em todas as avaliações as populações de Xac foram superiores as de Xaa-C. Shiotani et al. (2000), comparando linhagens de Xac e X. axonopodis pv. aurantifolii (patotipo B), observaram que as populações bacterianas nas lesões de Xaa-B nas espécies Citrus grandis Osbeck (pomelo 'Otachibana') e Citrus sinensis Osbeck (navel orange) decresceram a partir do terceiro DAI e a de Xac permaneceu em contínuo crescimento.

Quanto às diferenças na sintomatologia, as duas linhagens de Xac (FDC 075 e 738) induziram lesões com maior diâmetro, maior saliência, necrosadas e circundadas por halo amarelo em comparação a linhagem de Xaa-C [FDC 725] (Figura 5A). Neste aspecto, Gabriel (1988) menciona que linhagens de diferentes patovares geralmente induzem diferentes sintomas no mesmo hospedeiro. Entre as linhagens de Xaa-C, observou-se que a linhagem FDC 763 (NP) induziu necrose e anasarca pronunciadas com halo amarelo, enquanto que para a linhagem 828 NP foram observadas lesões sem saliência (lisa em ambas as faces), ausência de halo amarelo com anasarca bem pronunciada (Figura 5B), assemelhando-se aos sintomas induzidos por X. axonopodis pv. citrumelo (Schouties et al., 1987). Por outro lado, a linhagem FDC 536 PP induziu lesões com anasarca sem halo amarelo (Figura 5C).

Com base nos resultados obtidos pôde-se claramente caracterizar dois grupos distintos em termos de agressividade entre as linhagens de Xaa-C, o que correlacionou-se com a capacidade de produção de pigmento escuro em meio de cultura. As linhagens PP foram menos agressivas que as linhagens NP, e ambos os grupos apresentaram reduzida agressividade em comparação com Xac. A comparação por contrastes ortogonais permite facilmente a separação de Xac e Xaa-C (PP e NP) em três grupos distintos de agressividade (Tabela 6). As linhagens de Xaa-C NP não diferiram de PP quanto ao período de incubação e diâmetro das lesões aos 22 e 36 DAI, mas diferenças ocorreram nas demais avaliações de diâmetro e para AACPD, com superioridade para NP. Diferenças entre Xac e Xaa-C ocorreram em todos os parâmetros e datas de avaliação.

Em X. axonopodis pv. phaseoli (sin. X. phaseoli var. fuscans), a produção de pigmento foi correlacionada com uma maior virulência (Basu & Wallen, 1967; Ekpo & Saettler, 1976). Em desacordo com essa observação, no presente estudo observou-se que as linhagens produtoras de pigmento foram menos agressivas que as não produtoras. Baseado nas diferenças em agressividade observadas é possível gerar informações úteis para melhor conhecimento da interação hospedeiro/patógeno, bem como contribuir para identificação dos mecanismos de patogenicidade desses patógenos.

Aceito para publicação em 08/02/2006

Autor para correspondência: José Belasque Júnior

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*

Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. Universidade Estadual Paulista. Jaboticabal SP. 2005.

**

Bolsista CNPq

1

IBSBF = Coleção de Culturas de Fitobactérias, Laboratório de Bacteriologia Vegetal, Instituto Biológico, Campinas, SP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Set 2006
• Data do Fascículo
  Abr 2006