Detecção do Sugarcane mosaic virus no Paraná e limpeza somaclonal por cultura de tecidos

Detection of Sugarcane mosaic virus in Paraná state and virus elimination by tissue culture

COMUNICAÇÕES COMMUNICATIONS

Detecção do Sugarcane mosaic virus no Paraná e limpeza somaclonal por cultura de tecidos

Detection of Sugarcane mosaic virus in Paraná state and virus elimination by tissue culture

Antônio A.L. Barboza; Hélio M. Silva Júnior; Eliezer R. Souto; Clandio M. Silva; Fernanda S. Marcuz; Rafael A. Vieira

Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo 5790, CEP 87020-900, Maringá, PR, Brasil, e-mail: [e-mail]

RESUMO

Um isolado do Sugarcane mosaic virus (SCMV) causando sintomas de mosaico em plantas de cana-de-açúcar do clone RB925268 foi identificado no estado do Paraná. Gemas axilares extraídas de colmos infectados, medindo de 4 a 8 mm, foram utilizadas como explantes e regeneradas em plântulas em meio de cultura MS, suplementado ou não com o antiviral ribavirina, nas concentrações variando de 10-60 mg/L. O efeito fitotóxico da ribavirina foi constatado, resultando na morte dos explantes em concentrações iguais ou superiores a 30 mg/L. Após seis meses de aclimatação das plantas em estufa plástica, o vírus não foi detectado nas plantas provenientes do meio MS contendo ribavirina na concentração de 25 mg/L, confirmado através dos ensaios de inoculação mecânica em sorgo 'Rio' e de RT-PCR.

Palavras-chave adicionais: micropropagação, virazole.

ABSTRACT

An isolate of Sugarcane mosaic virus (SCMV) associated with mosaic symptoms in the RB925268 sugarcane clone was identified in Paraná state. Axilary buds of 4 to 8 mm used as explants were regenerated into plantlets using MS medium with and without ribavirin antiviral, at concentrations of 10 to 60 mg/L. Ribavirin was toxic to sugarcane at all concentrations, resulting in plant death at concentrations of 30 mg/L or higher. The complete elimination of SCMV was obtained in MS medium with 25 mg/L ribavirin concentration, confirmed by sap inoculation into Sorghum bicolor cv. Rio and by RT-PCR.

Additional keywords: micropropagation, virazole.

A cana-de-açúcar (Saccharum L. híbridos interespecíficos) é vulnerável a diversas doenças disseminadas pelo uso de colmos contaminados, sendo que a monocultura em extensas áreas favorece o surgimento de epidemias. A planta matriz pode se mostrar infectada sem apresentar qualquer sintoma externo, aumentando os riscos de disseminação de doenças para novas áreas (Chatenet et al., 2001).

Um complexo de vírus está associado ao mosaico em diferentes espécies de Poacea, do qual fazem parte o SCMV, o Sorghum mosaic virus (SrMV), o Maize dwarf mosaic virus (MDMV), o Johnsongrass mosaic virus (JGMV) (Shukla et al., 1994), e o Zea mosaic virus (ZeMV) (Seifers et al., 2000), pertencentes ao gênero Potyvirus, família Potyviridae. O mosaico da cana-de-açúcar ocorre em mais de 70 países, sendo que apenas o SCMV e o SrMV podem infectar cana-de-açúcar em condições naturais (Alegria et al., 2003).

A eliminação de vírus de plantas de material propagativo tem sido obtida através de três métodos principais: termoterapia, quimioterapia e cultura de tecidos (Grout, 1999). A cultura de tecidos da cana-de-açúcar tem sido utilizada pelos programas de melhoramento devido à redução no tempo de multiplicação de clones e de variedades promissoras, facilitando a rápida obtenção de grandes quantidades de material propagativo do genótipo de interesse, além da eliminação de um grande número de patógenos (Hendre et al., 1983). A ribavirina (1-b-D-ribofuranosil-I, 2,4-triazole-3-carboxamida), análogo da guanosina, é um composto antiviral de amplo espectro que interfere na rota biossintética da guanosina 5'-fosfato, interrompendo a síntese do RNA e de DNA nas células infectadas, inibindo desse modo a replicação viral nos tecidos infectados (Sidwell et al., 1972). No presente trabalho é relatada a detecção de um isolado do SCMV no clone RB925268, e a sua eliminação de plantas micropropagadas em meio de cultura MS, suplementado ou não com o antiviral ribavirina.

Folhas de plantas de cana-de-açúcar do clone RB925268 cultivadas numa área experimental do município de São Tomé, Paraná, e com sintomas de mosaico, foram utilizadas em inoculações mecânicas de mudas de sorgo 'Rio' para manutenção do isolado viral. Posteriormente, o inóculo obtido dessas plantas foi utilizado em inoculações mecânicas de espécies de Brachiaria, cultivares de sorgo e milho, Avena strigosa, Chenopodium quinoa, C. amaranticolor, Datura stramonium e Nicotiana tabacum. Plantas dessas mesmas espécies também foram inoculadas com um isolado do SCMV da variedade RB72454, proveniente do Centro de Tecnologia Canavieira, Piracicaba, São Paulo (CTC). Após a manifestação de sintomas, folhas de sorgo 'Rio' foram examinadas por microscopia eletrônica de imunoadsorção (ISEM) com um anti-soro policlonal produzido para um isolado americano do SrMV. Foram extraídos RNAs totais de 100 mg de folhas de sorgo 'Rio' conforme o protocolo descrito por Yang e Mirkov (1997) com modificações, a partir de plantas submetidas à inoculação com os isolados de SCMV do clone RB925268 e da variedade RB72454. Para a síntese de cDNA, foram utilizados 10 µL de RNAs totais obtidos nas extrações foliares, adicionados a 4 µL da solução (10 µg/L) do oligonucleotídeo hexamero randômico pd(N)6, seguido de um aquecimento a 80ºC por 3 min, e resfriamento em gelo. A seguir foram adicionados 6 µL do tampão de transcrição reversa 10x (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), 2 µL de MgCl₂ (25 mM), 1 µL da mistura de dNTPs (10 mM de cada), 2 µL de DTT (0,1M) e 2 µL da enzima transcriptase reversa do M-MLV (Invitrogen®) (50 U/L). Finalmente foram adicionados 6 L de água tratada com DEPC. As amostras foram incubadas a 25ºC por 10 min e a 42ºC por 50 min. As soluções de PCR foram preparadas em um volume total de 40 L, contendo 1 µL da mistura de dNTPs (10 mM cada), 0,5 µL de Taq DNA Polimerase (Invitrogen®) (5 U/µL), 5 µL de tampão PCR 10x (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 0,5 M KCl), 3 µL de MgCl₂ (25 mM), 5 µL do produto da síntese de cDNA, 21,5 µL de água destilada e deionizada, e 2 µL de cada oligonucleotídeo (10 M). Foram utilizados os oligonucleotídeos SCMV-F (5'-CCCTCTAGATTTYCACCAAGCTGGAA-3', senso) e SCMV-R (5'-CCCAAGCTTAGCTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3', anti-senso), utilizados no CTC para detecção do SCMV, e os oligonucleotídeos SrMV-F3 (senso) e SrMV-R3 (anti-senso), para detecção do SrMV (Yang & Mirkov, 1997). Estes oligonucleotídeos amplificam as ORFs (open reading frames) correspondentes às proteínas capsidiais desses vírus. Quarenta ciclos de reação foram conduzidos com desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento a 55ºC e extensão a 72ºC, seguido de um ciclo de 72ºC por 15 min. Alíquotas de 10 µL dos produtos de PCR foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose a 1,2%, corado com brometo de etídio (10 mg/mL).

Na cultura de tecidos foram utilizadas gemas axilares obtidas de colmos de cana-de-açúcar do clone RB925268, germinadas em bandejas com vermiculita e substrato Plantimax®. Meristemas com quatro folhas primárias foram extraídos e colocados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962), e meio MS suplementado com 10-60 mg/L de Ribavirina®. Os ápices meristemáticos foram estabelecidos em tubos de ensaio mantidos a 25ºC com fotoperíodo de 12 horas, e após trinta dias transferidos para frascos de cultivo mantidos nas mesmas condições. As plântulas crescidas (3-4 cm) foram transferidas para meio indutor de enraizamento contendo 0,1 mg/L do ácido a-naftalenoacético. Após 6 meses desde o início do processo, as plântulas com raízes formadas foram transferidas para vasos plásticos, para desenvolvimento e aclimatação em estufa plástica. Folhas dessas plantas foram utilizadas nos ensaios de transmissão mecânica experimental em sorgo 'Rio' e nos ensaios de RT-PCR, para confirmação da eliminação do vírus.

Foi observado que das espécies botânicas submetidas à inoculação, somente as poáceas apresentaram sintomas, sendo que o isolado da variedade RB72454 causou sintomas mais severos e com manifestação mais rápida em cana-de-açúcar, em comparação com o isolado do clone RB925268. Recentemente, um número expressivo de isolados do SCMV, obtidos de cana-de-açúcar, milho e sorgo, no Estado de São Paulo, foram identificados, sendo observado que um deles foi capaz de quebrar a resistência da variedade RB72454 (Gonçalves et al., 2007), causando sintomas severos, semelhantes aos induzidos pelo isolado proveniente de São Paulo, utilizado neste trabalho. Os exames de ISEM com adsorção de anti-soro para o SrMV mostraram uma reação fraca contra o isolado da variedade RB72454 e contra o isolado do clone RB925268 (Figura 1B). Todavia, com base apenas neste resultado não foi possível concluir que os isolados testados são da espécie SrMV, uma vez que os relacionamentos sorológicos baseados na proteína da capa de potyvírus são complexos, sendo comum a ocorrência de relacionamentos sorológicos entre espécies distintas e ausência de reações cruzadas entre estirpes (Shukla et al., 1994). No entanto, as reações de RT-PCR amplificaram consistentemente, bandas de aproximadamente 940 pb, apenas com o par de oligonucleotídeos para o SCMV (Figura 2 e 3).

As plântulas regeneradas nos meios contendo 10 a 25 mg/L de ribavirina se mostraram raquíticas, amareladas e deformadas. Ao final de 5 meses de cultivo in vitro, uma quantidade reduzida de plântulas sobreviveu, sendo necessária uma nova repicagem final para a obtenção de mudas, que foram aclimatadas em estufa plástica durante 6 meses (Tabela 1, A-E).

Foi constatada a eliminação do SCMV de 97 a 100% das plantas micropropagadas no meio MS suplementado com ribavirina nas concentrações de 20-25 mg/L. Nas concentrações de 10-15 mg/L, a porcentagem de plantas sadias ficou próxima à do controle, 60%, e as plântulas mantidas em meio MS contendo ribavirina nas concentrações superiores a 25 mg/L não sobreviveram (Tabela 1). Hendre et al. (1983) relataram a eliminação do SCMV de plantas de cana-de-açúcar infectadas partindo-se de ápices meristemáticos medindo de 0,3 a 1 mm em meio de cultura, sem a adição de ribavirina. Neste experimento foram utilizados meristemas medindo de 5 a 8 mm, com o objetivo de facilitar a regeneração de um maior número de explantes, assegurando-se a eliminação viral com a adição de ribavirina ao meio de cultura.

Existem relatos de sucesso na eliminação de um número expressivo de vírus de plantas com o uso de ribavirina, incluindo o Potato virus X (PVX) e o Potato virus Y (PVY) (Klein & Livingston, 1983) na concentração de 10 mg/L, e na eliminação do Odontoglossum ringspot virus (ORSV) (Toussaint et al., 1993) na concentração de 35 mg/L. Neste experimento o antiviral mostrou-se eficiente na eliminação do SCMV na concentração de 25 mg/L, porém seu efeito tóxico resultou em distúrbios fisiológicos que se refletiram na morte de um expressivo numero de plântulas. Utilizando diferentes métodos de micropropagação in vitro, com e sem a adição de ribavirina, Parmessur & Saumtally (2001) não obtiveram sucesso na eliminação do Sugarcane baciliform virus (SCBV), gênero Badnavirus, família Caulimoviridae, de explantes de cana-de-açúcar. Todavia, conseguiram eliminar o Sugarcane yellow leaf virus, gênero Polerovirus, família Luteoviridae, em meio MS sem ribavirina. Estes resultados poderiam reforçar a hipótese de que a alta concentração hormonal possa interferir no metabolismo das células meristemáticas em cultura, com reflexos na taxa de replicação viral, resultando até na eliminação completa de determinados vírus (Barlass & Skene, 1982).

Embora a possibilidade de eliminação de fitopatógenos de tecidos meristemáticos seja uma vantagem da propagação vegetal in vitro, instabilidades fenotípicas são observadas em várias espécies micropropagadas, inclusive na cana-de-açúcar (Taylor et al., 1995). Neste trabalho, conseguiu-se a eliminação do SCMV adicionando-se ou não ribavirina ao meio MS. Deste modo, a utilização de ribavirina na micropropagação da cana-de-açúcar não se mostra recomendável, considerando o seu efeito tóxico. Também, levando-se em conta a possibilidade do surgimento de variação somaclonal, comum nos procedimentos in vitro, a ribavirina poderia ser um fator extra a contribuir para o surgimento de variações fenotípicas na cana-de-açúcar, inviabilizando o seu uso.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. E.W. Kitajima (NAPA, ESALQ, Universidade de São Paulo), pelo auxílio nos exames de microscopia eletrônica, ao Dr. M.C. Gonçalves (Instituto Biológico de São Paulo) pela cessão do anti-soro para o SrMV, ao Dr. Álvaro Sanguinio (CTC), pelo fornecimento do isolado do SCMV da variedade RB72454 e à Dra. G. Correa (Blausiegel) pelo fornecimento de Ribavirina®.

Recebido 12 Dezembro 2006 - Aceito 15 Junho 2007 - FB 6133

Autor para correspondência: Eliezer R. Souto

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Out 2007
• Data do Fascículo
  Ago 2007

Histórico

• Aceito
  15 Jun 2007
• Recebido
  12 Dez 2006